本发明涉及生物技术育种领域，具体涉及一种突变小麦相关基因提高小麦产量的方法。
背景技术：
：：小麦是一种在世界各地广泛种植的禾本科植物，为世界上三大粮食作物之一。小麦的颖果是人类的主食，人类20％的能量消耗来自小麦。2010年，世界上小麦总产量6.51亿吨，仅次于玉米(8.44亿吨)，成为第二大粮食作物。虽然全球粮食逐年增产，但是随着人口的增长及耕地面积的减少，粮食短缺问题变成了一个全球性的现实问题。因此必须提高粮食产量才能应对全球粮食危机。小麦是具有分蘖成穗特性的作物，其单位面积产量由单位面积穗数、每穗粒数和粒重(一般用千粒重表示)，即产量“三因素”构成。在一定范围内每一个因素的增加，都可提高产量，其中千粒重又受籽粒长度、宽度、厚度、饱满度等因素的影响。技术实现要素：为了解决粮食短缺问题，本发明提供了一种提高小麦产量的方法。本发明所提供的提高小麦产量的方法，包括如下步骤：抑制小麦中gasr7蛋白的表达和/或活性，进而提高小麦产量。上述方法中，所述抑制gasr7蛋白表达的方法可以为使gasr7蛋白的编码基因功能降低或丧失。使gasr7蛋白的编码基因功能降低或丧失，可采用现有技术中的任何方式实现，以使基因产生缺失突变、插入突变或碱基变换突变，进而实现基因功能降低或丧失。使gasr7蛋白的编码基因功能降低或丧失具体可以采取化学诱变、物理诱变、rnai、基因组定点编辑、同源重组等方法。无论采取哪种方法，既可对gasr7蛋白的整个编码基因作为靶标，又可将调控gasr7基因表达的各个元件作为靶标，只要能实现基因功能丧失或降低即可。如可以将gasr7的编码基因的第1外显子、第2外显子、第3外显子作为靶标。上述基因组定点编辑方法中，可采用锌指核酸酶(zincfingernuclease,zfn)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease,talen)技术或成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/crisprassociated,crispr/cas9system)技术，以及其它能实现基因组定点编辑的技术。上述各种基因定点突变技术，在操作中具体可按照如下步骤进行：在小麦中表达特异于靶标片段的核酸酶，在核酸酶的作用下，所述靶标片段被剪切，再通过小麦的自身dna修复，完成对所述靶标片段的定点改造，进而实现使gasr7蛋白的编码基因功能降低或丧失。上述方法中，在小麦中表达特异于靶标片段的核酸酶的方法为：直接向小麦中导入核酸酶或向小麦中导入用于表达所述核酸酶的遗传物质。其中的遗传物质为dna质粒或dna线性片段或体外转录的rna。核酸酶指进行定点编辑的活性功能物质。上述在小麦中表达特异于靶标片段的核酸酶的方法中还可包括如下步骤：将导入所述核酸酶或所述遗传物质后的小麦在无选择压力的情况下种植生长，所述核酸酶或未整合在小麦染色体上的所述遗传物质被细胞降解。在无选择压力情况下，植物自身的防御机制会抑制外源基因的进入并将已进入的外源基因降解。因而，将导入所述核酸酶或所述遗传物质后的小麦进行种植生长，外源基因(包括用于表达特异于所述靶标片段的核酸酶的质粒或成套质粒上的任何片段)不会整合入小麦基因组中，最终获得的小麦为非转基因的定点改造小麦。当使用crispr/cas9方法时，相应的，所述遗传物质为能转录向导rna和表达cas9蛋白的重组载体或dna线性片段；或所述遗传物质由能转录向导rna的重组载体或dna线性片段(或分别转录crrna和tracrrna的两个重组载体或dna线性片段)，以及能表达cas9蛋白的重组载体或dna线性片段或rna组成；或所述遗传物质由向导rna，以及能表达cas9蛋白的重组载体或dna线性片段或rna组成；所述向导rna为由crrna和tracrrna通过部分碱基配对结合而成的具有回文结构的rna；所述crrna含有能够与所述靶标片段互补结合的rna片段。在所述重组载体中，启动所述向导rna的编码核苷酸序列转录的启动子可为u3启动子或者u6启动子。当使用talen核酸酶时，所述用于表达特异于所述靶标片段的核酸酶的遗传物质可为同时表达成对talen蛋白的重组质粒，或同时表达成对talen蛋白的dna线性片段；或同时表达成对talen蛋白的rna；所述talen蛋白由能够识别所述靶标片段并与其结合的dna结合域和foki结构域组成；当使用锌指核酸酶时，所述用于表达特异于所述靶标片段的核酸酶的遗传物质可为同时表达成对zfn蛋白的重组质粒，或同时表达成对zfn蛋白的dna线性片段；或同时表达成对zfn蛋白的rna；所述zfn蛋白由能够识别所述靶标片段并与其结合的dna结合域和foki结构域组成。本发明的具体例子中采用了crispr/cas9技术，其中涉及的靶序列为seqidno.1，使用的向导rna序列为seqidno.2。进一步具体的，本发明中使用了如下能转录向导rna的重组载体：将seqidno.3和seqidno.4所示片段进行退火，然后与经bbsi酶切的ptau6-grna载体骨架相连，得到重组载体，记作ptau6-grna-c5。当使用该载体时需与pjit163-ubi-cas9载体联合使用，才能实现上述发明目的。本发明中所述的提高小麦产量具体可为增加小麦的千粒重。上述方法适用于任何小麦，只要含有上述靶序列即可，本发明列举的例子是普通小麦(triticumaestivuml.aabbdd,2n＝6x＝42)或四倍体小麦(triticumturgiduml.var.durum,aabb,2n＝4x＝28)。由于小麦是多倍体植物，因此上述方法改造后得到的小麦可以是所有染色单体均被定点编辑的小麦，也可以是部分染色单体被定点编辑的小麦。本发明还提供了实现上述方法的一种工具，即用于提高小麦产量的试剂盒。本发明所提供的提高小麦产量的试剂盒，包括如下任一种：(1)grna分子：其序列如seqidno.2所示；(2)所述grna的编码dna分子；(3)表达所述grna的载体；(4)按照如下方法制备得到的重组载体：将seqidno.3和seqidno.4所示片段进行退火，然后与经bbsi酶切的ptau6-grna载体骨架相连，得到重组载体，记作ptau6-grna-c5。本发明通过基因组定点编辑技术同时突变普通小麦tagasr7基因的三个位点(即同时敲除tagasr7-a基因、tagasr7-b基因和tagasr7-d基因)，得到的纯合株即为高产小麦。本发明创制了具有较大千粒重的小麦种质和品种，丰富了小麦高产的材料。附图说明图1为小麦gasr7基因靶位点的grna/cas9在小麦原生质体中的活性检测。图2为用pcr/re检测grna/cas9介导的普通小麦“bobwhite”gasr7基因的t0代突变体以及测序结果。图3为用pcr/re检测grna/cas9介导的普通小麦“科农199”gasr7基因的t0代突变体以及测序结果。图4为pcr/re检测grna/cas9介导的四倍体小麦gasr7基因的t0代突变体以及测序结果。图5为不同组合类型的gasr7基因的纯合突变体的基因型。图6为不同组合类型的gasr7基因的纯合突变体小麦种子千粒重统计结果。图4中，a表示bobwhite千粒重统计表(8次重复)，b表示科农199千粒重统计表(10 次重复)。图4a中，基因型：1：tagasr7-aa；2：tagasr7-bb；3：tagasr7-dd；4：tagasr7-aabb；5：tagasr7-aadd；6：tagasr7-aabbdd；7：tagasr7-aabbdd；8：gasr7a过表达；9：gasr7b过表达；10：野生型。图4b中，kn-wt表示野生型；kn-ko:tagasr7-aabbdd。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。表达载体ptau6-grna在文献“shan,q.etal.targetedgenomemodificationofcropplantsusingacrispr-cassystem.naturebiotechnology31:686-688,(2013)”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。表达载体pjit163-ubi-cas9在文献“wang,y.etal.simultaneouseditingofthreehomoeoallelesinhexaploidbreadwheatconfersheritableresistancetopowderymildewnaturebiotechnology32,947-95(2014)”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。小麦品种bobwhite在文献“souzaetal.parentageanalysisofinternationalspringwheatyieldnurseries.cropsci.38:337–341，(1998)”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。小麦品种“科农199”在文献“李俊明；张相岐；张爱民；王志国；安调过；纪军；王静.高产广适小麦新品种—科农199.麦类作物学报.368-368(2007)”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。实施例1、小麦tagasr7靶位点的选择并构建敲除载体一、靶序列的设计普通小麦(triticumaestivuml.)是六倍体植物，大部分基因都以多个拷贝的形式分布在基因组a、基因组b和基因组d组上。小麦gasr7基因在基因组a、基因组b和基因组d上都有分布，分别命名为tagasr7-a1基因、tagasr7-b1基因和tagasr7-d1基因(图1a.tagasr7-a1基因、tagasr7-b1基因和tagasr7-d1基因又被称为小麦gasr7基因的三个位点)。tagasr7-a1(genbankaccessionnumber：kj000052)tagasr7-b1(genbankaccessionnumber：kj000053)tagasr7-d1(genbankaccessionnumber：kj000054)靶序列如下：target-c5：5’-ccgccgggcacctacggcaac-3’(seqidno.1)；二、grna的设计根据靶序列，设计grna，其序列为seqidno.2。三、重组质粒的构建合成下述带有粘性末端(下划线部分)的单链引物：c5f：5’-cttgttgccgtaggtgcccgg-3’(seqidno.3)；c5r：5’-aaacccgggcacctacggcaa-3’(seqidno.4)经过引物退火程序形成有粘性末端的双链dna，插入到ptau6-grna质粒的两个bbsi酶切位点之间，即得含有c5的ptau6-grna质粒。质粒经测序验证阳性质粒，即在ptau6-grna质粒的酶切位点bbsi处正向插入5’-cttgttgccgtaggtgcccgg-3’所示dna片段后得到的重组质粒为阳性，命名为ptau6-grna-c5。在小麦细胞中，当pjit163-ubi-cas9载体和ptau6-grna-c5质粒同时存在时，ptau6-grna-c5质粒会表达出grna，grna引导cas9蛋白在靶序列区域进行切割，产生一个双链断裂的缺口，细胞自发修复该缺口的过程中会引入大量突变(本处“突变”指的是广义突变，包括插入、缺失、狭义突变等形式，这些突变使基因功能失活)。上述靶序列中存在一个bcni酶切识别序列，可以被限制性内切酶bcni切割。靶序列如果没有发生突变，可以被限制性内切酶bcni切割；如果发生了突变，则bcni酶切识别序列被破坏，将不能被限制性内切酶bcni切割。实施例2、转化小麦原生质体及检测重组载体在原生质体中的活性将pjit163-ubi-cas9载体和ptau6-grna-c5质粒导入至小麦原生质体中，然后提取原生质体的基因组dna，用通用引物通过pcr扩增tagasr7基因，然后将pcr扩增产物进行bcni单酶切(如果pcr扩增产物不能被切开，说明实施例1设计的ptau6-grna-c5有活性)，将不能被酶切的pcr扩增产物进行测序。用于扩增tagasr7基因的引物对如下：上游引物：ggaggtgatgggaggtggggg下游引物：ctgggagggcaattcacatgccabcni单酶切及部分测序结果见图1b。结果表明，实施例1设计的ptau6-grna-c5有较高活性，对tagasr7基因具有较高的定点敲除活性。实施例3、转化小麦及表型鉴定一、转化将质粒pjit163-ubi-cas9和ptau6-grna-c5质粒通过基因枪转化的方法分别导入小麦品种“科农199”和小麦品种“bobwhite”中。将得到转基因小麦利用通用引物 扩增tagasr7基因，然后将pcr扩增产物进行bcni单酶切，含有未切开条带的小麦即为突变体小麦。设计tagasr7基因的a、b、d基因组上的特异引物，对突变体小麦利用特异性引物进行pcr扩增及酶切，进一步确定突变在a、b、d基因组上的具体发生位置。然后再进行测序验证。用于扩增tagasr7-a1基因的引物对如下：上游引物：ccttcatccttcagccatgcat；下游引物：ccactaaatgcctatcacatacg用于扩增tagasr7-b1基因的引物对如下：上游引物：ccttcatccttcagccatgcat；下游引物：agggcaattcacatgccactgat用于扩增tagasr7-d1基因的引物对如下：上游引物：ccttcatccttcagccatgcat；下游引物：cctccatttttccacatcttagtcc在“bobwhite”的t0代，得到小麦gasr7基因发生定点突变的转基因植株，其中包括只有tagasr7-a1基因发生定点突变的植株，只有tagasr7-b1基因发生定点突变的植株，只有tagasr7-d1基因发生定点突变的植株，tagasr7-a1基因和tagasr7-b1基因同时发生定点突变的植株，tagasr7-a1基因和tagasr7-d1基因同时发生定点突变的植株，tagasr7-b1基因和tagasr7-d1基因同时发生定点突变的植株，tagasr7-a1基因、tagasr7-b1基因和tagasr7-d1基因同时发生定点突变的植株(部分t0代转基因植物提取基因组dna并进行bcni酶切的结果见图2a，部分测序结果见图2b)。在“科农199”的t0代，得到小麦gasr7基因发生定点突变的转基因植株，其中包括tagasr7-b1基因和tagasr7-d1基因同时发生定点突变的植株，tagasr7-a1基因、tagasr7-b1基因和tagasr7-d1基因同时发生定点突变的植株。(部分t0代转基因植物提取基因组dna并进行bcni酶切的结果见图3a，部分测序结果见图3b)。将质粒pjit163-ubi-cas9和ptau6-grna-c5质粒通过基因枪转化的方法分别导入四倍体小麦品种“石麦11”和小麦品种“豫麦”中。将得到转基因小麦利用通用引物扩增tagasr7基因，然后将pcr扩增产物进行bcni单酶切，含有未切开条带的小麦即为突变体小麦。对突变体小麦利用特异性引物进行pcr扩增及酶切，进一步确定突变在a、b基因组上的具体发生位置。然后再进行测序验证。在“石麦11”的t0代，得到tagasr7-a1基因、tagasr7-b1基因同时发生定点突变的植株(t0代转基因植物提取基因组dna并进行bcni酶切及测序结果见图4a)。在“豫麦”的t0代，得到tagasr7-a1基因、tagasr7-b1基因同时发生定点突变的植株(t0代转基因植物提取基因组dna并进行bcni酶切及测序结果见图4b)。将“bobwhite”的t0代转基因植株自交，得到t1代植株，其中包括tagasr7-a1基因发生定点突变的纯合株(tagasr7-aa)，tagasr7-b1基因发生定点突变的纯合株(tagasr7-bb)，tagasr7-d1基因发生定点突变的纯合株(tagasr7-dd)，tagasr7-a1基因和tagasr7-b1基因同时发生定点突变的纯合株(tagasr7-aabb)，tagasr7-a1基因和tagasr7-d1基因同时发生定点突变的纯合株(tagasr7-aadd)，tagasr7-b1基因和tagasr7-d1基因同时发生定点突变的纯合株(tagasr7-bbdd)，tagasr7-a1基因、tagasr7-b1基因和tagasr7-d1基因同时发生定点突变的纯合株(tagasr7-aabbdd)。不同类型的突变体酶切结果见图5a。同时构建过表达载体，(载体构建见图5b)获得tagasr7-a1基因和tagasr7-b1基因过表达的突变体。二、表型观察将上述7种“bobwhite”的t2代纯合突变体种子、tagasr7-a1基因、tagasr7-b1基因过表达的t1代突变体种子及“bobwhite”野生型种子在大田中播种，同时播种“科农199”的三位点突变的纯合突变株种子及“科农199”野生型种子，正常条件下生长收获，得到的后代种子进行表型测定，测得的千粒重如图6所示(“bobwhite”共8次重复，“科农199”共10次重复)。小麦品种“bobwhite”的各个单位点突变的纯合突株(tagasr7-aa,tagasr7-bb,tagasr7-dd)、各个双位点突变的纯合突变株(tagasr7-aabb,tagasr7-aadd，tagasr7-bbdd)千粒重与野生型植物相比无显著差异；三位点突变的纯合突变株(tagasr7-aabbdd)千粒重与野生型植物相比，有非常显著的增加；tagasr7-a1基因过表达的突变体千粒重与野生型植物相比，有非常显著的减小；tagasr7-b1基因过表达的突变体千粒重与野生型植物相比有显著的减小。小麦品种“bobwhite”的三位点突变的纯合突变株(tagasr7-aabbdd)是由图2b中的t0-2和t0-5分别自交2代得到的。在“科农199”中，三位点突变的纯合突变株(tagasr7-aabbdd)千粒重与野生型植物相比有显著的增加，进一步证实了tagasr7基因负调控种子的千粒重。小麦品种“科农199”的三位点突变的纯合突变株(tagasr7-aabbdd)是由图3中的t0-9、t0-10自交2代得到的。相对于野生型小麦来说，tagasr7-a1基因发生功能缺失突变的纯合株(单位点突变)、tagasr7-b1基因发生功能缺失突变的纯合株(单位点突变)、tagasr7-d1基因发生功能缺失突变的纯合株(单位点突变)、tagasr7-a1基因和tagasr7-b1基因同时发生功能缺失突变的纯合株(双位点突变)、tagasr7-a1基因和tagasr7-d1基因同时发生功能缺失突变的纯合株(双位点突变)、tagasr7-b1基因和tagasr7-d1基因同时发生功能缺失突变的纯合株(双位点突变)的千粒重无显著变化，而tagasr7-a1基因、 tagasr7-b1基因和tagasr7-d1基因同时发生功能缺失突变的纯合株(三位点突变)，其千粒重表现出明显的增加(图6)。小麦中，tagasr7-a基因、tagasr7-b基因和tagasr7-d基因单个位点的突变或其中两个位点的突变均不能显示千粒重增加的表型，只有3个位点同时发生突变时才会显示千粒重增加的表型。当前第1页12当前第1页12