T型细胞培养双袋组件的制作方法

相关申请的交叉引用

本专利申请根据35u.s.c.§119(e)要求于2014年12月22日提交的，名称为“t-cellculturedoublebagassembly”的美国序列号62/095,124，以及于2015年12月21日提交的us14/976,027的权益，所述申请的内容以引用的方式全文并入本文。

本发明一般涉及细胞培养仪器和细胞培养方法。

背景技术：

细胞培养是细胞通过其在受控条件下生长的复杂过程，所述受控条件一般在其天然环境之外。在实践中，细胞培养指源自多细胞真核生物的细胞，尤其是动物细胞的培养。然而，还存在植物、真菌、昆虫和微生物的培养，所述微生物包括病毒、细菌和原生生物。

细胞在细胞培养箱中在适当的温度和气体混合物(对于哺乳动物细胞通常为37℃、5％co2)生长且维持。培养条件对于每种细胞类型变化很大，并且对于特定细胞类型，条件的变化可导致不同的表型。

各种细胞类型在体外生长，并且类似地，取决于细胞的特定生长需要和生长条件，各种培养基是可获得的。

t细胞或t淋巴细胞是在细胞介导的免疫中发挥关键作用的一类淋巴细胞。它们可通过细胞表面上的t细胞受体(tcr)的存在，区别于其他淋巴细胞(例如b细胞和天然杀伤细胞(nk细胞))。它们被称为t细胞是因为它们在胸腺中成熟。存在各自具有不同的功能的几个t细胞亚群，包括t辅助细胞、细胞毒性t细胞、记忆t细胞、调节性t细胞、天然杀伤t细胞和粘膜相关恒定t细胞。

已经开发了用于培养细胞的许多装置，其可分为三类：1)培养体积通常在1l至20l之间的小规模装置，尽管培养体积小于1l，甚至在10ml或100ml范围内也不例外；2)培养体积在20至2,000l之间的中等规模装置；3)操作体积从2,000直到20,000l的大型生物反应器。一般而言，小规模装置在体积方面限制在几升，因为它们依靠表面氧传递为细胞提供曝气。小规模装置的例子包括多孔组织培养板、旋转瓶、t型瓶、滚瓶和细胞培养袋。

袋形式的商购可得的气体可渗透细胞培养装置目前是用于细胞培养的标准装置形式。细胞培养袋具有一次性使用的优点，这减少了制备和清理时间。另外，细胞培养袋是预灭菌、便宜、易于使用的，并且需要最低限度的贮存和使用空间。

气体可渗透的含氟聚合物细胞培养袋从origenbiomedicalgroup(origenpermalife^tmbags)、baxter(与美国专利号4,829,002、4,937,194、5,935,847、6,297,046b1相关的x-fold^tm)、medtronic(si-culture^tm，美国专利号5,686,304)、biovectra(vectracell^tm)、以及americanfluoroseal(由美国专利号4,847,462和4,945,203涵盖的vuelife^tmculturebagsystem)商购可得。

常规含氟聚合物细胞培养袋的一个问题是进料培养基和细胞在培养室内混合，并且因此所加入的培养基的量受限于容器的体积。在一个例子中，matsumiya等人(美国专利号5,225,346)尝试通过将袋与培养基贮存区室整合来纠正培养基供应的问题。连接培养室和培养基贮存区室，并且当需要新鲜培养基时，它从培养基贮存室传递到培养室。

常规含氟聚合物细胞培养袋的另一个问题是，在细胞培养期间去除具有营养物质含量减少和废物含量增加的培养基也不利地去除所需的细胞。

因此，需要去除和补充进料培养基而不减少细胞量，从而经过不受进料培养基供应限制控制的一段时间有利地浓缩细胞。

技术实现要素：

本发明提供了克服本领域已知的一个或多个缺点的用于细胞培养的仪器和方法。已发现可制备细胞培养袋，所述细胞培养袋包括加框架的多孔内部气体可渗透袋，其允许生长和收获包含在外部气体可渗透袋内的细胞，所述外部气体可渗透袋允许去除和补充进料培养基而不损失细胞。

在一个实施例中，本发明呈现了包括外袋和内袋的袋。外袋包括具有附接至其的第一端口和第二端口的气体可渗透膜，并且内袋包括具有附接至其的第三端口的气体可渗透膜，所述第三端口穿过外袋到内袋。内袋的气体可渗透膜具有增加的孔径，以允许培养基在外袋和内袋之间移动。

在另一个实施例中，外袋的气体可渗透膜包含fep(氟化乙烯-丙烯)、tfe(四氟乙烯)、pfa(全氟烷氧基)、pvf(聚氟乙烯)、pvdf(聚偏二氟乙烯)、ptfe(聚四氟乙烯)、pctfe(聚三氟氯乙烯)、etfe(聚乙烯四氟乙烯)、ectfe(聚乙烯三氟氯乙烯)、ffpm/ffkm(全氟弹性体)、fpm/fkm(三氟氯乙烯偏二氟乙烯)、pfpe(全氟聚醚)、mfa(四氟乙烯和全氟甲基乙烯基醚共聚物)、ctfe/vdf(三氟氯乙烯-偏二氟乙烯共聚物)、tfe/hfp(四氟乙烯-六氟丙烯共聚物)或其混合物。

在另一个实施例中，外袋的第一端口和第二端口包括附接到外袋的管。

在另一个实施例中，内袋的第三端口包括附接到内袋的管。

在另一个实施例中，附接到内袋和外袋的管包含fep(氟化乙烯-丙烯)、tfe(四氟乙烯)、pfa(全氟烷氧基)、pvf(聚氟乙烯)、pvdf(聚偏二氟乙烯)、ptfe(聚四氟乙烯)、pctfe(聚三氟氯乙烯)、etfe(聚乙烯四氟乙烯)、ectfe(聚乙烯三氟氯乙烯)、ffpm/ffkm(全氟弹性体)、fpm/fkm(三氟氯乙烯偏二氟乙烯)、pfpe(全氟聚醚)、mfa(四氟乙烯和全氟甲基乙烯基醚共聚物)、ctfe/vdf(三氟氯乙烯-偏二氟乙烯共聚物)、tfe/hfp(四氟乙烯-六氟丙烯共聚物)或其混合物。

在另一个实施例中，附接到内袋或外袋的管的非粘结端包含针开口。

在另一个实施例中，管通过化学粘结、粘合粘结、热熔粘结、溶剂粘结、激光焊接、表面处理或其组合附接到内袋或外袋。

在另一个实施例中，内袋的气体可渗透膜包含fep(氟化乙烯-丙烯)、tfe(四氟乙烯)、pfa(全氟烷氧基)、pvf(聚氟乙烯)、pvdf(聚偏二氟乙烯)、ptfe(聚四氟乙烯)、pctfe(聚三氟氯乙烯)、etfe(聚乙烯四氟乙烯)、ectfe(聚乙烯三氟氯乙烯)、ffpm/ffkm(全氟弹性体)、fpm/fkm(三氟氯乙烯偏二氟乙烯)、pfpe(全氟聚醚)、mfa(四氟乙烯和全氟甲基乙烯基醚共聚物)、ctfe/vdf(三氟氯乙烯-偏二氟乙烯共聚物)、tfe/hfp(四氟乙烯-六氟丙烯共聚物)或其混合物。

在一个方面，内袋的气体可渗透膜的孔径在直径约1微米至约6微米之间。

在另一个方面，内袋的气体可渗透膜的孔径在直径约1.5微米至约5微米之间。

在另一个方面，内袋的气体可渗透膜的孔径在直径约2微米至约4微米之间。

在另一个方面，内袋的气体可渗透膜的孔径在直径约2.5微米至约3.5微米之间。

在再一个方面，内袋的气体可渗透膜的孔径为直径约3微米。

在另一个方面，内袋的气体可渗透膜的孔隙率为至少20％。

在另一个方面，内袋的气体可渗透膜的孔隙率为至少30％。

在再一个方面，内袋的气体可渗透膜的孔隙率为约50％。

在另一个实施例中，内袋由含氟聚合物框架和卷边固定。

在再一个实施例中，含氟聚合物框架和卷边是ptfe、fep、pfa或惰性含氟聚合物。

在另一个实施例中，本发明公开了培养袋中的细胞的方法，所述方法包括将细胞和培养基加入氧可渗透袋中。袋包括外袋和内袋。外袋包括具有附接至其的第一端口和第二端口的气体可渗透膜。内袋包括具有附接至其的第三端口的气体可渗透膜，所述第三端口穿过外袋到内袋。内袋的气体可渗透膜具有与外袋相比增加的孔径，以允许培养基在外袋和内袋之间移动。

在一个方面，细胞包含结缔组织细胞、骨骼细胞、心脏细胞、上皮细胞、神经细胞、内分泌细胞、免疫细胞、淋巴细胞、黑素细胞、肿瘤细胞或其混合物。

在另一个方面，将培养基加入袋中，其中培养基包含在外袋和内袋内。

在再一个方面，将袋温育。

在另一个实施例中，孔的直径足够小以将细胞保留在内袋内。

在另一个实施例中，培养基可通过第一端口添加并且通过第二端口去除。

在另一个实施例中，细胞可通过第三端口引入或取出。

虽然公开了多个实施例，但根据下文详细描述，本发明的另外其他实施例对于本领域的技术人员将变得显而易见。如显而易见的，本发明能够在各个明显方面进行修改，全都不背离本发明的精神和范围。相应地，详细描述被视为举例说明性的而不是限制性的。

附图说明

图1显示了具有双袋组件的细胞培养仪器的底部平面图。

图2显示了具有双袋组件的细胞培养仪器的侧平面图。

图3显示了具有双袋组件的细胞培养仪器的三维视图。

图4显示了圆框仪器的三维视图。

具体实施方式

在说明书和权利要求书中，术语“包括”和“包含”是开放式术语，并且应被解释为意指“包括但不限于……”。这些术语包括更严格的术语“基本上由……组成”和“由……组成”。

必须指出，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数参考，除非上下文另有明确说明。同样地，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个/一种或多种”和“至少一个/种”在本文中可互换使用。还应指出，术语“包含”、“包括”、“特征在于”和“具有”可互换使用。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文具体提及的所有出版物和专利出于所有目的以引用的方式全文并入本文，包括描述和公开出版物中报道的可与本发明粘结使用的化学品、器械、统计分析和方法。本说明书中引用的所有参考文献均被视为本领域技术水平的指示。本文的任何内容不应被解释为承认本发明由于在先发明而无权早于这种公开内容。

本公开内容允许从细胞培养仪器中去除和补充进料培养基而不减少细胞计数，从而经过不受进料培养基供应限制控制的一段时间有利地浓缩细胞。

所公开的培养袋包括具有至少四个端口的气体可渗透外袋，所述至少四个端口允许进入袋的内部。氧是培养基中细胞生长所必需的，并且二氧化碳是培养基缓冲ph所必需的。7.4-7.6的ph范围对于正常细胞生长是最佳的，并且落在该范围之外的ph，例如高于7.8的ph可抑制正常的细胞生长。因此培养袋对于氧和二氧化碳具有良好的气体渗透性是必要的。

本领域技术人员将认识到，气体可渗透材料应基于各种特性来选择，所述特性包括柔性、确保气密性的热封性、允许显微镜检查细胞生长的良好透明度、不含对细胞毒性的增塑剂(例如邻苯二甲酸二辛酯和邻苯二甲酸二异癸酯)、湿蒸汽透过、对于所需细胞与细胞的相互作用改变的能力、光学透明度、物理强度等等。本文所述的当前实施例没有这种材料。

气体可渗透的含氟聚合物是培养袋的优选选择，因为它们在生物学上、化学上和免疫学上都是惰性的。本发明的外袋的膜包含fep(氟化乙烯-丙烯)、tfe(四氟乙烯)、pfa(全氟烷氧基)、pvf(聚氟乙烯)、pvdf(聚偏二氟乙烯)、ptfe(聚四氟乙烯)、pctfe(聚三氟氯乙烯)、etfe(聚乙烯四氟乙烯)、ectfe(聚乙烯三氟氯乙烯)、ffpm/ffkm(全氟弹性体)、fpm/fkm(三氟氯乙烯偏二氟乙烯)、pfpe(全氟聚醚)、mfa(四氟乙烯和全氟甲基乙烯基醚共聚物)、ctfe/vdf(三氟氯乙烯-偏二氟乙烯共聚物)和tfe/hfp(四氟乙烯-六氟丙烯共聚物)或其混合物。

在优选实施例中，外袋的膜是fep(氟化乙烯-丙烯)。

fep是六氟丙烯和四氟乙烯的共聚物。它具是柔性、极强的耐化学腐蚀性、高透明度和耐日晒的。优选的是fep不含可不利地影响细胞培养的增塑剂、可浸出物或可萃取物。fep具有优异的氧气、二氧化碳气体和氮气传递速率，并且对水是高度不渗透的，允许以最低限度的水分损失温育细胞。对水具有高不渗透性是有利的，因为提供另外的加湿手段可为霉菌和真菌污染引入的常见源。

外袋的膜的厚度可根据应用和所需容器体积而变。外袋的膜厚度可为0.1mm至0.7mm、0.2mm至0.5mm，但优选为0.3mm。外袋体积范围可为100ml至100l、500ml至20l，但优选为1l至5l。

外袋包括两个含氟聚合物片，它们在其边缘处粘结在一起以形成密封区室。粘结方法选自激光焊接、电晕放电、辐射、极热层压或熔融层压、蚀刻、等离子体处理、润湿、粘合剂或其组合。

在优选实施例中，两个fep片的边缘被激光焊接在一起。

图1显示了双袋组件1的底部平面图。外袋10具有位于相对端处的端口30和40，用于从外袋10的内部进料和去除废弃培养基。第三端口50位于进入外袋10的底部，所述外袋10附接到内袋20。端口30、40和50的位置不限于当前配置，并且端口30、40和50可被定位为便于使用或制造。

端口30、40和50各自单独地包括恰当粘结的含氟聚合物管。含氟聚合物管包含fep(氟化乙烯-丙烯)、tfe(四氟乙烯)、pfa(全氟烷氧基)、pvf(聚氟乙烯)、pvdf(聚偏二氟乙烯)、ptfe(聚四氟乙烯)、pctfe(聚三氟氯乙烯)、etfe(聚乙烯四氟乙烯)、ectfe(聚乙烯三氟氯乙烯)、ffpm/ffkm(全氟弹性体)、fpm/fkm(三氟氯乙烯偏二氟乙烯)、pfpe(全氟聚醚)、mfa(四氟乙烯和全氟甲基乙烯基醚共聚物)、ctfe/vdf(三氟氯乙烯-偏二氟乙烯共聚物)和tfe/hfp(四氟乙烯-六氟丙烯共聚物)或其混合物。

端口的总数目不限于当前的实施例。双袋组件可具有至少两个端口。一个端口提供对内袋的入口，并且另一个端口提供对外袋的入口。

在优选实施例中，管是fep(氟化乙烯-丙烯)。

包括端口30、40和50的管被粘结到fep片。端口30、40和50的位置不限于当前配置，并且端口30、40和50可被定位为便于使用或制造。粘结方法选自激光焊接、电晕放电、辐射、极热层压或熔融层压、蚀刻、等离子体处理、润湿、粘合剂或其组合。

在优选实施例中，fep管通过激光焊接粘结到fep外袋。

制造含有气体可渗透内袋20的外袋10。内袋包括细胞培养区室60，并且膜厚度可根据应用而变。内袋20含有孔直径在直径约1微米至约6微米之间，优选在直径约1.5微米至约5微米之间，更优选在直径约2微米至约4微米之间，更优选在直径约2.5微米至约3.5微米之间，且最优选为直径约3微米的孔。膜内的孔径允许培养基在内袋和外袋之间移动，但防止位于内袋内的细胞进入外袋区室。

细胞培养区室60的孔径是多孔材料内的孔直径的量度。给定材料中的孔径通常分级为极细、细、中等、粗糙和极粗。

可基于所需的细胞类型培养来选择孔径。例如，可选择1微米至3微米的内部膜孔径用于平均直径为5微米的t细胞。

本公开内容的内袋20的膜包含fep(氟化乙烯-丙烯)、tfe(四氟乙烯)、pfa(全氟烷氧基)、pvf(聚氟乙烯)、pvdf(聚偏二氟乙烯)、ptfe(聚四氟乙烯)、pctfe(聚三氟氯乙烯)、etfe(聚乙烯四氟乙烯)、ectfe(聚乙烯三氟氯乙烯)、ffpm/ffkm(全氟弹性体)、fpm/fkm(三氟氯乙烯偏二氟乙烯)、pfpe(全氟聚醚)、mfa(四氟乙烯和全氟甲基乙烯基醚共聚物)、ctfe/vdf(三氟氯乙烯-偏二氟乙烯共聚物)和tfe/hfp(四氟乙烯-六氟丙烯共聚物)或其混合物。

在优选实施例中，内袋的膜是ptfe(聚四氟乙烯)材料，即，来自saint-gobain的zitex以多种孔隙率和厚度可获得。

平均孔体积或孔隙率是材料的孔密度的量度，并且是孔体积相对于总体积的分数，通常指示为0至100％之间的百分比。可通过采用几种孔隙率测量法测量孔隙率。这些方法包括直接、光学、计算机断层摄影、渗吸、水蒸发、水银侵入、气体膨胀、热孔隙率测量法和冷孔隙率测量法。

在当前实施例中，内袋20的平均孔体积在约20％至约55％之间，更优选为30％至约50％，且最优选在约40％至约45％之间。

内袋20包括两个含氟聚合物片，它们在其边缘处粘结在一起，以形成经密封的细胞培养区室60。

在优选实施例中，两个ptfe片的边缘通过框架和卷边粘结在一起。挤出圆形卷边以将框架70固定到内袋20。

多孔内袋20由含氟聚合物框架70和卷边80支撑。含氟聚合物框架和卷边各自单独地可包含fep(氟化乙烯-丙烯)、tfe(四氟乙烯)、pfa(全氟烷氧基)、pvf(聚氟乙烯)、pvdf(聚偏二氟乙烯)、ptfe(聚四氟乙烯)、pctfe(聚三氟氯乙烯)、etfe(聚乙烯四氟乙烯)、ectfe(聚乙烯三氟氯乙烯)、ffpm/ffkm(全氟弹性体)、fpm/fkm(三氟氯乙烯偏二氟乙烯)、pfpe(全氟聚醚)、mfa(四氟乙烯和全氟甲基乙烯基醚共聚物)、ctfe/vdf(三氟氯乙烯-偏二氟乙烯共聚物)和tfe/hfp(四氟乙烯-六氟丙烯共聚物)或其混合物。

在优选实施例中，含氟聚合物框架70和卷边80各自单独为ptfe(聚四氟乙烯)、fep(氟化乙烯-丙烯)或pfa(全氟烷氧基)。

图4描绘了其中方形框架70可为圆形框架120的另一个实施例。内袋20可通过在脊140处的卷边附接到圆形框架120。

在另一个实施例中，具有框架120的内袋的内部可通过集成端口130进入。

第三端口50包括穿过外袋并且附接到内袋的含氟聚合物管。悬挂内袋、框架和卷边的第三端口包括将含氟聚合物管附接到内袋的含氟聚合物弯管90。

端口30、40和50具有允许进入袋的内部的可密封开口。

图2显示了双袋组件的侧平面图。端口30和40的管在其中fep片粘结在一起的接缝100和110处进入外袋10。弯管90可成角度为0到90度，以将内袋20定位在外袋10内部。第三端口50用于添加和取出细胞。

内袋20在外袋10内部的定位允许内袋20与包含在外袋10内的培养基接触。

在优选实施例中，将内袋20浸没在外袋10的培养基中，以允许培养基渗入和移出内袋20的细胞培养区室60。

第三端口50的管和弯管90各自独立地可包含fep(氟化乙烯-丙烯)、tfe(四氟乙烯)、pfa(全氟烷氧基)、pvf(聚氟乙烯)、pvdf(聚偏二氟乙烯)、ptfe(聚四氟乙烯)、pctfe(聚三氟氯乙烯)、etfe(聚乙烯四氟乙烯)、ectfe(聚乙烯三氟氯乙烯)、ffpm/ffkm(全氟弹性体)、fpm/fkm(三氟氯乙烯偏二氟乙烯)、pfpe(全氟聚醚)、mfa(四氟乙烯和全氟甲基乙烯基醚共聚物)、ctfe/vdf(三氟氯乙烯-偏二氟乙烯共聚物)和tfe/hfp(四氟乙烯-六氟丙烯共聚物)或其混合物。

在优选实施例中，第三端口50的含氟聚合物管是fep(氟化乙烯-丙烯)，并且第三端口50的弯管90是pfa(全氟烷氧基聚合物)。

第三端口50的弯管90在一端处粘结到含氟聚合物管，并且在第二端处粘结到内袋，因此弯管90将含氟聚合物管和内袋20在端口50中连接。

粘结方法可包括激光焊接、电晕放电、辐射、极热层压或熔融层压、蚀刻、等离子体处理、润湿、粘合剂或其组合。

在优选实施例中，pfa弯管90被激光焊接到fep内袋20和端口50的fep管。此外，fep管被激光焊接到fep外袋10，在其中它离开fep外袋10。

内袋体积可小于外袋体积，并且范围可为50ml至50l、250ml至10l，但优选为500ml至2l。

合适的生长培养基包括用于所选择的培养细胞的适当培养基。

合适的细胞包括例如结缔组织细胞、骨骼细胞、心脏细胞、上皮细胞、神经细胞、内分泌细胞、免疫细胞、淋巴细胞、黑素细胞、肿瘤细胞或其混合物。

在一个实施例中，在第一段落(1)中，本发明提供了包括外袋和内袋的袋，其中所述外袋包括具有附接至其的第一端口和第二端口的气体可渗透膜；并且内袋包括具有附接至其的第三端口的气体可渗透膜，所述第三端口穿过所述外袋到所述内袋，进一步的条件是内袋的气体可渗透膜具有增加的孔径。

2.根据段落1的袋，其中所述外袋的气体可渗透膜为fep(氟化乙烯-丙烯)、tfe(四氟乙烯)、pfa(全氟烷氧基)、pvf(聚氟乙烯)、pvdf(聚偏二氟乙烯)、ptfe(聚四氟乙烯)、pctfe(聚三氟氯乙烯)、etfe(聚乙烯四氟乙烯)、ectfe(聚乙烯三氟氯乙烯)、ffpm/ffkm(全氟弹性体)、fpm/fkm(三氟氯乙烯偏二氟乙烯)、pfpe(全氟聚醚)、mfa(四氟乙烯和全氟甲基乙烯基醚共聚物)、ctfe/vdf(三氟氯乙烯-偏二氟乙烯共聚物)和tfe/hfp(四氟乙烯-六氟丙烯共聚物)或其混合物。

3.根据段落1的袋，其中所述外袋的所述第一端口和第二端口包括附接到所述外袋的管。

4.根据段落1的袋，其中所述内袋的所述第三端口包括附接到所述内袋的管。

5.根据段落3或4的袋，其中所述管通过化学粘结、粘合粘结、热熔粘结、溶剂粘结、激光焊接、表面处理或其组合附接到所述袋。

6.根据段落3或4的袋，其中所述管的所述非粘结端提供进入所述袋的内部的可密封入口。

7.根据段落1的袋，其中所述内袋的气体可渗透膜为fep(氟化乙烯-丙烯)、tfe(四氟乙烯)、pfa(全氟烷氧基)、pvf(聚氟乙烯)、pvdf(聚偏二氟乙烯)、ptfe(聚四氟乙烯)、pctfe(聚三氟氯乙烯)、etfe(聚乙烯四氟乙烯)、ectfe(聚乙烯三氟氯乙烯)、ffpm/ffkm(全氟弹性体)、fpm/fkm(三氟氯乙烯偏二氟乙烯)、pfpe(全氟聚醚)、mfa(四氟乙烯和全氟甲基乙烯基醚共聚物)、ctfe/vdf(三氟氯乙烯-偏二氟乙烯共聚物)和tfe/hfp(四氟乙烯-六氟丙烯共聚物)或其混合物。

8.根据段落7的袋，其中所述内袋的含氟聚合物膜的孔径在直径约1微米至约6微米之间。

9.根据段落7的袋，其中所述内袋的含氟聚合物膜的孔径在直径约1.5微米至约5微米之间。

10.根据段落7的袋，其中所述内袋的含氟聚合物膜的孔径在直径约2微米至约4微米之间。

11.根据段落7的袋，其中所述内袋的含氟聚合物膜的孔径在直径约2.5微米至约3.5微米之间。

12.根据段落7的袋，其中所述内袋的含氟聚合物膜的孔径为直径约3微米。

13.根据段落7至12的容器，其中所述平均孔体积在约20％至约55％之间。

14.根据段落7至13的容器，其中所述平均孔体积在约30％至约50％之间。

15.根据段落7至14的容器，其中所述平均孔体积在约40％至约45％之间。

16.根据段落1的袋，其中所述内袋由含氟聚合物框架和卷边固定。

17.根据段落10的袋，其中所述含氟聚合物框架和卷边各自分别为ptfe、fep或pfa。

18.一种在袋中培养细胞的方法，所述方法包括以下步骤：a)将细胞加入所述袋中，其中所述袋包括外袋和内袋，其中所述外袋包括具有附接至其的第一端口和第二端口的气体可渗透膜；并且所述内袋包括具有附接至其的第三端口的气体可渗透膜，所述第三端口穿过所述外袋到所述内袋，进一步的条件是所述内袋的含氟聚合物膜是多孔的，其中所述细胞包含在所述内袋中。

19.根据段落18的方法，其中所述细胞包含结缔组织细胞、骨骼细胞、心脏细胞、上皮细胞、神经细胞、内分泌细胞、免疫细胞、淋巴细胞、黑素细胞、肿瘤细胞或其混合物。

20.根据段落18的方法，所述方法还包括将培养基加入所述袋中的步骤，其中所述培养基包含在所述外袋和所述内袋内。

21.根据段落20的方法，所述方法还包括温育所述袋的步骤。

22.根据段落18的方法，其中所述孔的直径足以将所述细胞保留在所述内袋内。

23.根据段落20的方法，其中所述培养基可通过所述第一端口添加并且通过所述第二端口去除。

24.根据段落19的方法，其中所述细胞可通过所述第三端口引入或取出。

虽然已参考优选实施例描述了本发明，但本领域技术人员将认识到，可在形式和细节上作出改变，而不背离本发明的精神和范围。在说明书自始至终引用的所有参考文献，包括在背景中的那些全文并入本文。本领域技术人员使用不超过例行实验将认识到，或能够确定与本文具体描述的本发明的特定实施例的许多等价物。这样的等价物预期包括在所附权利要求的范围内。