使用摇动平台生物反应器的多能干细胞扩增和传代的制作方法

背景

本公开内容一般涉及使用摇动平台扩增细胞和/或细胞聚集。

对于在多能干细胞建库(如，对于诱导的多能干细胞)、细胞(如，ge的cytivatm心肌细胞)的商业化生产和临床试验的细胞扩增中的应用，对大规模多能干细胞培养的需要正凸显出来。无饲养层多能干细胞培养的发展使得在烧瓶中、在生物反应器中的微载体(直径150-250微米)或大载体(直径~6mm)上的大规模细胞扩增成为可能。采用悬浮培养避免了一些挑战，这些挑战在传统微载体上培养多能细胞时发生，包括细胞自载体的低效接种和释放，在收获期间微载体和细胞的物理分离，和可导致细胞的表型改变的细胞-载体团块的形成。通常，灌注被用于生物反应器中的悬浮培养。

然而在灌注/悬浮培养中的一个挑战是如何在生物反应器中保留细胞。现有技术提供一些基本的分离技术--1)过滤，2)重力沉降，和3)离心分离。过滤方法需要一些装置，以在操作需要的数周内保持滤器避免堵塞。重力沉降的问题是不同细胞的沉降特征各不相同，难以放大到工业系统，且难以保持无菌。类似地，离心分离被常规用于开放的细胞培养，但由于关于无菌的担心，已发现在全封闭系统细胞培养中的应用有限。

在本领域中对在培养细胞(包括多能干细胞和/或分化的人细胞)的过程中减少人干预和交叉污染的技术存在需要。

发明简述

本文描述用于培养细胞，包括多能干细胞和/或分化的人细胞的改进方法。

本文提供用于在封闭系统中扩增细胞聚集体的方法，其包括

在摇动平台上的细胞培养容器；

在容器中的细胞聚集体的自动灌注；和

在灌注期间的细胞聚集体的无膜过滤。

在另一方面，本文提供用于在封闭系统中扩增细胞聚集体的方法，其包括

在摇动平台生物反应器上的细胞培养容器；

在容器中的聚集体形成；

在容器中的细胞聚集体的自动灌注；

在灌注期间的细胞聚集体的无膜过滤；和

在封闭系统中的聚集体收获和传代。

本文还提供一种传代细胞聚集体的方法，其中细胞聚集体的尺寸用与封闭系统中的生物反应器连接的限制器网格减少。

本文还提供使用在此描述的方法，用于扩增细胞聚集体的封闭系统。

附图

当参照附图阅读以下详细的描述时，本发明的这些和其它特征、方面和优点将变得更易理解，其中整个附图中的同样的符号代表同样的部件，其中：

图1显示了大于10次传代的扩增适应。在细胞培养容器(如，xuricellbag生物反应器)中培养之前，在低附着6孔板和烧瓶上，或在摇动条件下在vuelife袋中，将细胞自matrigeltm至悬浮聚集体进行适应。

图2显示用于多能干细胞培养的示例性系统，即xuriw25系统的示意图。

图3显示用于控制软件的用户界面的样例图像。所示的样例图像并不意味着代表和/或另外限制在此描述的培养条件。

图4显示xuricellbag生物反应器。

图5显示在xuriw25系统中的封闭系统细胞培养过程。所有的步骤在xuriw25系统上，在2lcellbag生物反应器中，使用集成泵、软件控制和负载传感器执行。

图6显示来自xuriw25系统中扩增的结果。用灌注培养观察到较高的扩增率。

图7显示来自xuriw25系统中扩增的结果。

图8顶排显示在6孔板中5次传代和作为在xuricellbags中的悬浮聚集体3次传代扩增的ct2人胚胎干细胞聚集体的分化潜能，证实多能性的维持。图8a-f和实施例2显示通过流式细胞术，对在6孔板中5次连续传代和在cellbags中3次连续传代后的ct2人胚胎干细胞聚集体的多能性标记的分析。还显示在6孔板中5次传代和作为在xuricellbags中的悬浮聚集体3次传代扩增的ct2人胚胎干细胞聚集体的核型。

图9显示使用在此描述的方法，在xuricellbag生物反应器中的聚集体形态学的实例。

图10显示在4天中的培养基消耗和细胞得率。

图11显示用灌注cellbag的封闭系统传代。任选的：通过灌注滤器除去大部分培养基。以一定的角度挂袋以允许聚集体重力沉降在角落。如果没有汲取管存在，则压缩袋。使用蠕动泵脱去大部分培养基。如果没有汲取管存在，向后倾斜袋移除大部分培养基(1)。管与装有pbs的袋结合以洗涤细胞(2)。重复重力沉降并使用以上过程除去大部分pbs(2)。管与含有预热的accutase的袋结合并泵入cellbag中(3)。夹出团粒以使聚集体再悬浮于accutasetm中，培养5-8分钟。使accutasedtm细胞通过毛细管或改良的注射器以分散(4)。加入培养基并收获分离的细胞，或传代至下一个袋/培养系统(1或4)。

图12显示用非-灌注cellbag的封闭系统培养基交换和传代。对于没有汲取管的50-80%培养基交换：以60^o角挂袋以允许聚集体重力沉降2-5分钟(取决于聚集体尺寸)。对于较小的培养体积，在聚集体沉降前用户需要压缩袋。使用蠕动泵将用过的培养基抽入废物袋。夹住袋子底部的接缝以再悬浮沉降的聚集体，然后又开始摇动。管与含有温热培养基的袋结合到cellbag上，并使用蠕动泵加入培养基同时摇动。使用汲取管，可除去较大的体积，而袋紧缩是不必要的。

图13显示粘附细胞对悬浮细胞培养的适应。在此描述的方法提供一种可再生的过程，经3-4天倍数-扩增范围在3至14-倍之间，且生存能力>98%。

图14显示样本放大至较大的烧瓶/容器。放大显示从2ml至10ml(对于t25)和30ml(对于t75)。将烧瓶置于震摇器上以模拟wave生物反应器运动。聚集体形成和扩增的效率随着规模的增加而减少。已观察到在各种摇动速度/摇动角的液体路径的长度影响扩增率。因此，摇动角和摇动速度随着规模的增加而调整。

图15显示来自6孔板或t形瓶中的悬浮聚集体多能干细胞的扩增和传代的数据。

图16显示以4x10^5细胞/ml接种的ct2人胚胎干细胞聚集体在酶促传代或用限制器机械传代后的扩增率比较。(1)用accutase®+rock抑制剂传代的ct-2；(2)用方格网+rock抑制剂传代的ct-2；(3)用六角网格+rock抑制剂传代的ct-2；(4)用方格网而无rock抑制剂传代的ct-2；(5)用六角网格而无rock抑制剂传代的ct-2。

图17显示以1.5x10^6细胞/ml接种的ct2人胚胎干细胞聚集体在酶促传代或用限制器机械传代后的扩增率比较。(1)用accutase®+rock抑制剂传代的ct-2；(2)用方格网+rock抑制剂传代的ct-2；(3)用六角网格+rock抑制剂传代的ct-2；(4)用方格网但无rock抑制剂传代的ct-2；(5)用六角网格但无rock抑制剂传代的ct-2。

图18显示在accutasetm分离后，在a)第1天，b)第2天，c)第3天，和d)第4天的ct2人胚胎干细胞聚集体形态学。

图19显示在用方格网限制器限制后，在a)第1天，b)第2天，和c)第4天的ct2人胚胎干细胞聚集体形态学。

图20显示用六角网格限制器限制后，在a)第1天，b)第2天，和c)第4天的ct2人胚胎干细胞聚集体形态学。

图21显示当在不含y27632rock抑制剂的培养基中培养时，用六角网格限制器限制后，在a)第1天，b)第2天，和c)第4天的ct2人胚胎干细胞聚集体形态学。

图22显示当在不含y27632rock抑制剂的培养基中培养时，用方格网限制器限制后，在a)第1天，b)第2天，和c)第4天的ct2人胚胎干细胞聚集体形态学。

图23显示在非-灌注袋中用于重力沉降和培养基交换的管道系统装配的图示，其中用过的培养基正从cellbag除去。

图24显示在非-灌注袋中用于重力沉降和培养基交换的管道系统装配的图示，其中新鲜培养基正被加入到cellbag中。

图25显示附接于非-灌注cellbag的用于重力沉降和培养基交换的管道系统装配的图。

图26为ct2人胚胎干细胞聚集体从无滤器的非-灌注cellbag至含有浮膜的灌注cellbag的连续传代。ct-2聚集体的连续传代使用accutase®首先在1l非-灌注cellbag中以250ml体积，然后在2l灌注cellbag中以1l体积进行。

图27显示在ct2人胚胎干细胞聚集体在不同的体积和类型的cellbag中连续传代期间的扩增。ct-2聚集体的连续传代使用accutase®在1l非-灌注cellbag中以150ml体积至1l非-灌注cellbag以150ml体积至1l非-灌注cellbag以400ml体积至2l灌注cellbag以1l体积进行。

图28显示在cellbag中使用accutasetm以酶促分离聚集体和自cellbag中的分离细胞形成聚集体的连续传代期间，ct2人胚胎干细胞聚集体形态学的图。a)第1天，连续传代2，b)第4天，连续传代2，c)第1天连续传代3，d)第4天连续传代3。

图29显示具有100um-300um厚度的10mm限制器网格结构的图。

图30显示在各壁之间具有100um间隔和30um壁厚度的方格网限制器的图。

图31显示在各壁之间具有100um间隔和30um壁厚度的六角网格限制器的图。

图32显示聚集体通过限制器的封闭系统过程的方法的图。用泵和在线锥形袋驱动的循环回路悬浮和分配聚集体。导向限制器的管道连接于主循环回路，而细胞聚集体的部分通过以较低的速度操作的第二个泵被传递至限制器。

图33显示ct2人胚胎干细胞的限制聚集体的形态学的图。

图34显示使用镍合金六边形限制器网格的ct2人胚胎干细胞的连续传代的结果。ct-2聚集体的连续传代使用镍合金六边形限制器在1lcellbag中，以用2-5umrock抑制剂接种的250-500ml体积进行。

图35显示使用镍合金正方形限制器网格的ct2人胚胎干细胞的连续传代的结果。ct-2聚集体的连续传代使用镍合金方格网限制器在1lcellbag中，以用2-5umrock抑制剂接种的250ml体积进行。

图36显示使用硅六边形限制器网格的ct2人胚胎干细胞连续传代的结果。ct-2聚集体的连续传代使用硅六边形限制器在1lcellbag中，以用2-5umrock抑制剂接种的250ml体积进行。

图37显示使用硅六边形限制器网格和维持在缺乏y27632rock抑制剂的培养基中的循环袋，ct2人胚胎干细胞的封闭系统连续传代的结果。ct-2聚集体的连续传代使用硅六边形限制器在cellbag中，以250ml-300ml体积(无rock抑制剂)进行。

图38显示在cellbag中，使用硅六边形限制器和循环袋的封闭系统连续传代期间，ct2人胚胎干细胞聚集体形态学的图。a)第1天，连续传代1，b)第4天，连续传代1，c)第1天连续传代2，d)第5天连续传代2。

详细描述

"a"或"an"在此意指一个或超过一个；至少一个。当在此使用复数形式时，它一般包括单数。

如本文所用的“灌注”指通过连续喂给细胞新鲜培养基并除去用过的培养基来保持培养细胞存活，同时保持细胞在培养中的过程。

"聚集体"指细胞的连接，其中所述连接由细胞-细胞相互作用，而不是粘附于基质所引起。在一个聚集体中，两个或更多个细胞通过彼此生物附着彼此连接。这可以是通过表面蛋白，例如细胞外基质蛋白。在一个实施方案中，细胞最初可在基质上生长，在那里一些细胞连接(附着于)基质，但进一步生长形成细胞-细胞连接(聚集)，其不取决于进一步生长的细胞与基质的连接(粘附)。在另一个实施方案中，细胞在悬液中自发地连接，形成独立于与表面的任何粘附的细胞-细胞连接。细胞饲养层也被认为是基质。细胞与饲养层的如此连接也是粘附培养的形式(不是聚集体)，因为细胞不是彼此连接，而是连接饲养层中的细胞。

"扩增"指细胞伴有或不伴有分化的增殖并可包括没有传代、一次传代或多于一次传代和/或连续传代。

"干细胞"意指可进行自我更新(即，具有相同的分化潜能的后代)并且还产生在分化潜能方面被更加限制的后代细胞的细胞。在本公开内容的上下文中，干细胞还涵盖例如，通过核转移，通过与更原始的干细胞融合，通过引入特定转录因子，或通过在特定条件下培养去分化的更加分化的细胞。“多能干细胞”可潜在地产生身体需要修复自身的任何细胞或组织。多能干细胞也能够自我更新，并可永久地创建自身的更多拷贝。多能干细胞包括诱导的多能干细胞(ipscs)和胚胎干细胞(escs)。

“培养容器”包括一次性和非-一次性塑料制品、袋和/或容器和/或生物反应器。该术语包括单次使用的塑料制品、袋和/或容器和/或生物反应器和多次使用的塑料制品、袋和/或容器和/或生物反应器。

“封闭系统”指已经预消毒，同时密闭和/或密封并保留完整性和/或无菌的培养容器和辅助组件。可使用容器和组件而不破坏系统的完整性，允许流体输入和/或输出，同时维持无菌，并可连接到其它封闭系统而不失去完整性。封闭系统生物反应器和/或容器指一个系统，其中细胞、细胞培养基、化学物品和试剂被无菌添加、去除和/或操作，而不破坏系统的完整性(如，通过打开管帽或揭开细胞培养板或皿的盖)。在封闭系统中单次使用或多次使用的袋和/或容器和/或生物反应器例如通过在容器或生物反应器的位点处焊接的无菌管被加入到封闭系统上或封闭系统中。

"受试者"是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括，但不限于人、农场动物、运动动物，和宠物。需要用本发明的方法治疗的受试者包括罹患由于物理或疾病-相关的损伤所致的功能损失的那些受试者。

术语"治疗有效量"指在哺乳动物中产生任何治疗反应所确定的量。例如，有效量的治疗细胞或细胞-相关药物可延长患者的生存能力。或者，所述治疗可以是预防性的并防止和/或抑制明显的临床症状。在如本文所用的术语的意思内的治疗有效的治疗包括改善受试者的生活质量的治疗，即使它们不改善疾病后果本身。这样的治疗有效量由本领域普通技术人员通过对受试者群体的常规应用，例如在临床和临床前试验中确定。因此，"治疗"意指递送这样一种量。

"治疗(treat,treating或treatment)"在涉及本发明时被广泛使用，并且每个这样的术语特别涵盖改善、抑制或治愈缺陷、功能障碍、疾病或其它有害过程，包括干扰疗法和/或自疗法产生的那些。

大规模多能干细胞培养对多能干细胞建库(如，对于诱导的多能干细胞)、细胞(如，ge的cytivatm心肌细胞)的商业化生产和/或用于临床试验的细胞扩增是需要的。多能干细胞可以是诱导的多能细胞(ips细胞)、源自胚胎的“真”胚胎干细胞(es细胞)、通过体细胞核转移制得的胚胎干细胞(ntes细胞)，或来自未受精卵的胚胎干细胞(单性生殖胚胎干细胞或pes细胞)。在烧瓶中的大规模无细胞饲养层胚胎干细胞扩增是劳动密集型的，空间禁止的和分离群体可显示为表型漂移。因此，本领域已尝试开发用于大规模多能干细胞培养的备选方法；例如，celltack®(corning)、cellfactory(nunc®)和生物反应器(微载体或悬浮培养)。

在摇动平台中的胚胎体(ebs)的分化已得到证明。correiaet.al.stemcellrevandrep(2014)10:786–801。然而，ebs的三维结构提出了定向分化和/或扩增的挑战。例如，通常ebs的外部包含由紧密连接的上皮-样细胞和稠密的细胞外基质组成的外“壳”。这样的结构特征，结合eb尺寸，创建成形素、代谢物和营养素的梯度，从而减少ebs的定向扩增的有效性并导致分化的细胞群体的异质性增加和效率下降。多能成年祖细胞聚集体(mapcs)在旋转烧瓶中的扩增已得到证明(subramanianetal.,美国专利号8,609,406)。然而，subramanian等描述的方法包括步骤例如酶消化和离心分离。最近，在叶轮搅拌釜生物反应器系统中的多能干细胞的悬浮聚集体培养已得到证明(chen,vcet.al,stemcellres.2012may;8(3):388-402)，其排除了对生物反应器培养中的任何基质或载体的需要。在用于从悬浮培养传代细胞的chen方法中，聚集体经离心分离收获。相比之下，本文提供的方法在使用摇动平台的封闭系统中，允许多能干细胞和/或多能干细胞聚集体的封闭系统扩增(包括接种、灌注和收获)，其在目前的工作之前尚未得到证实。此外，在此描述的方法也允许多能干细胞在封闭系统中的悬浮和/或非-粘附培养，而不使用膜滤器和/或离心分离和/或酶消化，这允许维持封闭系统中的无菌，降低成本(如，设置离心机)，并且还减少人干预，这有助于减少交叉污染。也涵盖在本文提出的实施方案范围内的是本发明方法与细胞或细胞聚集体的另外的传代组合的应用，所述另外的传代可包括膜滤器和/或离心分离等的使用并可包括使用酶消化在细胞或细胞聚集体的另外的传代中分离聚集体。

因此，本文描述了在例如，xuritmw25细胞扩增系统(在2013年发行的下一代wavetm生物反应器系统)和在例如，legacywave生物反应器2/10系统中细胞聚集体扩增，包括人多能干细胞扩增的方法。平台的摇动运动引起培养流体的波动，提供连续的混合和通气，导致细胞生长的稳健环境。该方法利用不同尺寸的培养容器(如单次使用一次性cellbags，不需要清洁或灭菌)，提供易于操作并避免交叉污染。cellbags通常可以1、2、10、20和50l尺寸获得用于可扩展的细胞培养。任选地，其它较大或较小的体积的cellbags和/或容器可用于在此描述的方法中。任选的传感器可用于溶解氧和ph的连续监测，伴有实时控制和数据存储。平台软件提供在封闭系统中执行连续或间歇的灌注/培养基交换的能力。

通常，在灌注期间，有不同的方法保持细胞培养，同时除去用过的培养基。一个方法是通过使用细胞结合的毛细管纤维或膜，保持细胞在生物反应器中。另一种方法是不结合或粘附细胞，而是利用“浮萍(lilypad)”漂浮滤器，其保持细胞在生物反应器中，同时使得培养基被除去。另一种方法是利用离心分离机分离细胞并使它们返回生物反应器。还有的另一种方法利用物理方法例如声学以在细胞培养容器或相关管道系统中捕获细胞，同时除去用过的培养基。

相比之下，在此描述的方法依赖于细胞聚集体的重力沉降，其允许除去用过的培养基，而不使用通常被用来保持细胞在生物反应器中的过滤系统，同时伴随地允许培养基被除去。这种方法的一个优点是失去单细胞并维持聚集体，从而增加培养的整体质量和生存能力。

通过连续地除去用过的培养基并用新培养基替代之，维持用于最佳生长条件的营养素水平并除去细胞废产物以避免毒性。当灌注在封闭系统中，使用在此描述的方法进行时，污染的可能性减少。有利地，在此描述的封闭系统和细胞培养方法利用细胞聚集体的重力-沉降，从而允许在cellbags中的无膜过滤，这使得由于细胞粘附于过滤膜导致的损失和/或由于在过滤过程中的剪切力导致的细胞损害减少。

在此描述的方法优选地用于封闭系统以最大限度地减少培养污染和细胞交叉-污染的风险并使得达到具有置信水平的高生存能力和高细胞密度。为容易使用和可靠性而设计了在此描述的方法。

在本发明方法中，培养基和细胞仅接触预灭菌的室，该室定位在特定摇动平台上。平台的摇动运动引起培养流体的波动，从而提供连续的混合和氧传递，导致细胞生长的稳健环境。系统无需清洁或灭菌，提供了容易操作并避免交叉-污染。

在此提供新的方案，以使用摇动运动，使来自在matrigeltm的无饲养层条件的细胞适应于悬浮聚集体。通常地，搅拌釜反应器或旋转烧瓶已被用来完成适应过程。在此描述的方法允许仅使用摇动运动(从6孔板，至烧瓶，至vuelife袋，至xuricellbag)维持细胞。本文提供证实多能干细胞扩增作为在摇动运动系统中的悬浮聚集体(具有连续传代和至多279-倍扩增)的方法。与已报道使用旋转烧瓶或搅拌釜反应器的扩增比较，在此描述的在灌注cellbags中的倍数扩增是相等的或更好。本文提供了实施例，其显示在摇动平台上的培养容器与限制器组合用于传代对于多能干细胞在统一的封闭系统中的扩增和连续传代是有利的，特别是在减少时间、试剂和工作方面。本发明的限制器装配可提供与其它基于非-摇动的生物反应器系统类似的优点。

本文也提供连接于培养容器(如，xuricellbag)的管道系统的特殊装配，其与计算机控制的蠕动泵相互作用以驱动自动的培养基交换。在一个实施方案中，管道系统被成形为像一个t字母，具有较低的垂直段的管道、分支点，和两个另外长度的在分支点连接的管道。另外的管道被放置在由软件控制的蠕动泵上。采用慢的收获速度以抽出培养基。管道系统的垂直性质允许聚集体以超过除去的培养基的流速的速率重力沉降。净效应是聚集体在培养基除去步骤期间仍以最适细胞培养条件保留在容器(如，xuricellbag)中。培养基除去可以是连续的，例如，持续至多8小时，至多4小时等等，但培养基除去可执行更短或更长得多的时长。培养基除去步骤后，将新鲜培养基经数秒至几分钟或经任何合适的时长快速加入到容器(如，cellbag)中。培养基除去/快速的培养基加入的循环重复所需的细胞培养长度。在备选的情况下，灌注可以是间歇的，并且这样的实施方案也期望在本文提出的实施方案的范围内。

本文描述的自动灌注设计在本质上是低成本的，与培养容器、包括当前的xuri系统和cellbags是完全适配的，可被调节为与任何其它培养容器完全适配，且不需要任何滤器，所述滤器将增加成本和增加污染的风险和降低性能。进一步地，本文描述的自动灌注不包括将增加复杂性、成本和失败风险的活动部件或电子器件。

本文提供用于扩增封闭系统中的细胞聚集体的方法，其包括

在摇动平台生物反应器上的细胞培养容器；

在容器中的细胞聚集体的自动灌注；和

在灌注期间的细胞聚集体的无膜过滤。

本文也提供用于扩增封闭系统中的细胞聚集体的方法，其包括

在摇动平台生物反应器上的细胞培养容器；

在容器中的聚集体形成；

在容器中的细胞聚集体的自动灌注；

在灌注期间的细胞聚集体的无膜过滤；和

在封闭系统中的聚集体收获和传代。

在一些实施方案中，扩增的细胞聚集体具有植物、动物、昆虫或微生物来源。在一些这样的实施方案中，扩增的细胞聚集体包含多能干细胞或分化的人细胞。

在一些情况下，在灌注期间，在滤膜的不存在下，通过细胞聚集体的重力沉降使细胞聚集体保留在袋中。

此外，所述自动灌注在封闭系统中进行而无人的干预，从而减少污染的可能性并允许在扩增期间维持无菌。

在一些实施方案中，以上描述的方法还包括细胞聚集体和/或其通过进行连续传代的后代的一次或多次另外的扩增。在一些这样的实施方案中，细胞聚集体和/或其后代的一次或多次另外的扩增，通过传代到具有膜滤器的第二个容器中进行。

在一些实施方案中，以上描述的方法包括细胞聚集体和/或其后代的一次或多次另外的扩增，其中一次或多次另外的传代在相同的容器中执行。在其它实施方案中，以上描述的方法包括细胞聚集体和/或其后代的一次或多次另外的扩增，其中一次或多次另外的传代在第二个容器中，在培养容器不存在膜滤器的情况下执行。在其它情况下，以上描述的方法包括细胞聚集体和/或其后代的一次或多次另外的扩增，其中一次或多次另外的传代在具有膜滤器(如，浮膜滤器)的第二个容器中执行。

在这样的实施方案中，另外的扩增和/或传代可以任何次序进行。举例说明，初始传代可在无膜条件下，在培养容器中进行，接着是在具有膜滤器的培养容器中进行一次或多次另外的扩增。作为可供选择的实例，一次或多次初始扩增和/或传代可在包含膜滤器的培养容器中进行，接着是在无膜过滤条件下的随后扩增和/或传代。因此，包括膜-过滤或无膜过滤的扩增和/或传代的任何顺序包括在本文描述的实施方案的范围内，其中所述顺序包括在本发明的无膜条件下的至少一次扩增。

在一些实施方案中，细胞聚集体的连续传代能够通过在封闭系统中，使用限制器网格的无酶传代进行。在一些这样的实施方案中，细胞聚集体用具有分开距离约20-约500微米的刀片的限制器网格分离。在一些其它实施方案中，细胞聚集体用具有分开距离约100微米的刀片的限制器网格分离。在一些这样的实施方案中，细胞聚集体用符合管道系统的限制器网格和混合细胞聚集体的装置分离。换言之，在一些实施方案中，细胞聚集体在例如，在图32中所示的圆锥形袋中混合，然后用限制器分离，混合袋通常放置于培养容器和封闭系统中的限制器之间。

用来通过限制器的细胞聚集体浓度影响高生存能力的受限细胞聚集体的回收。出乎意料地，已发现使用图29-31中所示的限制器几何形状，低于约3x10^6细胞/ml的细胞聚集体浓度的限制产生比大于约3x10^6细胞/ml的细胞浓度具有更高的回收率的更高的生存能力样本。本领域技术人员将认识到，可选的限制器几何形状将改进提供相对较高的生存能力和回收率的阈值浓度。通过维持聚集体在流动流中的均匀的悬浮，例如通过使用在图32中所示的混合装置，使污染最小化，导致更高的细胞生存能力和回收率。有利地，限制器的使用排除了在受限的多能干细胞聚集体的扩增期间对y27632rock抑制剂的需要，不像酶促传代的多能干细胞聚集，其通常需要试剂例如y27632rock抑制剂以维持单多能细胞的生存能力。

在一组实施方案中，限制器用疏水材料涂布。在一些实施方案中，限制器包含疏水材料。

在一些其它实施方案中，细胞聚集体的连续传代能够在酶的存在下，通过在封闭系统容器中的细胞聚集体的分离来进行。

在以上描述的方法的一些实施方案中，在扩增和/或传代期间，每个扩增的细胞聚集体的平均直径尺寸不超过约800微米。在以上描述的方法的一些实施方案中，在扩增和/或传代期间，每个扩增的细胞聚集体的平均直径尺寸不超过约500微米。在以上描述的方法的一些实施方案中，在扩增和/或传代期间，每个扩增的细胞聚集体的平均直径尺寸不超过约400微米。在以上描述的方法的一些实施方案中，在扩增和/或传代期间，每个扩增的细胞聚集体的平均直径尺寸不超过约300微米。

在一些实施方案中，培养容器的容积是从约50ml-约100l。在一些实施方案中，培养容器的容积是从约50ml-约50l。在一些实施方案中，培养容器的容积是从约100ml-约10l。在一些实施方案中，培养容器的容积是从约100ml-约5l。在一些实施方案中，培养容器的容积是从约150ml-约1l。在一些实施方案中，培养容器的容积是从约50ml-约20l。在一些实施方案中，培养容器的容积是从约200ml-约2l。

本文还提供一种传代细胞聚集体的方法，其中细胞聚集体的尺寸通过与封闭系统中的生物反应器相连的限制器网格来减少。在一组用于任何在此描述的方法的实施方案中，细胞聚集体以超过100ml的体积传代。换言之，传代通常以较小的体积的培养基和较低的细胞计数进行。相比之下，本发明的方法允许在封闭系统中使用大体积的培养基，从而允许细胞聚集体在生物反应器中和/或以工业规模传代。封闭系统中的限制器网格与生物反应器组合在大体积例如，超过100ml的细胞聚集体传代中的应用在本公开内容之前在本领域中并未公开。在另一个实施方案中，细胞聚集体以超过250ml、500ml、1l、2l或5l的体积传代。在一个实施方案中，限制器网格是多边形限制器网格。在一个例子中，超过100ml体积的细胞聚集体的所述传代在无需加入rock抑制剂(如，y27632)至培养基的情况下进行。

在以上描述的用于传代细胞的方法的一些实施方案中，细胞聚集体用具有分开距离约20-约500微米的刀片的限制器网格分离。在以上描述的用于传代细胞的方法的一些实施方案中，细胞聚集体用具有分开距离约100微米的刀片的限制器网格分离。在一些这样的实施方案中，细胞聚集体用符合管道系统的限制器网格和混合细胞聚集体的装置分离。在某些情况下，限制器用疏水材料涂布。在其它情况下，限制器包含疏水材料。

在以上描述的用于传代细胞的方法的一些实施方案中，每个细胞聚集体的平均直径尺寸在传代前不超过约800微米。在以上描述的用于传代细胞的方法的一些实施方案中，每个细胞聚集体的平均直径尺寸在传代前不超过约500微米。在以上描述的用于传代细胞的方法的一些实施方案中，每个细胞聚集体的平均直径尺寸在传代前不超过约400微米。在以上描述的用于传代细胞的方法的一些实施方案中，每个细胞聚集体的平均直径尺寸在传代前不超过约300微米。

因此，本文提供的方法使一些工作流程成为可能，包括但不限于(1)生物反应器包括如，xuricellbag中，由以下这些来源形成聚集体：酶促分离的聚集体(如，accutasetm)、低温贮藏的库存，和/或机械限制的聚集体(如，多边形限制器网格)；(2)在摇动平台上的扩增方法：使用孔板、t形瓶和vuelife袋、具有用于重力沉降的管道组装的非-灌注生物反应器(如，非-灌注cellbag)，和/或灌注生物反应器(如，浮膜cellbag)；和(3)连续传代：加入到细胞培养容器内的聚集体中的酶(如，在cellbag中的accutasetm)、加入细胞培养容器外侧的聚集体中的酶和/或使用多边形限制器网格机械传代。

期望在本文提供的实施方案范围内的是在此描述的方法用于生成细胞库，用于生成为研究应用的扩增细胞聚集体，用于治疗和/或诊断试验(如，在临床试验中的药物试验、毒理学或质量控制分析)，和/或用于治疗患者的用途。本文提供的方法包括给予有需要的受试者药用组合物，其包含药学上可接受的载体和从在此描述的方法获得的至少一个细胞和/或细胞聚集体。

本文也提供通过给予有需要的受试者治疗有效量的在以上方法中产生的细胞和/或聚集体，在需要治疗的受试者中治疗疾病的方法。所述方法还包括通过给予治疗有效量的药用组合物在需要治疗的受试者中治疗疾病的方法，所述组合物包含药学上可接受的载体和在以上方法中产生的细胞和/或聚集体。应该理解在此描述的方法适用于多能干细胞以及分化的细胞。

在一些实施方案中，从在此描述的方法获得的和/或用于给予受试者的扩增细胞的纯度和/或同质性是约100%(基本同质的)。在其它实施方案中，从在此描述的方法获得的和/或用于给予受试者的扩增细胞的纯度和/或同质性是95%-100%。在一些实施方案中，从在此描述的方法获得的和/或用于给予受试者的扩增细胞的纯度和/或同质性是85%-95%。在与其它细胞混合的情况下，百分比可以是约10%-15%、15%-20%、20%-25%、25%-30%、30%-35%、35%-40%、40%-45%、45%-50%、60%-70%、70%-80%、80%-90%，或90%-95%。

为给定应用给予细胞的制剂的选择将取决于多种因素。其中主要的是受试者的物种，待治疗的病症的性质，其状态和在受试者中的分布，要给予的其它疗法和药物的性质，给药的最佳途径，经由该途径的生存能力，剂量方案，和对本领域技术人员将是显而易见的其它因素。例如，合适的载体和其它添加剂的选择将取决于给药的准确途径和特定剂型的性质。细胞/培养基的水性悬浮液的最终配制将通常包括调节悬浮液的离子强度至等渗性(即，约0.1-0.2)和至生理性ph(即，约ph6.8-7.5)。最终制剂通常还含有流体润滑剂。

在一些实施方案中，细胞以单位剂量注射剂形式配制，例如溶液、悬浮液，或乳液。适合于注射细胞的药物制剂通常是无菌的水性溶液和分散液。用于注射制剂的载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、盐水、磷酸缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)，及其合适的混合物。技术人员可容易地确定在本发明的方法中要给予的组合物中细胞和任选的添加剂、媒介和/或载体的量。

考虑例如具体患者的年龄、性别、体重和病症，和将要给予的制剂(如，固体对比液体)等因素，组合物可以医学和兽医领域的专业技术人员熟知的剂量和技术给予。

应该意识到，单剂量可一次全部递送，分部分递送，或经历一个时间段连续地递送。整个剂量也可递送至单一部位或分部分散布到几个部位。

在各个实施方案中，细胞可以初始剂量给予，此后通过进一步给予来维持。细胞可最初通过一种方法给予，此后通过相同的方法或一种或多种不同的方法给予。水平可通过持续的给予细胞来维持。各个实施方案通过静脉内注射初始给予细胞，或者在受试者中维持它们的水平，或者二者。在多个实施方案中，采用其它给药形式，这取决于患者的病症和在本文其它地方讨论的其它因素。用于初始给予和进一步剂量或用于序贯给予的合适的方案可以是全部相同的或可以是不同的。适宜的方案可由技术人员从本公开内容，在此引用的文件，和本领域的知识来确定。治疗的剂量、频率和持续时间将取决于许多因素，包括疾病的性质，受试者，和可以共同给予的其它疗法。在本文描述的任何实施方案中，细胞可以是分化的或未分化的。在本文描述的任何实施方案中，细胞可以被分离或聚集。在本文描述的任何实施方案中，细胞和/或细胞聚集体可包含多能干细胞和其后代的组合。

实施例

材料和方法

材料：聚集体在具有灌注(28-9376-52)和无灌注(cb0001l10-01)的xuricellbags中培养。用于饲养的培养基袋是5lhyclonelabtainer(sh30713.01)。废物袋是得自gehealthcare的mbag(mb0020l10-01)。matrigeltm购自bdbiosciences。accutasetm购自mpbiomedical(ca,usa)和invitrogentm(ny,usa)；mtesrtm1培养基购自stemcelltmtechnologyinc.(vancouver,bc,canada)。y-27632(rock抑制剂)购自sigmaaldrich(st.louis,mo)和millipore®。ct2hesc得自康涅狄格大学健康中心(universityofconnecticuthealthcenter)的ren-hexu。chb10得自georgedaley,children’shospitalboston。nl5ipsc得自nih的guokaichen。

方法：在xuritmw25实验之前，使源自matrigeltm的人胚胎干细胞适应于悬浮液聚集体大于5次传代。细胞维持在使用thermofishervarimix试管震摇器摇动的超-低附着6孔板(corning)上的mtesr™1中。贮藏的细胞被证实是染色体核型正常的。连续传代使用accutasetm执行以减少聚集体至小簇团和单细胞。细胞计数和生存能力使用nucleocounter®nc-200™(chemometec,denmark)测定。

实施例1

人胚胎干细胞系ct2(得自康涅狄格大学的ren-hexu)和人诱导的多能干细胞系ncrm5(也称为nl5，得自nih的guokaichen)，为从无饲养层细胞贮库适应的悬浮液并在生物反应器培养之前小规模维持至少5代。将来自活跃扩增小规模培养和来自冷冻贮库的细胞接种到容纳150ml体积的改良的cellbag中。单细胞和小(<5个细胞)簇团在cellbag中快速地形成大约100mm直径的聚集体，其经4天扩增至大约250mm直径。每天执行一半至全部培养基的交换并在培养4天后收获细胞。在150ml培养物中观察到至多5.5-倍扩增。从150ml规模回收的细胞在accutasetm中分离并以1l体积再接种到一个2l灌注袋中。在灌注条件下扩增细胞4天，聚集体扩增至300-350um直径。至多9-倍扩增，代表大约4百万细胞/ml，在4天后获得。通过流式细胞术对多能性标记oct4、tra-1-60和ssea3，通过核型，并对胚胎体形成，表征细胞。总之，发明人的结果描述在xuritm细胞扩增系统w25中成功地扩增悬浮液聚集体适应的多能干细胞系。

hesc悬浮液培养(a)

建立h1和ct2细胞的悬浮液聚集体培养，并为每一个生成冷冻贮库。已确定当在低附着板而不是标准细胞培养板上培养时，细胞更好地扩增和维持多能性(基于oct4、tra-1-60和ssea3表达)。悬浮液聚集体培养被发现连续生长5周。已证实在6孔板、t25和t75烧瓶中成功的聚集体形成和扩增。

许多实验被进行以表征接种、聚集体形成和扩增率。在标准接种密度(400k/ml培养基)时，经3天倍增次数为大约4x。当以100k/ml接种时，扩增率是较高的(经3天至多10-倍)。当细胞以较高的密度接种时，扩增率通常较低。接种效率显示是>90%。聚集体能够再附着于mg涂布的表面上，并重新获得正常的hesc形态学。

hesc悬浮液培养(b)

发现在ct2聚集体的连续传代期间多能性标记被保留。

hesc悬浮液培养(c)

ct2和h1悬浮液聚集体的冷藏保存的细胞库被扩增，和chb10冷藏保存的细胞库被扩增。在ct2和chb10上的流式细胞术显示高多能性标记物表达。继续监测细胞系的扩增率，通常经3天观察到3-4倍扩增和经4天观察到6-8倍扩增。这比通常在matrigeltm上观察到的生长速率更慢。

继续评价从6孔板(35mm)至100mm板，和在t25和t75烧瓶中的放大聚集体培养。结果显示随着容器尺寸的放大，扩增率进行性下降，其可使用较小的摇动角减轻。很可能随着容器端到端距离的尺寸的增加，可能需要较小的摇动角。

hesc悬浮液培养(d)

在vuelife32c和vuelife72c袋中的成功的接种和扩增已得到证实。在vuelifebag中经4天观察到7-倍扩增。系列传代hesc聚集体从一个vuellife72c袋至另一个vuelife72c袋的能力已得到证实。

hesc悬浮液培养(e)

5次连续传代在vuelife72袋中成功地执行，通常4天扩增在5和7倍之间和生存能力>90%。

hesc悬浮液培养(f)

与在6孔板上维持的聚集体比较，聚集体在vuelife袋中传代5代的流式细胞分析显示oct4和tra-1-60表达的类似的高水平。然而，与matrigeltm上的ct2(在历史对照中见到的水平)比较，在所有聚集体中多能性标记物表达幅度有普遍的减少。

hesc悬浮液培养

4个实验显示ct2的成功的扩增(至多5.3-倍)。细胞在150ml体积的改良的wavebags中扩增，并在2/10平台上维持。在wavebag中扩增的聚集体的流式细胞分析显示oct4、tra-1-60和ssea3的>95%的表达，证实了多能表型。在建立的nl-5ipsc悬浮液聚集体的3个实验中证实了在wavebag中的聚集体形成。

hesc悬浮液培养(g)

ct2从改良的wavebag连续移植到xuriw25系统上的1l灌注袋在2个实验中得到证实。用1l规模灌注观察到至多9-倍的扩增，并达到3.8m/ml的细胞密度。经8天观察到大约40-倍的扩增。

hesc悬浮液培养(h)

在从改良的wavebag至改良的wavebag至改良的wavebag至xuriw25系统上的1l袋的4次连续传代中，显示了ct2的成功的连续移植。未灌注1l袋，而是执行半批培养基更换。经16天观察到大约256-倍的扩增。采用灌注，预期扩增率将是较高的。在xuriw25灌注cellbag上接种、饲养(灌注)并收获的证实在封闭系统、无菌的过程中进行。流式细胞术结果显示在连续传代期间，多能性以正常水平，在xuriw25扩增细胞中维持。细胞在连续传代后保留正常核型。

hesc悬浮液培养

eb结果显示xuriw25扩增细胞保留分化为所有3个胚层的能力。细胞在连续传代后保留正常核型。多能干细胞系ct2的另外的扩增成功地在wave2/10和xuriw25系统中进行。

方法：

聚集体在超低附着6孔板中初步建立并扩增3-5天，然后聚集体分离为单细胞/小簇团，并再接种于新孔中。接种密度范围从100k至800k/ml。所用的摇动角范围从15至25度，伴随15-25次摇动/分钟的摇动速度。优选的摇动角范围从15至20度，摇动速度为20rpm。

各个多能干细胞系容忍摇动角度不同。ct2系比nl5系容忍更高的摇动角。在6孔板中的nl5细胞优选从5至15度的摇动角和15-25次摇动/min的摇动速度。对于nl5的优选的角度范围是从7至15度，而最好的结果在9度。

与6孔板比较，t25、t75烧瓶、vuelife袋和xuricellbags需要减少摇动角。通常地，对于烧瓶、vuelife袋和2lcellbags的摇动角与用于6孔板的角比较，必须减少3-7度以驱动接种和扩增。使用超出范围之外的摇动角的问题包括初始接种的减少(差的聚集体形成)和/或聚集体的结块。聚集体的结块也发生在烧瓶和袋的角落，因此具有圆角而不是直边是有利的。已观察到vuelife袋的角落上使用回形针通过消除角边减少结块。

改良的wave袋通过切开双层袋(dualbag)中的细胞培养室之间的接缝并加入薄膜至任何一端制备，以创建允许较小的体积(至多500ml)细胞培养体积的改良的wavebag(cellbag)。考虑到培养基成本，对首次研究初始选择较低的体积(150ml)。已注意到在改良的cellbag中，150ml体积的扩增往往低于较大体积的扩增，这可能归因于cellbag在膨胀后的形状。过度膨胀的袋具有对细胞培养面积的不同曲率，可导致在袋的各边处细胞脱水，导致细胞损失。此外，增加的曲率导致聚集体的更多结块，减少细胞扩增。

因此，已认识到cellbags的容积可影响细胞扩增，并且改良的wavebag的容积大于150ml是优选的。类似地，在1lcellbag中大于400ml的体积是优选的。将来自从6孔板、烧瓶、vuelife袋或先前的xuricellbag中生长的贮藏细胞的细胞，或者来自低温贮藏库存的细胞，接种到celbags中。在所有的情况下，观察到在cellbag中形成的聚集体并扩增。

细胞的封闭系统处理用对商业cellbag的一些改进执行。特定的管道设置(pvc和c-flex)被设计为合适的长度并具有正确的耦合，以允许在无菌的超净工作台上或者通过无菌的管焊装配培养基袋、灌注废物袋。accutase处理的单细胞和小(<5个细胞)簇团接种到在摇动平台上膨胀的cellbag中。容纳细胞的袋被无菌焊接到连接于cellbag的管道系统。软件控制操作的灌注(以400ml每天-1l每天加入新鲜培养基并除去灌注废物)。在非-灌注袋中，批培养基交换使用细胞的重力沉降和xuri系统蠕动泵执行，以除去用过的培养基并加入新鲜培养基。该过程的描述在附图中显示。

袋中的accutasetm通过聚集体的重力沉降或通过灌注滤器除去大部分生长培养基执行。pbs袋经无菌焊接到wave进料管线并用大约200ml的pbs洗涤cellbag中剩余的体积。然后通过重力沉降或者灌注滤器除去pbs，通过无菌焊接加入装有accutasetm的袋并使细胞暴露于cellbag中的accutasetm3-10分钟。将注射器放置于含有汲取管的端口并在accutasetm培养后，细胞通过汲取管被抽入注射器以使聚集体分开。尽管注射器不是封闭系统，但多个设计可代替，包括与注射器相联的过滤空气的无菌滤器，其在设计上类似于已经在cellbag上的空气滤器。

因此，对于在xuriw25上的悬浮液聚集体(无灌注滤器)，用于封闭系统培养基交换的一种方法如下。

预热进料袋中的培养基

一旦预热，确保进料袋和收获袋经管融合

中止反应器，等待直至它在12度角停止

升高托盘以达到60度角

关闭气体流量，然后通过在其上推挤来压缩袋

使聚集体沉降2分钟

收获：

从顶部菜单栏，选择手动->执行手动指令

选择培养基控制->收获->管内径=3.2mm->插入

选择泵控制->开始收获泵->限制的->60sec持续时间，200rpm->插入

执行。

泵将脱去~75ml。使用200rpm，每60秒将除去大约75ml。泵的校准可改变并且它被建议每4天进行校准。

点击关闭。

进料：

从顶部菜单栏，选择手动->执行手动指令

选择培养基控制->进料->管内径=3.2mm->插入

选择泵控制->开始进料泵->限制的->65sec持续时间，200rpm->插入

执行。

泵将加入~75ml。使用200rpm，每60秒加入大约75ml。为确保所有的新鲜培养基被转移到袋中，管道系统是空的，运行长于需要的时间5秒。泵的校准可改变并且它被建议每4天进行校准。

点击关闭。

以上描述的方案需要手动指令以重力沉降细胞。或者，灌注控制可使用xuri控制软件设定，使用连续灌注(~0.3ml/min进料并除去500ml/天)或间歇灌注(一次批除去50-500ml并更换新鲜培养基)设置以至少一天一次发生。在一些情况下，如果细胞扩增被提高，间歇灌注可能是优选的。图10详述了在多个连续和间歇灌注的场合，随时间推移新鲜对比用过的培养基的量。在所有的情况下，培养基交换是全自动的，不需要用户干预。

本文描述的示例性xuri细胞扩增系统w5和/或w25被设计用于快速安装并可以从约150ml-约5l的工作培养体积或如本文描述的较大或较小的体积使用。这个紧凑装置适合于整体特征例如通气、加热和温度控制。其它选项包括用于灌注培养的称重控制器、溶解氧放大器和ph控制器。

实施例2

本文描述的扩增率是示例性的，并不打算限定本发明、系统或方法的性能或任何固有的局限性。本领域技术人员将认识到扩增率受所用细胞系、所用培养基的配方、培养基体积、培养基交换和灌注程序、初始接种密度和所用培养条件的影响。以下实施例描述大约6百万细胞/ml的最大细胞浓度，然而可以想象当使用在这些实施例中描述的方法结合前面的句子中提及的变化时，较高的细胞浓度可以实现。实施例利用xuricellbagwave运动生物反应器系统，但本领域技术人员将认识到其它摇动平台可也实现类似的性能。

材料：随后实施例所用的材料包括得自gehealthcare®(ma,usa)的离心管、xuricellbag生物反应器(如，产品29108442和cb0001l10-01)。与cellbags相关的摇动平台是xuri细胞扩增系统w25和xuri细胞扩增系统w5(原称为wave2/10)。accutasetm购自mpbiomedical(ca,usa)和invitrogen^tm(ny,usa)；mtesr^tm-1培养基购自stemcell^tmtechnologyinc.(vancouver,bc,canada)。y-27632(y27632rock抑制剂)购自sigmaaldrich(st.louis,mo)和millipore®。为了本申请特别生产了用于传代的重力沉降的多边形网格限制器和管道组装而不通过商业供应商购买。

细胞：ct-2细胞系(人胚胎干细胞)得自康涅狄格大学,usa；chb-10细胞系得自georgedaley,children’shospitalboston,usa；nl5(也称为ncrm-5)细胞系(人诱导的多能干细胞)得自nationalheart,lung,andbloodinstituteipscandgenomeengineeringcorefacility的guokaichen。

来自附粘培养的多能干细胞对悬浮液聚集体培养的适应：

来自matrigeltm上的粘附培养的3种多能干细胞系(两种胚胎干细胞系ct2、chb10和一种诱导的多能干细胞系nl5)适应于在摇动培养系统中的悬浮液聚集体。为提供小规模的摇动，使细胞维持在6孔板或t烧瓶中并使用维持在标准加湿的co2孵化器中的thermovarimax试管震摇器或boekelscientific震摇器ii260350摇动平台摇动。细胞系经几次传代维持以允许稳定的细胞培养，然后在xuriw25系统上扩增。对于每个细胞系，系统测试在传代期间用于优选的细胞接种浓度、摇动角、摇动速度、y27632rock抑制剂的浓度和accutasetm暴露的长度的条件。注意，所有3种细胞系优选不同培养条件。

对于3种不同的细胞系，将用accutasetm分离的细胞以100k-1.5m细胞/ml之间的细胞密度，在1-10umy27632rock抑制剂中，接种到低附着6孔板或t烧瓶中，以建立培养，过夜培养后形成约50-约200um直径聚集体。当第一次建立培养时，测试不同的接种密度以确定对于每种细胞类型的优选的接种密度。系统测定用于扩增不同细胞系的优选的摇动角/摇动速度。经历3种细胞系，在6孔板和t烧瓶中的优选的培养条件是大约10-25次摇动/分钟(rpm)，和12-20度的摇动角。

细胞的每日进料被用于最佳多能性的维持。每日采用50%-100%培养基交换。为执行培养基交换，聚集体以180xg离心1分钟或者可供选择地允许重力沉降2-5分钟。较大的聚集体重力沉降快于较小的聚集体。小心地除去上清液并用新鲜培养基替换，通过温和的移液使聚集体悬浮。细胞扩增率取决于接种的细胞浓度，其中较高的扩增率用较低的初始细胞密度获得。

悬浮液聚集体psc在6孔板/t烧瓶中的扩增和传代：

使psc悬浮液聚集体每3-5天传代，取决于聚集体的密度和直径。当聚集体的直径为约250-400um时，将它们传代。随着聚集体直径生长，中心可变得更暗或可在聚集体中发展为似乎是洞或空置的区域。细胞计数在3-5天培养期间增加约4-12倍。

为了传代，将聚集体在pbs中洗涤一次，接着于37c用accutasetm5-7分钟。分离的细胞以200xg离心5分钟，然后小心地除去上清液并用完全培养基替换至在1-10umy27632rock抑制剂中的所需细胞浓度。或者，聚集体使用包含镍合金或硅的由正方形或六角网格图案组成的限制器(壁间具有100um间隔)传代。

在一个实施例中，在用accutasetm或用方格网或六角网格限制器传代后，测量聚集体形成和细胞扩增。传代后，将ct2人胚胎干细胞以4x10^5细胞/ml或1.5x10^6细胞/ml接种在6孔板的2mlmtesr1中，用或不用10umy27632rock抑制剂。于37℃、5%co2，在以15度摇动角每分钟20次摇动的培养条件下，使板维持在boekelscientificrockerii260350震摇器平台上的标准细胞培养孵化器中。在过夜培养后，从accutase处理的细胞形成聚集体。每天，完全除去用过的mtesr1并用新鲜mtesr1(无y27632rock抑制剂)替换。在第4天，收获聚集体，用accutasetm分离并使用nucleocounternc200计数。对于以4x10^5/ml接种的细胞，用于通过accutasetm传代的聚集体，观察到大约8-倍扩增(图16)。对于用正方形或六边形限制器传代后的聚集体观察到类似的大约8-倍扩增(图16)。对于以1.5x10^6/ml接种的细胞，用于通过accutasetm传代的两种细胞，观察到大约4-倍扩增(图17)。对于用正方形或六边形限制器传代后的聚集体观察到类似的大约4-倍扩增(图17)。在两种初始细胞密度时，用或不用y27632rock抑制剂培养的限制器传代的聚集体的扩增率是类似的。经4天培养期的聚集体的形态学在图18-22中描述。

vuelife袋扩增数据：

在一个实施例中，ct2人胚胎干细胞聚集体使用accutasetm分离。在第1天，将ct2聚集体以在72mlmtesr1加10umy27632rock抑制剂中的250,000细胞/ml接种到vuelife72c气体渗透袋中。将vuelife袋放置在标准孵化器上并使用thermovarimax试管摇动平台摇动。培养条件包括每分钟20次摇动、9度摇动角、37℃、5%co2。完全培养基交换每天用新鲜mtesr1(无y27632rock抑制剂)执行。在第4天，从cellbag回收聚集体，并用accutasetm分离为单细胞/小簇团。分离的细胞使用nucleocounternc200计数。整个培养物回收总共8.67x10^7个活细胞，生存能力是96.3%，表示4.8-倍扩增。

自accutasetm分离的细胞在cellbag中的接种：

多能干细胞悬浮液聚集体通过accutasetm分离。经消化的细胞产物由大部分2-10细胞的小簇团和单细胞组成。在mtesr1加1-10umy27632rock抑制剂中，将细胞加入xuricellbag中，即在1lxuricellbag中为125ml和500ml之间的总体积或在2lxuricellbag中为350ml-1l的总体积。接种细胞浓度在100,000和2百万细胞/ml之间。培养基任选地含有0.2%pluronicf68。聚集体在初始接种后经2-18小时时期自发地建立。

在一个实施例中，ct2人胚胎干细胞聚集体使用accutasetm分离。将细胞以在283mlmtesr1加10umy27632rock抑制剂中的400,000细胞/ml接种到1lxuricellbag中。培养条件包括每分钟20次摇动、5度摇动角、37℃、5%co2。大约100-150um直径的聚集体在第二天早晨形成。每日用新鲜培养基(无y27632rock抑制剂)替换一半的用过的培养基。在第4天，从cellbag回收聚集体，并用accutasetm分离至单细胞/小簇团。分离的细胞使用nucleocounternc200计数。整个培养物回收总共4.41x10^8个活细胞，生存能力是98.6%，表示3.9-倍扩增。

在另一个实施例中，ct2人胚胎干细胞聚集体使用accutasetm分离，然后冷藏保存。融化低温贮藏的库存，以在150mlmtesr1加10umy27632rock抑制剂中的400,000细胞/ml接种到1lxuricellbag中。培养条件包括每分钟20次摇动、5度摇动角、37℃、5%co2。大约100-150um直径的聚集体在第二天早晨形成。每日用新鲜培养基(无y27632rock抑制剂)替换一半的用过的培养基。在第4天，从cellbag回收聚集体，并用accutasetm分离至单细胞/小簇团。分离的细胞使用nucleocounternc200计数。整个培养物回收总共2.76x10^8活细胞，生存能力是96.1%生存能力，表示4.6-倍扩增。

在cellbag和xuriw25生物反应器设置中的psc扩增：

不是所有的多能细胞系优选相同的培养条件。以下参数被用于xuriw25系统中的psc扩增，和本领域技术人员将认识到其它条件也提供在其它容器中的psc扩增：温度37℃、co2水平5%、环境o2(~21%)或减少的o2水平。所有的实验使用2.5-6度之间的摇动角，和12-20rpm的摇动速度进行，本领域技术人员将认识到其它条件也提供psc扩增。

在加入单细胞/小簇团至xuricellbag后2-12小时形成聚集体。细胞形成在约50和200um之间的直径的聚集体。正常的是获得平均聚集体直径上下50um的直径的聚集体分布。大多数聚集体落入该尺寸范围内，然而偶尔形成一些大约200-400um的较大聚集体。利于较小的聚集体的条件是优选的，因为在较大的聚集体中的营养素可用性可受到限制，而较小的聚集体在培养中提供一个更大的相对扩增。

优选的条件提供具有最小的团块的球形聚集体。重要的是在cellbag中的搅拌水平的平衡，因为太多的搅拌将导致剪切，包括聚集体的变形并产生过多数量的非-聚集的单细胞。太少的搅拌将导致聚集体的团块。

在一个实施例中，ct2人胚胎干细胞通过accutasetm分离至单细胞或5个或更少细胞的小簇团。将分离的细胞以在150mlmtesr1中的400,000细胞/ml接种到xuricellbag中。培养条件包括每分钟20次摇动、5度摇动角、37℃、5%co2。大约100-150um直径的聚集体在第二天早晨形成。每日用新鲜培养基(无y27632rock抑制剂)替换一半的用过的培养基。在第4天，从cellbag回收聚集体，并用accutasetm分离至单细胞/小簇团。分离的细胞使用nucleocounternc200计数。整个培养物回收总共2.2x10^8活细胞，生存能力是99.1%，表示7.0-倍扩增。

在另一个实施例中，ct2人胚胎干细胞通过accutasetm分离至单细胞或5个或更少的细胞的小簇团。将分离的细胞以每ml400,000细胞(1lmtesr加10umy27632rock抑制剂)接种到2lxuri灌注cellbag中。培养条件包括每分钟20次摇动、5度摇动角、37℃、5%co2。大约100-150um直径的聚集体在第二天早晨形成。每日经由用新鲜培养基(无y27632rock抑制剂)的连续灌注替换一半的用过的培养基。在第4天，从cellbag回收聚集体，并用accutasetm分离至单细胞/小簇团。分离的细胞使用nucleocounternc200计数。整个培养物回收总共2.23x10^9个活细胞，生存能力是93.5%，表示5.6-倍扩增。

在另一个实施例中，nl5人诱导的多能干细胞通过accutasetm分离至单细胞或5个或更少的细胞的小簇团。将分离的细胞以400,000细胞/ml、250mlmtesr1加10umy27632rock抑制剂，接种到1lxuricellbag中。培养条件包括每分钟20次摇动、4度摇动角、37℃、5%co2。大约200-300um直径的聚集体在第二天早晨形成。每日用新鲜培养基(无y27632rock抑制剂)替换一半的用过的培养基。在第4天，从cellbag回收聚集体，并用accutasetm分离至单细胞/小簇团。分离的细胞使用nucleocounternc200计数。整个培养物回收总共3.7x10^8个活细胞，生存能力是92%，表示3.7-倍扩增。

用于非-灌注袋中的重力沉降和培养基交换的管道组装：

管道组装的概念结构示于图23和24中，而关于xuricellbag的装配图示于图25中。装配提供以下功能，包括但不限于以下：(1)除去细胞/细胞培养基混合物，(2)从流出细胞培养基分离细胞聚集体，(3)加入细胞培养基，和(4)除去细胞培养基。

细胞聚集体/细胞培养基混合物的除去通过使用穿过非-灌注袋中的可利用的端口之一进入的汲取管实现。汲取管应具有足够的长度/方向，以使细胞/培养基可从非-灌注袋除去，同时它被安装在xuri平台上且在xuri平台上操作。从流出的培养基分离细胞聚集体通过引入具有足够长度(高度)和直径的重力沉降室，以在除去培养基期间确保足够的重力沉降来实现。这种室的设计不限于大直径管；如果必要，为了满意的细胞聚集体分离，弯曲通道也可被整合。用于流体加入/除去的管道系统需要具有足够的长度，以确保达到与培养基/废物容器的连接。流体除去通过经过流体除去路径抽出培养基实现，同时保持流体加入路径关闭。流体加入通过经过流体加入路径灌注新鲜培养基实现，同时保持流体除去路径关闭。

非-灌注细胞培养容器的培养基交换：

多能干细胞培养需要频繁的培养基交换。封闭系统培养基交换使用两种方法执行：1)手动过程或2)自动过程，无需从摇动平台移去cellbag。

培养基交换的手动过程如下：用过的培养基收集袋被无菌管焊接到cellbag。摇动平台被倾斜至直立60度角。允许聚集体在xuricellbag中重力沉降1-5分钟。聚集体沉降时间对于较大的聚集体比对于较小的聚集体更快。使用泵，从沉降的聚集体以上的端口抽出培养基，50%或更多的用过的培养基从cellbag除去。单细胞，其通常为非-存活的，在除去的培养基中频繁失去。小心不要破坏沉降的聚集体，同时除去培养基。轻轻地再悬浮聚集体，然后预热的新鲜培养基被从无菌焊接到cellbag的细胞培养基袋加入到cellbag中。3-5天后，聚集体被传代。

用于非-灌注袋中的自动的培养基交换的方法可应用于所有尺寸的非-灌注cellbags。例如，1l非-灌注cellbag经改良具有用于重力沉降的管道组装，以便能够经15分钟-6小时时间除去10-100ml用过的培养基，接着加入10-100ml新鲜培养基至cellbag。控制软件调节通过用于重力沉降的管道组装除去用过的培养基和加入新鲜培养基的速率。新鲜培养基袋和废物袋被无菌附接于cellbag。新鲜培养基袋任选地在细胞培养的持续时间中在冰箱贮藏。在3-5天后，聚集体被传代。

在一个实施例中，ct2人胚胎干细胞聚集体使用在壁之间具有100um间隔的镍合金方格网限制器传代。细胞以725,000细胞/ml、250mlmtesr1接种到1lxuricellbag中。培养条件包括每分钟20次摇动、4度摇动角、37℃、5%co2。灌注条件被设计以使用在非-灌注袋中的用于重力沉降的管道组装从生物反应器经50分钟除去15ml用过的培养基，接着以1分钟加入15ml，以致每天补充125ml。在第4天，从cellbag回收聚集体，并用accutasetm分离至单细胞/小簇团。分离的细胞使用nucleocounternc200计数。整个培养物回收总共1.13x10^9细胞，生存能力是97.4%，表示6.2-倍扩增。

在灌注cellbags中的培养基交换：

自动psc扩增使用灌注cellbag实现，后者含有在cellbag内的浮膜，用于除去用过的培养基并使细胞保留在cellbag中。这个方案可应用于所有类型的灌注容器，例如具有用于灌注的浮膜的cellbags。例如，通常培养350ml-1l体积并灌注到2l浮膜灌注cellbag中。用于连续和间歇的灌注的方案在下文描述。

对于在灌注cellbag中的连续灌注，基于重量的xuriw25unicorn软件控制被用来维持cellbag中特定水平的体积，使用培养基控制调节连续除去用过的培养基和加入新鲜培养基。在这种方法中，袋的重量被连续地监测以调节新鲜培养基加入和用过的培养基除去的速率。在另一种方法中，泵被编程以独立于重量测量的限定速率加入新鲜培养基和除去用过的培养基。优选地，除去的用过的培养基体积等于加入的新鲜培养基的体积，以维持恒定的体积，然而两个速率可以是不同的。

对于间歇的灌注，软件控制调节除去特定量的用过的培养基和加入新鲜培养基。这种方法通常独立于容器重量。优选地，预定体积的用过的培养基被除去，接着根据预定进料程序，推注加入新鲜培养基的体积。例如，进料计划可被设置以每2小时除去50ml用过的培养基，接着加入50ml新鲜培养基。

在一个实施例中，ct2人胚胎干细胞聚集体使用accutasetm分离。将细胞以在1lmtesr1加10umy27632rock抑制剂中的272,000细胞/ml接种到具有浮膜的2lxuri灌注cellbag中。培养条件包括每分钟20次摇动、5度摇动角、37℃、5%co2。大约100-150um直径的聚集体在第二天早晨形成。使用连续灌注方案，以每天使用xuriw25软件控制交换500mlmtesr1(无y27632rock抑制剂)。在第4天，从cellbag回收聚集体，并用accutasetm分离至单细胞/小簇团。分离的细胞使用nucleocounternc200计数。整个培养物回收总共2.59x10^9个活细胞，生存能力是95%，表示9.5-倍扩增。

用于酶促聚集体传代的两种方法是：1)在cellbag中的封闭系统酶促处理，和2)从cellbag回收细胞，接着在cellbag外部开放酶促传代。两种方法如下描述。开放传代方法可以较少的时间，用需要较少的无菌袋焊接实现。封闭系统方法允许聚集体整个传代中维持在封闭系统中。

cellbag中聚集体的accutasetm分离的方法：在这种方法中，除去培养基，聚集体在pbs中洗涤，然后用accutasetm在cellbag中处理。使用剪切力分散聚集体的方法是需要的。

描述了一种在xuricellbag中传代悬浮液聚集体的封闭方法。在提升xuri平台托盘至60度角后，使聚集体重力沉降1-5分钟。对于较大聚集体的聚集体沉降时间比对于较小的聚集体的沉降时间快。泵被用来从cellbag尽可能地除去大部分培养基而不破坏沉降的聚集体。优选地，体积被减少至25-50ml。含有预热至37℃的pbs的袋被无菌管焊接到cellbag以洗涤细胞。250ml-500ml的pbs被加入到cellbag中以洗涤细胞。聚集体在pbs中混合，然后允许重力沉降1-5分钟。泵被用来从cellbag除去同样多的pbs而不破坏沉降的聚集体。优选地，体积被减少至25-50ml。另外的250ml-500mlpbs被加入到cellbag以第二次洗涤细胞。聚集体在pbs中混合，然后允许重力沉降1-5分钟。泵被用来从cellbag除去同样多的pbs，而不破坏沉降的聚集体。优选地，体积被减少至25-50ml。

含有预热至37℃的accutasetm的袋被无菌管焊到cellbag。50mlaccutasetm被加入到cellbag中并于37℃在摇动中培养。使用附接于cellbag端口上的0.22um滤器管道组装的注射器以分散在accutasetm中的聚集体。加入50ml的完全培养基并收集细胞以供下游应用。

在一个实施例中，ct2人胚胎干细胞通过accutasetm分离至单细胞或5个或更少的细胞的小簇团。分离的细胞以400,000细胞/ml、150mlmtesr1加10umy27632rock抑制剂接种到xuricellbag中。培养条件包括每分钟20次摇动、5度摇动角、37℃、5%co2。大约100-150um直径的聚集体在第二天早晨形成。每日用不含y27632rock抑制剂的新鲜培养基替换一半的用过的培养基。在第4天，聚集体用在如上所述的cellbag内的accutasetm分离。分离的细胞使用nucleocounternc200计数。整个培养物回收总共4.2x10^8活细胞，生存能力是97.8%，表示7.0-倍扩增。

cellbag外的聚集体的accutasetm分离方法：

或者，聚集体从容器回收并在开放系统中传代。这种方法以两种方式执行：1)从容器收集细胞的整个培养体积，或2)在袋内聚集体重力沉降后从xuricellbag除去大部分培养基，然后聚集体在袋中用pbs洗涤或者从袋收集，以供袋外洗涤/accutasetm。

在一个实施例中，描述了使用xuricellbag的开放accutasetm的方法。在升高xuri平台托盘至60度角后，允许聚集体重力沉降1-5分钟。对于较大聚集体的聚集体沉降时间比对于较小的聚集体的沉降时间快。泵被用来从cellbag除去大部分培养基，而不破坏沉降的聚集体。优选地，体积被减少至25-50ml。收集袋被管融合到系统和泵被用来从cellbag转移聚集体至收集袋中。收集袋被带进超净工作台且聚集体被无菌转移至圆锥形管中。圆锥形管以180xg离心1分钟，然后小心地除去上清液。聚集体在pbs中洗涤，以180xg再次离心1分钟，然后除去上清液。为分离聚集体，于37℃加入accutasetm5-7分钟。

连续传代：无滤器袋至浮膜灌注袋的酶促传代：

在一个实施例中，执行了从无滤器袋至浮膜灌注袋的悬浮液聚集体多能干细胞的连续传代。第一代以250ml体积扩增和第二代以1l体积扩增。ct2人胚胎干细胞聚集体使用accutasetm分离。在每次传代中，将细胞以在mtesr1加10umy27632rock抑制剂中的400,000细胞/ml接种到1l非-灌注或2l灌注xuricellbag中。培养条件包括每分钟20次摇动、5度摇动角、37℃、5%co2。大约100-150um直径的聚集体在第二天早晨形成。在无滤器袋中，每日用不含y27632rock抑制剂的新鲜培养基替换一半的用过的培养基，并在浮膜灌注cellbag中，每天使用xuriw25软件控制，使用连续灌注方案交换500ml培养基。在接种后第4天通过用accutasetm分离至单细胞/小簇团，使聚集体传代。分离的细胞使用nucleocounternc200计数。在传代1中，整个培养物回收总共6.96x10^8活细胞，生存能力是99.4%，表示7-倍扩增(图26)。在传代2中，整个培养物回收总共2.23x10^9活细胞，生存能力是93.5%，表示5.6-倍扩增。经8天，存在总体39.2-倍扩增。

连续传代：在xuricellbags中的4次连续酶促连续传代：

在一个实施例中，用于4次传代的悬浮液聚集体多能干细胞的连续传代在1l和2lxuricellbags中执行。两个传代以150ml体积扩增，接着一个传代以400ml体积扩增，和一个传代以1l体积扩增。ct2人胚胎干细胞聚集体使用accutasetm分离。在每个传代中，在mtesr1加10umy27632rock抑制剂中，细胞以400,000细胞/ml接种到xuricellbag中。培养条件包括每分钟20次摇动、5度摇动角、37℃、5%co2。大约100-150um直径的聚集体在第二天早晨形成。每日用新鲜培养基(无y27632rock抑制剂)替换一半的用过的培养基。聚集体在接种后第4天，通过用accutasetm分离至单细胞/小簇团进行传代。分离的细胞使用nucleocounternc200计数。在传代1中，整个培养物回收总共2.19x10^8活细胞，生存能力是99.1%，表示3.7-倍扩增(图27)。在传代2中，整个培养物回收总共4.17x10^8活细胞，生存能力是97.8%，表示7-倍扩增。在传代3中，整个培养物回收总共5.64x10^8活细胞，生存能力是97.2%，表示3.5-倍扩增。在传代4中，整个培养物回收总共1.25x10^9活细胞，生存能力是94.4%，表示3.1-倍扩增。整体扩增经16天为279-倍。在连续传代期间的聚集体形态学示于图28中

限制器设计：

限制器可由各种生物相容性材料组成。材料必须经得起灭菌，并具有允许其承受在细胞样本流动期间经历的压力的机械强度。测试多能干细胞聚集体传代的两种材料是镍合金和硅。本领域技术人员将认识到其它材料具有能够用于聚集体传代的所需限制器性能的特性。限制器用多边形网格-样图案，例如正方形或六边形网格设计，网格壁之间的间隔在50微米和400微米之间(图29-31)。在一些实验中，限制器用疏水性材料涂布以减少剪切力和污垢。对于下述的多能干细胞聚集体传代实验，使用具有100um间隔的正方形和六边形网格。限制器根据管道系统安装，这允许聚集体无菌流过管道系统和越过封闭系统中的限制器。限制器可通过多个紧固机械装置包括，但不限于粘合剂、熔融聚合物流或夹具，整合到封闭系统。在优选的方法中，聚集体通过由泵驱动的循环回路和在线锥形袋维持在悬浮液中(图32)。导向限制器的管道系统连接于主循环回路，而在循环回路中的部分细胞聚集体通过以比控制循环回路的泵更低的速度操作的第二个泵被传递至限制器。受限的聚集体可收集在独立的容器中，或再引入相同的容器。

细胞聚集体传代期间的限制器性能：

聚集体以包含100ml-1l体积的流动流通过限制器。限制器与酶促传代相比的益处是减少时间、劳力和试剂。降至大约100um尺寸的成功的限制通过一个或多个通道以单向或双向流通过限制器实现。控制流速以使剪切力最小化。对于尺寸减少、维持细胞生存能力和随后的扩增的聚集体限制性能在以15-150ml/min的流速通过限制器的多能干细胞聚集体上得到证明。本领域技术人员将认识到好的性能也可以其它流速达到。确定用来通过限制器的细胞聚集体浓度，以影响高生存能力的受限细胞聚集体的回收率。限制器的污染可导致减少的细胞回收率和生存能力。已确定在约3x10^6细胞/ml以下的细胞聚集体浓度的限制比大于约3x10^6细胞/ml的细胞浓度产生具有更高回收率的更高的生存能力样本。污染通过维持聚集体在流动流中均匀的悬浮液而最小化，例如通过使用显示于图32中的混合装置，导致较高的细胞生存能力和回收率。受限的聚集体的样本图像显示于图33中。限制后的聚集体形态学包括不规则形状、立方体形状和球形形状。对于100um限制器，至少一个尺寸的聚集体被减少至大约100um直径。受限的聚集体在mtesr1和任选的1-10umy27632rock抑制剂中培养并允许扩增。对于受限的多能干细胞聚集体的扩增不需要y27632rock抑制剂，不像酶促传代的多能干细胞聚集，其通常需要试剂例如y27632rock抑制剂以维持单多能细胞的生存能力。在连续摇动培养条件下，受限的聚集体的形态学快速地重新组成球形形状。受限的聚集体的扩增率类似于酶促传代的细胞的扩增率(图16和17)。聚集体可通过限制器传代，而不需要用于酶促传代的pbs洗涤，因此，通过限制传代花费比酶促传代更少的时间和更少的整体工作。本领域技术人员将认识到限制器功能和性能不取决于xuricellbag生物反应器平台，并与其它类型的生物反应器，包括但不限于其它摇动运动平台或搅拌釜生物反应器兼容。

限制器后聚集体的扩增：

在一个实施例中，ct2人胚胎干细胞聚集体使用壁之间具有100um间隔的镍合金六角网格限制器传代。将细胞以在250mlmtesr1加3umy27632rock抑制剂中的460,000细胞/ml接种到xuricellbag中。培养条件包括每分钟20次摇动、4度摇动角、37℃、5%co2。灌注条件被设计为经50分钟从生物反应器除去15ml用过的培养基，接着以1分钟加入15ml新鲜mtesr1(无y27632rock抑制剂)，这样每天使用用于重力沉降的管道组装，在非-灌注袋中补充125ml。在第5天，从cellbag回收聚集体，并用accutasetm分离至单细胞/小簇团。分离的细胞使用nucleocounternc200计数。整个培养物回收总共6.9x10^8个活细胞，生存能力是91.9%，表示6.0-倍扩增。

在另一个实施例中，ct2人胚胎干细胞聚集体使用壁之间具有100um间隔的硅六角网格限制器传代。将细胞以在250mlmtesr1中(不加入y27632rock抑制剂)的200,000细胞/ml接种到xuricellbag中。培养条件包括每分钟20次摇动、4度摇动角、37℃、5%co2。灌注条件被设计经110分钟从生物反应器除去30ml用过的培养基，接着以2分钟加入30ml新鲜mtesr1(无y27632rock抑制剂)，这样每天使用用于重力沉降的管道组装，在非-灌注袋中补充125ml。在第4天，从cellbag回收聚集体，并用accutasetm分离至单细胞/小簇团。分离的细胞使用nucleocounternc200计数。整个培养物回收总共2.90x10^8活细胞，生存能力是92.9%，表示5.8-倍扩增。

连续传代：用镍合金六角网格限制器的无滤器袋至无滤器袋传代

在一个实施例中，对于3次传代的悬浮液聚集体多能干细胞的连续传代在1lxuricellbags中执行。两个传代以250ml体积扩增，接着一个传代以500ml体积扩增。ct2人胚胎干细胞聚集体使用壁之间具有100um间隔的镍合金六角网格限制器传代。在每个传代，受限的聚集体被接种到在1lxuricellbag中的mtesr1加2-5umy27632rock抑制剂中。培养条件包括每分钟20次摇动、4度摇动角、37℃、5%co2。灌注条件被设计经50分钟从生物反应器除去15ml用过的培养基，接着在1分钟内加入15mlmtesr1(无y27632rock抑制剂)，这样每天使用用于重力沉降的管道组装在非-灌注袋中补充125ml。一部分聚集体在第4或5天通过用accutasetm分离至单细胞/小簇团进行传代以供计数。分离的细胞使用nucleocounternc200计数。在传代1中，总共1.22x10^8个活细胞被接种和3.12x10^8个活细胞被回收，整个培养物的生存能力是96.8%，表示2.6-倍扩增(图34)。在传代2中，总共1.15x10^8个活细胞被接种和6.93x10^8个活细胞被回收，整个培养物的生存能力是91.9%，表示6-倍扩增。在传代3中，总共3.48x10^8个活细胞被接种和1.88x10^9个活细胞被回收，整个培养物的生存能力是92%，表示5.4-倍扩增。经14天，存在总共83-倍扩增。

连续传代：用镍合金方格网限制器的无滤器袋至无滤器袋传代

在一个实施例中，对于3次传代的悬浮液聚集体多能干细胞的连续传代被执行。两个传代以250ml体积扩增，接着一个传代以500ml体积扩增。ct2人胚胎干细胞聚集体使用壁之间具有100um间隔的镍合金正方形网格限制器传代。在每个传代，受限的聚集体被接种到在xuricellbag中的mtesr1加2-5umy27632rock抑制剂中。培养条件包括每分钟20次摇动、4度摇动角、37℃、5%co2。灌注条件被设计经50分钟从生物反应器除去15ml用过的培养基，接着在1分钟内加入不含y27632rock抑制剂的15mlmtesr1，这样每天使用用于重力沉降的管道组装在非-灌注袋中补充125ml。一部分聚集体在第5天通过用accutasetm分离至单细胞/小簇团进行传代以供计数。分离的细胞使用nucleocounternc200计数。在传代1中，总共1.14x10^8个活细胞被接种和5.13x10^8个活细胞被回收，整个培养物的生存能力是97.5%，表示4.5-倍扩增(图35)。在传代2中，总共1.82x10^8个活细胞被接种和1.13x10^9个活细胞被回收，整个培养物的生存能力是97.4%，表示6.2-倍扩增。经10天，存在总共28-倍扩增。

连续传代：用硅六角网格限制器的无滤器袋至无滤器袋传代

在一个实施例中，用于两个传代的悬浮液聚集体多能干细胞的连续传代被执行。两个传代以250ml体积扩增。ct2人胚胎干细胞聚集体使用壁之间具有100um间隔的硅六角网格限制器传代。在每个传代，受限的聚集体被接种到在1lxuricellbag中的mtesr1加2-5umy27632rock抑制剂中。培养条件包括每分钟20次摇动、4度摇动角、37℃、5%co2。灌注条件被设计经50分钟以从生物反应器除去15-30ml用过的培养基，接着在1-2分钟加入不含y27632rock抑制剂的15-30mlmtesr1，这样每天使用用于重力沉降的管道组装，在非-灌注袋中补充125ml。一部分聚集体在第4或5天通过用accutasetm分离至单细胞/小簇团进行传代以供计数。分离的细胞使用nucleocounternc200计数。在传代1，总共5.74x10^7活细胞被接种和3.15x10^8活细胞被回收，整个培养物的生存能力是93.8%生存能力，表示5.5-倍扩增(图36)。在传代2，总共1.95x10^8活细胞被接种和1.04x10^9活细胞被回收，整个培养物的生存能力是97.8%，表示5.4-倍扩增。经9天，存在总共29.4-倍扩增。

连续传代：用硅六角网格限制器且无rock抑制剂的无滤器袋至无滤器袋传代

在一个实施例中，用于两个传代的悬浮液聚集体多能干细胞的连续传代被执行。一个传代以250ml体积扩增，接着一个传代以300ml体积扩增。ct2人胚胎干细胞聚集体使用壁之间具有100um间隔且用疏水材料涂布的硅六角网格限制器传代。在每个传代，受限的聚集体被接种到在1lxuricellbag中的mtesr1(无y27632rock抑制剂)中。培养条件包括每分钟20次摇动、4度摇动角、37℃、5%co2。灌注条件被设计经100分钟从生物反应器除去30ml用过的培养基，接着在2分钟内加入30mlmtesr1(无y27632rock抑制剂)，这样每天使用用于重力沉降的管道组装，在非-灌注袋中补充一半的培养基。一部分聚集体在第4或5天通过用accutasetm分离至单细胞/小簇团进行传代。分离的细胞使用nucleocounternc200计数。在传代1，总共4.9x10^7个活细胞被接种和2.9x10^8个活细胞被回收，整个培养物的生存能力是92.9%，表示5.9-倍扩增(图37)。在传代2，总共1.45x10^8个活细胞被接种和1.11x10^9个活细胞被回收，整个培养物的生存能力是98.4%，表示7.7-倍扩增。经9天，存在总共45-倍扩增。聚集体在紧接限制后和在培养基(无y27632rock抑制剂)中扩增后的形态学显示于图38中。

连续传代后多能性的证实

在一个实施例中，ct2细胞作为悬浮液聚集体维持在6孔板中5次传代和在xuricellbags中3次传代。通过流式细胞术对于oct4、ssea4和tra-1-60表达，核型和来自胚体的3个胚层分化，分析扩增细胞。细胞在4%多聚甲醛中固定并在0.1%tritonx-100渗透，然后通过流式细胞术，使用与alexafluor647缀合的oct4抗体(bdpharmingen)和与r-藻红蛋白(pe)缀合的tra-1-60抗体(bdpharmingen)，或用与异硫氰酸荧光素(fitc)缀合的ssea4抗体(bdpharmingen或cellsignaling)分析。如在图8中所示的结果显示了多能性标记在作为在6孔板上的悬浮液聚集体的5次传代和作为在xuricellbags中的悬浮液聚集体的3次连续传代后的维持。图8a显示细胞的前向散射特性和侧散射特性，图8b显示oct4和tra-1-60的轴，图8c显示在xuricellbags的聚集体扩增3次传代中的oct4和tra-1-60表达，图8d显示同种型抗体染色，图8e显示ssea3的轴，图8f显示在xuricellbags中的聚集体扩增3次传代的ssea3表达。数据显示在摇动条件下，维持在6孔板和在xuricellbags中的悬浮液聚集体经多次传代的多能性的维持。

作为悬浮液聚集体在6孔板上的5次传代和作为悬浮液聚集体在xuricellbags中的3次传代扩增的ct2细胞显示如图8中所示的正常核型。在形成胚体聚集体后接种细胞以促进分化。分化的细胞在10%福尔马林中固定过夜，包埋在石蜡中，切成5-µm连续切片，和使用抗-甲胎蛋白(内胚层)、抗-平滑肌肌动蛋白(中胚层)和抗-微管蛋白iii(外胚层)执行免疫组织化学(ihc)染色。分化的细胞对所有的抗体染色阳性，证实在6孔板中5次传代和在xuricellbags中3次传代后作为悬浮液聚集体在连续传代期间的多能性维持(图8上小图)。

虽然本文仅说明和描述了本发明的某些特征，本领域技术人员将想到许多修饰和改变。因此，要理解所附权利要书打算覆盖所有落入本发明的真正精神内的这样的修饰和改变。