双抗蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的RNAi载体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学领域，本发明涉及一种双抗蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的RNAi载体，以及其在介导对蝴蝶兰建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒（ORSV）的抗性中的应用。本发明的双抗蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的RNAi载体，其序列如SeqIDNo：1所示。本发明应用于通过基因转化技术选育双抗两种病毒的蝴蝶兰新品种，可有效的防治蝴蝶兰生产上的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒，产生巨大的经济效益。
【专利说明】双抗蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的RNAi载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，本发明涉及一种双抗蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的RNAi载体，以及其在介导对蝴蝶兰建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)的抗性中的应用。
【背景技术】
[0002]蝴蝶兰(Phalaenopsis ssp.)为兰科蝴蝶兰属花丼，于1750年最早被发现,迄今已发现七十多个原生种，在中国台湾和泰国、菲律宾、马来西亚、印度尼西亚等地均有分布。蝴蝶兰因其花形优美，颜色华丽，为热带兰中的珍品，有“兰中皇后”之美誉，再加上耐贮运、宜于室内摆放、经济效益高等优点成为花卉业的新宠，蝴蝶兰盆花已成为全球重要的农业产业。近几年我国蝴蝶兰生产发展迅速，1997年大陆蝴蝶兰生产企业屈指可数，年上市量仅有20万株左右，而到2003年蝴蝶兰上市量超过1，000万株，产值达5亿元，2010年，我国蝴蝶兰年宵花上市量已达到2，610万株。
[0003]随着我国蝴蝶兰的大规模种植，病害也日趋严重。蝴蝶兰病毒病是蝴蝶兰上的一类重要病害，由于蝴蝶兰大多在生产上依靠组织培养进行无性繁殖，病毒在营养器官中不断积累，同时病毒还会通过组织培养和温室内植株管理造成的伤口进行传播，使蝴蝶兰病毒防治困难，严重影响蝴蝶兰的生长和观赏品质，并且欧美等国家对蝴蝶兰病毒检疫非常严格，带有病毒病的出口蝴蝶兰种苗和成品给我国出口企业造成巨大损失。目前生产上还没有有效的药物进行防治蝴蝶兰病毒病，只能通过淘汰病株和茎尖培养脱毒进行防治，但茎尖脱毒技术操作难度大，耗费大量的人力物力，脱毒效果有时并不理想，并且在扩繁和栽培过程中还会感染病毒，因此利用基因工程等技术选育蝴蝶兰抗病品种成为生产上的迫切需要。
[0004]目前，世界上已报导的兰花病毒有:建兰花叶病毒、齿兰环斑病毒、建兰轻性花叶病毒、建兰环斑病毒、番茄环斑病毒、万代兰花叶病毒、石斛兰花叶病毒、洋兰斑点病毒和黄瓜花叶病毒等10来种病毒，其中以建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus, CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus, ORSV)发生最为普遍。建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒是侵染蝴蝶兰的两种主要病毒病原。
[0005]CymMV 隶属线形病毒科、马铃薯X病毒属，线状粒子长475nm~490nm、直径13nm。ORSV隶属烟草花叶病毒属，杆状粒子长300nm、直径18nm。两种病毒可单独侵染或复合侵染兰科植物，引起花叶、坏死、叶脉褪绿、条斑等症状，复合侵染时可导致植株矮化，叶片畸形等重症，造成蝴蝶兰、石槲兰、大花惠兰、文心兰等多种热带兰及国兰产生严重病害，大大降低兰花的商品价值。我国报导兰花病毒始于1983年朱本明等从上海的兰花上分离到两种病毒，鉴定为建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒。沈淑琳(1990)对这两种病毒的生物、生化特性进一步系统研究，证实是我国兰花上最主要的病毒。
[0006]蝴蝶兰病毒主要通过介体或汁液传播。介体是重要的传播途径，可通过蚜虫、线虫、螨类等进行传播。汁液传播是通过叶片的相互摩擦，或人的组织培养和田间作业，使健康叶片造成微伤，导致病毒传播。通过上述两种途径使蝴蝶兰感染病毒，并通过组培扩繁传至下一无性世代，从而在蝴蝶兰营养体中长期积累，导致产量和品质下降。
[0007]RNA干扰(RNA interference, RNAi)是最近几年发展起来的一门新兴的在转录水平上的基因阻断技术。是一种双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程，也就是序列特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)。不同的有机体,包括植物、果蚬、线虫及一些哺乳动物大多能利用RNA干扰机制来抵御病毒及其他外来核酸的侵人。提示它可能是生物体的一种进化保守机制。同时也可能成为特异性沉默内源基因和基因功能分析的一个革命性工具。
[0008]根据一些实验结果推测RNAi发生的主要过程大致分为三个阶段:(I)起始阶段，dsRNA在细胞内被Rnase III (如Dicer)均匀切割成21_25nt大小的siRNA。dsRNA可以是外源的(如病毒RNA复制中间体或是人工导入的dsRNA)，也可以是内源的(如细胞中单链RNA在RNA依赖RNA聚合酶(RdRP)的作用下形成的dsRNA)。siRNA的长短是种族特异的，5’端是磷酸化的，3’端往往突出2个nts。(2)扩增阶段，siRNA与mRNA靶向性结合，并作为引物，在RdRP作用下再次形 成dsRNA，dsRNA又被切割成siRNA，新形成的siRNA又可以进入下一轮循环而达到扩增的目的。(3)效应阶段，SiNRA和内切核酸以及其他蛋白一切形成RISC(RNA induced silencing complex)。RISC的核酸部分起到革巴向性的作用，蛋白部分则起到降解mRNA的作用。RNAi的生物学意义就在于它起到了监视和抑制异常的或外源的遗传物质在细胞的存在，维持本身遗传物质的稳定性。
[0009]将病毒的某一序列设计成双链结构导进植物体使之表达，可诱发RNA沉默强化植物体内自然的RNA沉默抗病毒能力，这使得高抗病毒性的转基因植物的获得成为可能。Waterhouse等利用马铃薯Y病毒(PVY)蛋白酶基因片断构建IRS载体进行烟草转化，获得抗性植株。Wang等利用含有大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus, BYDV)PAV株系的复制酶基因片断构建成可产生发夹式RNA结构的载体，并将该载体导进大麦得到强抗性植株并得到稳定遗传。Kalantids等在转黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus, CMV) cDNA反向重复序列的再生烟草植株中检测到一个完全抗性的株系，并且证实烟草病毒抗性直接与siRNA的产生相关。同时接种病毒的转化植物体表现出敏感型、恢复型(表现症状但新长出的叶片无症状)、完全抗性3种表型。其中的敏感型尽管对病毒敏感，但症状要比对照轻得多。这三种表型除了说明RNA沉默信号在植物体内可以扩散产生系统性沉默外，还说明利用RNA沉默手段获得的抗性植株的抗性强度大小并不完全一致。
[0010]在RNA沉默抗病毒的方法研究上，Tenllado等观察了以直接注射和农杆菌介导转化两种方式将病毒dsRNA导进植物叶片细胞后的结果发现，两种方式都成功阻止了烟草蚀刻病毒(Tobacco etch virus, TEV)、辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus, PMMoV)和苜猜花叶病毒(Alfalfamosaic virus, AMV)的侵染过程。同时他们还将用于直接注射的dsRNA进行稀释处理发现dsRNA诱导的植物病毒抗性是dsRNA剂量依靠的，这与在动物上得出的结论一致。而Pandolfini等的实验结果表明，即使导进烟草的李痘病毒(Plumpoxvirus, PPV)基因组片断含有可剪切的内含子序列，在转化体中也可以检测到转化片断siRNA的存在，并表现出对PPV侵染的系统抗性。
【发明内容】
[0011]本发明所要解决的技术问题是，提供一种双抗蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的RNAi载体，使该载体通过农杆菌侵染转化蝴蝶兰后，可同时干扰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒外壳蛋白基因表达，可同时产生对蝴蝶兰建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)的抗性。
[0012]本发明的双抗蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的RNAi载体，其序列如Seq IDNo:1所示。
[0013]所述RNAi载体的构建过程是:分别选取建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒外壳蛋白基因(CP)中的保守序列(Seq ID No:2、Seq ID No:3);将两部分嵌合并构建反向重复序列(Seq ID No:4)，插入到内含子两端，克隆到双元植物表达载体pCAMBIA1301_220中，得到RNAi植物双元表达载体pRNA1-CP。
[0014]本发明构建的利用双抗蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的RNAi载体，选取建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒外壳蛋白基因(CP)中的保守序列，利用hpRNA沉默策略不仅可以获得较高抗性的转基因植株，而且由于不表达病毒蛋白，能减少人们对携带病毒基因的转基因作物安全性的顾虑，使种质创新目的性更强也更加安全有效；在高保守区段设计靶序列，并且只需20bp的同源序列就能引起病毒沉默，能避免病毒因非保守区的高突变率而产生的耐抗性突变株；同时还可以将建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒外壳蛋白基因序列串联起来而获得对建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒两个病毒的广谱抗性。本发明应用于通过基因转化技术选育双抗两种病毒的蝴蝶兰新品种，可有效的防治蝴蝶兰生产上的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒，产生巨大的经济效益。
【具体实施方式】
[0015]本发明实施例如下:
[0016]1、构建建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒外壳蛋白基因融合片段
[0017]分别根据NCBI数据库中建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒外壳蛋白基因设计引物(表 I),扩增长度为 238bp 和 380bp，分别利用引物 CyMVCP-SacIF/CyMVCP-R 和 0RSVCP-F/ORSVCP-KpnR,以含有建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的cDNA为模板，进行PCR扩增反应，扩增采用 50 μ L 体系:模板 2.5μ L,引物各 2.5μ L (10ymol/L), dNTP Mixture4.0 μ L (各
2.5mmol/L), 10 XPCR Buffer (Mg2+plus) 5.0 μ L, TaqE0.5 μ L, 33 μ L 灭菌超纯水补齐。扩增程序为:94°C预变性5min ;(94°C变性30s，55°C退火30s，72。。延伸lmin) 35个循环；72°C后延伸lOmin。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，用回收纯化试剂盒进行纯化去除引物及引物二聚体，回收目标条带。
[0018]利用融合PCR技术连接两个病毒外壳蛋白基因序列，在引物CyMVCP-Sac IF和ORSVCP-KpnR作用下，以回收后的产物为模板，进行PCR融合。融合采用50 μ L体系:模板各 2.5 μ L，引物各 2.5 yL (10ymol/L), dNTP Mixture4.0 μ L (各 2.5mmol/L)，10XPCRBuffer (Mg2+plus) 5.0 μ L, TaqE0.5 μ L, 30.5 μ L灭菌超纯水补齐。融合条件同以上PCR扩增程序。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，用回收纯化试剂盒进行纯化去除引物及引物二聚体，回收618bp的目标条带。[0019]表1PCR扩增所用弓丨物序列
[0020]
【权利要求】
1.一种双抗蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的RNAi载体，其序列如Seq ID No:1所示。
2.根据权利要求1所述的双抗蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的RNAi载体，其特征是:所述RNAi载体的构建过程是，分别选取建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒外壳蛋白基因中的保守序列Seq ID No:2、Seq ID No:3 ;将两部分嵌合并构建反向重复序列Seq ID No -A,插入到内含子两端，克隆到双元植物表达载体PCAMBIA1301-220中，得到RNAi植物双元表达载体pRNA1-CP。
3.权利要求1所述双抗蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的RNAi载体用于防治蝴蝶兰生产上的建 兰花叶病毒和齿兰环斑病毒。
【文档编号】A01H5/00GK103993033SQ201410049351
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年2月12日 优先权日:2014年2月12日
【发明者】言燕华, 王广东, 张昌伟, 韦武青, 马志虎 申请人:镇江市蔬菜研究所