一种哺乳动物细胞无血清培养基的制作方法

本发明属于哺乳动物细胞培养领域，涉及一种哺乳动物细胞无血清培养基及其用途。

背景技术：

体外培养动物细胞时，通常需要在培养基中加入血清，用于提供细胞生长所需的营养物质及生长环境，但血清存在价格昂贵、极易感染病毒或支原体、成分复杂不利于进行细胞产品的分离纯化等诸多缺点。随着现代生物技术的发展，科学家们开始寻求一种新的替代培养基——无血清培养基。

无血清培养基(serumfreemedium,sfm)，是指在基础细胞培养基基础上，添加成分完全确定或部分确定的血清替代成分形成的培养基，适合大规模生产，被广泛应用于细胞生物学、药理学、肿瘤学领域。

中国仓鼠卵巢细胞，又称cho细胞(chinesehamsterovary)，具有不死性，可以传代百代以上，在生物工程上被广泛作为外源基因的宿主，用于基因工程制药。为了商业化生产蛋白药物，开发成分明确、能够有效提高细胞密度和蛋白表达量的cho细胞无血清培养基非常必要。

目前已有cho细胞用的无血清培养基报道，例如公告号为cn1696283a的专利公开了一种用于cho细胞培养的无血清培养基，但培养基中的胰岛素等动物蛋白含量较高，无血清培养基的配制成本高、后期产物纯化的难度增加。国际上也有商业化的无血清培养基，但其价格高昂，且配方保密，生产成本高。

因此，开发成分明确、价格低廉的cho细胞无血清培养基对实现cho细胞工业化生产具有重要的实际意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种成分明确、价格低廉，能够有效提高细胞密度和蛋白表达量的无血清培养基。

本发明提供了一种哺乳动物细胞无血清培养基，它是由基础细胞培养基和添加物组成，所述添加物为乙醇胺、丁酸钠、转铁蛋白、维生素、氨基酸和微量元素；所述乙醇胺的终浓度为9.88-10.12mg/l，所述丁酸钠的终浓度为9.73-10.27mg/l，所述转铁蛋白的终浓度为1.86-2.14mg/l。

基础细胞培养基：指仅能维持细胞生存基本营养需求的培养基，例如rpmi1640、dmem/f12、m199培养基。

其中，所述维生素是终浓度为0.2mg/l的生物素、2.46-2.71mg/l的叶酸、0.25-0.35mg/l的核黄素、2.18-2.36mg/l的泛酸钙、8.77-9.14mg/l的氯化胆碱、12.39-12.81mg/l的肌醇、1.92-2.12mg/l的烟酰胺、0.88-1.12mg/l的维生素b6以及0.56-0.80mg/l的维生素b12。

其中，所述氨基酸是终浓度为13.5-16.5mg/l的甘氨酸、8.6-11.4mg/l的l-丙氨酸、38-42mg/l的l-谷氨酸、95-105mg/l的l-谷氨酰胺、28-32mg/l的l-精氨酸、37-43mg/l的l-组氨酸、36-44mg/l的l-亮氨酸、57-63mg/l的l-异亮氨酸、68-72mg/l的l-丝氨酸、76-84mg/l的l-苏氨酸、38-42mg/l的l-酪氨酸、57-63mg/l的l-赖氨酸、56-64mg/l的l-蛋氨酸、68-72mg/l的l-苯丙氨酸、37-43mg/l的l-脯氨酸、67-73mg/l的l-色氨酸、68-72mg/l的l-缬氨酸、26-34mg/l的l-天冬氨酸以及55-65mg/l的l-天冬酰胺。

其中，所述微量元素是终浓度为0.47-0.53mg/l的七水硫酸亚铁、0.0007-0.0013mg/l的四水硫酸锰、1.82-2.18mg/l的七水硫酸锌、0.0018-0.0022mg/l的亚硒酸钠、0.007-0.013mg/l的七钼酸铵、0.0017-0.0023mg/l的五水硫酸铜、0.018-0.022mg/l的六水氯化镍以及0.9-1.1mg/l的二水氯化亚锡。

其中，所述基础细胞培养基为dmem/f12培养基。

进一步地，所述乙醇胺的终浓度为10mg/l，所述丁酸钠的终浓度为10mg/l，所述转铁蛋白的终浓度为2mg/l；

所述维生素是终浓度为0.2mg/l的生物素、2.65mg/l的叶酸、0.3g/l的核黄素、2.24mg/l的泛酸钙、8.98mg/l的氯化胆碱、12.60mg/l的肌醇、2.02mg/l的烟酰胺、1mg/l的维生素b6以及0.68mg/l的维生素b12；

所述氨基酸是终浓度为15mg/l的甘氨酸、10mg/l的l-丙氨酸、40mg/l的l-谷氨酸、100mg/l的l-谷氨酰胺、30mg/l的l-精氨酸、40mg/l的l-组氨酸、40mg/l的l-亮氨酸、60mg/l的l-异亮氨酸、70mg/l的l-丝氨酸、80mg/l的l-苏氨酸、40mg/l的l-酪氨酸、60mg/l的l-赖氨酸、60mg/l的l-蛋氨酸、70mg/l的l-苯丙氨酸、40mg/l的l-脯氨酸、70mg/l的l-色氨酸、70mg/l的l-缬氨酸、30mg/l的l-天冬氨酸以及60mg/l的l-天冬酰胺；

所述微量元素是终浓度为0.5mg/l的七水硫酸亚铁、0.001mg/l的四水硫酸锰、2mg/l的七水硫酸锌、0.002mg/l的亚硒酸钠、0.01mg/l的七钼酸铵、0.002mg/l的五水硫酸铜、0.02mg/l的六水氯化镍以及1mg/l的二水氯化亚锡。

本发明还提供了上述无血清培养基在哺乳动物细胞培养中的用途。

其中，所述细胞为中国仓鼠卵巢细胞。

其中，所述细胞为表达人肿瘤坏死因子受体-人igg-fc抗体融合蛋白的中国仓鼠卵巢细胞。

通常，动物细胞的生长均有赖于血清的存在，在普通培养基中，如果不加血清，绝大部分细胞不能增殖，但是用血清培养存在极易感染病毒等问题。而一般的无血清培养基虽然能够避免使用血清带来的种种风险，但很难维持细胞的良好生长、繁殖及蛋白表达。

而本发明提供的无血清培养基，可有效提高哺乳动物细胞尤其是cho细胞密度，大大提高rhtnfr:fc重组cho细胞的目标蛋白表达量，适合cho细胞生长和产物表达，效果与有血清培养基相当，完全可以替代有血清培养基；而且本发明无血清培养基的成分明确、蛋白含量低，生产成本较低，具有良好的工业应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1不同培养基对rhtnfr:fc重组cho细胞密度的影响图，不同小写字母表示差异显著。

图2不同培养基对rhtnfr:fc重组cho细胞蛋白表达量的影响图，不同小写字母表示差异显著。

图3本发明培养基与有血清培养基的对比结果图。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

本发明所用的试剂、仪器如下：

cho细胞株：cho-s，购自invitrogen公司；

表达人肿瘤坏死因子受体-人igg-fc抗体融合蛋白的cho细胞系(即rhtnfr:fc重组cho细胞)：购自安必奇生物科技有限公司；

dmem/f12培养基(无血清)：购自hyclone公司；

蛋白表达量检测用标准品购自美国安进公司；

其它试剂均为市售。

实施例1本发明无血清培养基的制备

本发明无血清培养基是在dmem/f12培养基基础上，添加表1的成分组成。其中，表1各成分的浓度均按照最终细胞培养基的总体积计。

表1本发明无血清培养基的添加物

将表1各成分添加到dmem/f12培养基后，混匀，用millipore公司0.22um滤膜过滤除菌，然后在4℃冰箱中保存备用。

以下用试验例的方式说明本发明的有益效果：

试验例1本发明无血清培养基用于细胞培养

取本发明无血清培养基(按照实施例1方法制备的无血清培养基)50ml置于100ml体积的摇瓶中；将cho-s细胞以密度为5*10⁵个/ml接种到摇瓶中，在37℃，5％co2培养箱中培养，即可。

试验例2本发明无血清培养基用于细胞培养

取本发明无血清培养基(按照实施例1方法制备的无血清培养基)50ml置于100ml体积的摇瓶中；将rhtnfr:fc重组cho细胞以密度为5*10⁵个/ml接种到摇瓶中，在37℃，5％co2培养箱中培养，即可。

试验例3不同无血清培养基的效果比较

一、试验材料

培养基a：按照实施例1方法制备的无血清培养基；

培养基b：将培养基a中终浓度为10mg/l的乙醇胺，替换为终浓度为10mmol/l的磷脂酰胆碱；其它同培养基a；

培养基c：将培养基a中终浓度为10mg/l的乙醇胺，替换为终浓度为0.05％(v/v)脂肪乳剂，其它同培养基a；

培养基d：将培养基a中终浓度为10mg/l的乙醇胺去除，其它同培养基a。

二、试验方法

取不同无血清培养基50ml分别置于不同100ml体积的摇瓶中；将rhtnfr:fc重组cho细胞以密度为5*10⁵个/ml接种到摇瓶中，在37℃，5％co2培养箱中，100r/min悬浮振荡培养，连续培养9天，检测细胞密度及目标蛋白(rhtnfr:fc)表达量。

细胞密度检测方法：血球计数板计数，每天计数一次。

目标蛋白表达量的检测方法：培养9天后，采用亲和层析hplc法，流动相为20mmol/ltrisph7.0,上样用流动相洗脱，流速3ml/min,进样20μl。利用标准品在此条件下吸收峰面积与浓度绘制标准曲线，得到标准曲线方程，然后通过将待测目标蛋白的吸收峰带入，计算得到待测目标蛋白的含量。

三、试验结果

不同无血清培养基培养的cho细胞密度见图1；rhtnfr:fc蛋白表达量见图2。

由图1可以看出，整个培养过程中，培养基b对重组cho细胞的密度增加效果最好；尤其是细胞培养到第7天时，可使细胞的密度达到了3.68*10⁶个/ml。将第6天和第7天的细胞密度进行显著性比较，与其他培养基相比，培养基b对重组cho细胞的密度增加效果具有显著性差异(p＜0.05)。

由图2可以看出，培养基b对促进重组cho细胞表达rhtnfr:fc蛋白的效果最好，达到395mg/l，与其它培养基相比具有明显优势，经比较，数据差异具有显著性。

因此，本发明的无血清培养基可有效提高cho细胞密度，促进目标蛋白表达(p＜0.05)。

试验例4本发明培养基与有血清培养基的效果比较

一、试验材料

无血清培养基：按照实施例1方法制备的无血清培养基；

有血清培养基：在实施例1方法制备的无血清培养基基础上，添加了5％v/v胎牛血清。

二、试验方法

取不同培养基50ml分别置于不同100ml体积的摇瓶中；将rhtnfr:fc重组cho细胞以密度为5*10⁵个/ml接种到摇瓶中，在37℃，5％co2培养箱中，100r/min悬浮振荡培养，连续培养9天，检测细胞密度。

细胞密度检测方法：血球计数板计数，每天计数一次。

三、试验结果

不同培养基培养的cho细胞密度见图3。

由图3可以看出，本发明无血清培养基与有血清培养基相比，细胞密度没有明显差异。

因此，本发明的无血清培养基可有效提高cho细胞密度，效果与有血清培养基相当。

综上，本发明的无血清培养基，可有效提高哺乳动物细胞的密度，促进目标蛋白表达，适合于cho细胞生长和产物表达，效果均与有血清培养基相当，完全可以替代有血清培养基；而且本发明无血清培养基的成分明确、蛋白含量低，生产成本较低，具有良好的工业应用前景。