一种肺结核相关的尿液生物标志蛋白及其应用的制作方法

本发明属于生化免疫分析
技术领域：
，具体涉及一种肺结核相关尿液生物标志蛋白及其应用。
背景技术：
：结核病是由结核杆菌复合群引起的一种人畜共患病，具有较高的感染率和死亡数，被列为继hiv之后全世界引起死亡的第二大传染病。未能控制结核病的蔓延在很大程度是因为未能充分检测(从而有效治疗)感染病例。因此，世界卫生组织的全球遏制结核病计划的一大重点是发展简单，低成本和有效的新型诊断方法，以改善现有的检测情况。在资源有限的情况下，主动诊断结核病。主要依靠临床评估，并结合显微镜镜检痰涂片；从临床样品中分离培养结核分枝杆菌一直是结核病诊断金标准，然而，这一标准昂贵、耗时、检出率低，且需要较严格的生物安全设施。因此，寻找结核病新型诊断标识是研究结核病防治的重要领域。目前由于缺乏可靠和经过验证的mtb生物标记物阻碍了结核病诊断方法的发展。因此理想的结核实验室诊断方法应具备以下几点：(1)灵敏性和特异性高；(2)成本低；(3)能够早期发现及治疗预后监测；(4)检测谱广，包括可以检测出涂片镜检阴性或耐药病例；(5)取样简单，最好能无损伤取样；(6)检测方便，有利于对结核进行野外及家庭医疗服务。正常情况下，尿液中蛋白质极少，因此，尿液中蛋白质种类和数量变化有与疾病发生、发展及预后有关；同时，尿液能够无创地大量获得,并且相对于其它生物液体而言比较稳定,因此尿蛋白质组学正在成为临床蛋白质组学研究中的一项重要内容，为它在科学研究和临床上的应用打下良好的基础。在本发明中,二维电泳和免疫印迹分析表明,肺结核和健康人尿液中rbp4蛋白有显著差异表达,这表明这些蛋白质可以作为肺结核尿液的潜在生物标识物。rbp4蛋白功能意义重大,因为这种物质可能参与了巨噬细胞激活；rbp4也被认为是作为脂肪因子用于抵抗胰岛素,这可能在细菌感染过程中调节病理生理过程。且有报道显示rbp4参与在免疫应答中起重要作用，然而本领域仍不知道其对肺结核病免疫的具体影响情况，还没有其在肺结核患者尿液中的研究和开发。技术实现要素：本发明目的在于克服现有技术的缺陷，即利用尿蛋白的疾病特异性，提供一种检测肺结核有关尿液生物标志蛋白，该标志蛋白可用于肺结核患者尿蛋白生物标识物，建立肺结核患者尿蛋白视黄醇结合蛋白(retinol-bindingprotein4，rbp4，序列见seqidno：1)表达，为肺结核及时诊断和治疗提供支持。本发明首次发现尿蛋白尤其是视黄醇结合蛋白作为一个重要的生物学指标，在结核临床诊断，鉴别诊断，有效观察中具有标志蛋白的作用，为以后结核患者尿蛋白的研究提供了理论依据，并为从分子水平诊断结核提供新的思想，具有重大的理论意义和潜在的使用价值。本发明通过以下技术方案实现：一种肺结核尿蛋白的检测方法，包括以下步骤：利用tca/丙酮法提取肺结核患者和健康人对照尿液中的总蛋白，并用蛋白质定量试剂盒(bio-rad,usa)进行定量。采用二维电泳[1]，madel-tof-ms和免疫沉淀方法[1]对肺结核患者和健康人对照已提取的尿蛋白进行分离鉴定，分析表达差异蛋白，鉴定可用于肺结核患者诊断的尿液标志蛋白质。本发明首次发现一种尿蛋白视黄醇结合蛋白(retinol-bindingprotein4,rbp4，p02753-human)作为一个重要的尿液生物学检测指标，在肺结核病的诊断，鉴别诊断，有效观察中的作用，为今后肺结核病尿蛋白的研究提供了依据，并从尿液蛋白分子水平诊断肺结核病提供新方向，具有重要的理论价值和潜在实用意义。本发明制备的肺结核病尿蛋白生物标志蛋白可在制备肺结核病尿液检测试剂盒中应用。附图说明序列表seqidno：1是本发明分离的尿蛋白视黄醇结合蛋白rbp4的蛋白质序列。图1：尿蛋白在肺结核患者和健康对照者中的差异表达。图2：肺结核患者和健康对照者尿蛋白的聚类分析。图3：免疫沉淀验证rbp4在肺结核患者和健康对照者中的差异表达。具体实施方式实施例1对rbp4蛋白在肺结核病人中筛查实施例(1)尿液标准的搜集与制备尿液样本来自于武汉市医疗救治中心，根据临床诊断、x影像、痰菌培养等各种手段， 确定为活动性肺肺结核病，且排除掉爱滋病、泌尿道疾病的新收治的病人。先后收集了76人，每次每人收集30-50ml晨尿中段尿液。同时收集健康对照尿液样本。(2)尿液样本处理和蛋白提取方法的优化进行了样本处理条件的优化，确定的处理程序是：尿液样本加入蛋白酶抑制剂(购自罗氏公司)，离心去除细胞碎片和杂质，3kda滤膜超滤浓缩，用tca-丙酮法[2]沉淀蛋白，透析除盐得到提纯蛋白，达到二维电泳蛋白上样标准。(3)尿蛋白二维电泳对胶条ph范围、上样缓冲液，胶条平衡液、等点聚焦程序，sds-page浓度和电压进行了条件优化，最后确定利用ph3-10非线性、ph4-7线性胶条进行二维电泳；上样缓冲液的制备:8m尿素,2m硫脲,0.5％(w/v)丙磺酸内盐，0.52％(w/v)两性电解质(ph310),60mm二硫苏糖醇,40mm的三羟甲基氨基甲烷和0.01％溴酚蓝；胶条平衡液为母液加2％(w/v)二硫苏糖醇和2.5％(w/v)碘乙酰氨,各平衡15min；选取10％sds-page；sds-page电压50v、30min，200v、6h；等点聚焦程序如表1。表1尿蛋白二维电泳程序程序电压时间水化50v16hs1250v3hs21000v6hs310000v3hs410000v60000vhs5500v8h肺结核患者和对照组人群尿蛋白分别做二维电泳，采用pdquest8.0(bio-rad)软件分析差异蛋白对其进行madel-tof-ms分析，获得19个蛋白序列，进行了生物信息学分析和鉴定，获得1个具有潜在标识意义的宿主蛋白并对这个差异尿蛋白(retinol-bindingprotein4,rbp4，其序列见seqidno：1；p02753-human)(4)利用免疫沉淀技术进行验证收集25个肺结核患者(5人一组，共5组)和25个健康人(5人一组，共5组)的尿液，均匀混合浓缩处理,进行westernblot分析，实验验证rbp4蛋白在肺结核病人尿液中的 差异表达，并利用imagej软件进行统计学分析。结果见图3。5.试验结果1)研究对象的一般特征，结果见表2。表2病例-对照人群特征分布2)rbp4蛋白在肺结核患者和对照组中的表达水平及其对肺肺结核病的诊断价值：如图1：本发明共对29例肺结核病患者和7例健康对照者中用二维电泳和madel-tof-ms验证这种尿蛋白。采用pdquest8.0(bio-rad)软件分析差异蛋白对其进行madel-tof-ms分析，获得19个蛋白序列，进一步进行了生物信息学分析和免疫沉淀技术鉴定，本发明获得rbp4具有潜在标识意义的宿主蛋白，同时对rbp4蛋白进行了差异分析。结果显示这rbp4尿蛋白的表达水平在两组之间均存在显著差异。在imagej灰度分析免疫沉淀验证中，rbp4尿蛋白在肺结核病患者中的表达高于健康对照者3.82倍。将依托本发明的标识蛋白获得的检测结果进一步说明本尿蛋白的指标对肺结核病的筛查具有一定的诊断价值，例如本发明的蛋白可以用来制备检测肺结核病的诊断试剂盒中作为抗原蛋白的应用。实施例2本发明的rbp4蛋白在的夹心elisa在制备检测肺结核病的诊断试剂盒中的应用1.rbp4蛋白的克隆表达根据本发明公开的seqidno：1所示的序列，克隆rbp4基因，并在大肠杆菌中表达，获得靶抗原蛋白；进一步利用亲合层析(按常规方法)提取重组蛋白，获得纯化的重组靶抗原rrbp4(或称重组蛋白rrbp4)；2.重组蛋白rrbp4的单克隆抗体和多克隆抗体制备按常规方法(参见文献3,4)制备抗体，包括：将纯化rrbp4免疫家兔，获得兔抗rbp4抗体；同时免疫小鼠，获得鼠抗rbp4单克隆抗体(单克隆抗体和多克隆抗体的制备方法参考：朱立平等，《免疫学常用实验方法》，人民军医出版社，2000版中报道的方法以及薛庆善，《体外培养的原理与技术》，科学出版社，2001年版中报道的方法)；3.建立检测rbp4的夹心elisa将鼠抗rrbp4的单克隆抗体包被elisa，用5％脱脂奶封闭，含有rbp4的尿液或其它体液为待测样本，兔抗rrbp4为检测抗体，hrp-羊抗兔(商业化试剂)为二抗，tmb/h2o2为底物，hf终止反应，用酶标仪在波长630nm处检测光密度值(od630)。用上述纯化的rrbp4作标准曲线，以健康阴性人尿蛋白平均值±2～3sd作为阈值，建立尿液rbp4检测夹心elisa，进一步组装成试剂盒。试剂盒组份如下：(1)酶联板一块(包被有鼠抗rrbp4多克隆抗体)(2)rrbp4阳性标准品(冻干品)(3)样品稀释液(常规配方)和洗涤液(常规配方)(4)兔抗rrbp4多克隆抗体(5)hrp-羊抗兔二抗(6)显色液(常规配方)和终止液(常规配方)参考文献：1.rembertpieper,christinel.gatlin,etal(2004)characterizationofthehumanurinaryproteome:amethodforhigh-resolutiondisplayofurinaryproteinsontwo-dimensionalelectrophoresisgelswithayieldofnearly1400distinctproteinspots.proteomics,4:1159–1174.2.chih-minglu1,yu-jenwuetal(2011)identificationoflow-abundanceproteinsviafractionationoftheurineproteomewithweakanionexchangechromatography.proteomescience,9:17.3.朱立平等，《免疫学常用实验方法》，人民军医出版社，2000版.4.薛庆善，《体外培养的原理与技术》，科学出版社，2001年版。当前第1页12