技术领域本发明涉及分子生物学领域，更具体的，本发明涉及一组黄嘌呤氧化酶过敏预警SNP位点检测用的引物和试剂盒。
背景技术：
高尿酸血症是嘌呤代谢异常，血尿酸生成过多或排泄障碍导致的代谢性疾病，不仅是痛风的主要危险因素，同时也是代谢综合征的重要组成部分，影响心脏、肾脏等脏器功能，是高血压、冠心病的独立危险因素，也是慢性肾功能不全的重要危险因素，对人类健康造成严重危害。黄嘌呤氧化酶(xanthineoxidase，XOD)是嘌呤分解代谢过程中的一种重要的酶，它催化次黄嘌呤转化为黄嘌呤及由黄嘌呤形成尿酸的氧化过程，与尿酸生成增多引起的高尿酸血症及痛风等多种疾病相关。别嘌醇等黄嘌呤氧化酶抑制剂，可以减少体内尿酸合成，临床应用于高尿酸血症、痛风和痛风性关节炎等疾病的防治。但这类药物存在严重的超敏反应风险，包括重症渗出性多形红斑型药疹(Stevens-Johnson综合征，SJS)和中毒性表皮坏死松解症(TEN)，发生率约5％，约占药疹病例的11.94％，致死率可达30％～50％。研究发现，中国人群中HLA-B*5801等位基因与黄嘌呤氧化酶抑制剂引起严重皮肤过敏反应强相关。携带HLA-B*5801等位基因的中国汉族患者服用别嘌醇发生皮肤过敏反应的风险较未携带有此基因型的汉族人群风险比增加339倍。美国风湿病学会痛风指南指出中国汉族人和泰国人应用别嘌醇前应做HLA-B*5801等位基因检测。但由于HLA分型的血清学分型和基因分型各有不足，难以在临床工作中开展检测。目前国内上市的用于临床检测HLA-B*5801的试剂盒只有2015年引进的台湾世基生物医学股份有限公司的人类白细胞抗原B位点5801基因检测试剂盒(PCR-荧光法)，该试剂盒通过检测荧光定量PCR染料法结合溶解曲线技术分析HLA-B*5801基因，但鉴于HLA-B基因的多态性，难以保证该试剂盒非特异扩增情况及HLA-B*5801阴性患者的过敏反应。
技术实现要素：
为克服上述提到的内容，本发明提供一种用于检测黄嘌呤氧化酶过敏易感SNP位点的引物、试剂盒、用于特异性结合PCR产物并指示各个黄嘌呤氧化酶抑制剂易感基因位点的寡核苷酸信号探针和检测黄嘌呤氧化酶过敏易感SNP位点特异性捕获探针。本试剂盒针对人类基因组DNA中黄嘌呤氧化酶过敏易感基因的12个SNP位点：rs2734583,rs3117583,rs2855804,rs1150793,rs3094011,rs3131643,rs9267445,rs9263726,rs9263733,rs9263745,rs4084090,rs1634776。设计特异性引物和探针(包括捕获探针和信号探针)，其中特异性引物进行多重复合扩增获得12个SNP位点的扩增产物；捕获探针用于固定在特制的印刷电路板金电极表面，制备成黄嘌呤氧化酶过敏易感基因电化学芯片，信号探针标记有二茂铁分子，用于通过杂交反应捕获PCR多重扩增产物，信号探针与PCR产物特异结合；捕获探针则是设于印刷电路板的电极表面，制成电化学传感器(芯片)。信号探针标记有二茂铁分子，会通过夹心杂交产生电流的变化。应用电化学基因芯片分析系统检测出相应电流值(信号值)，并对各个SNP位点的碱基型别进行判定。所述的制成电化学传感器(芯片)，制备程序如下：1、空白电化学基因传感器生物芯片处理工艺：在印刷电路板的电极上均匀覆盖预混好的银胶，点好银胶的印刷电路板放在恒温干燥箱中95℃60分钟烘干；等离子处理1分钟。2、在电极上偶联捕获探针工艺：在等离子处理之后的印刷电路板的金电极表面点上相应的捕获探针，在85％湿度、温度26.7℃的条件下孵育10～15分钟。3、清洗工艺：使用去离子纯化水将印刷电路板表面没有结合的探针溶液冲洗2分钟，取出置于真空干燥箱中30℃15分钟干燥。4、成品组装工艺：将塑料板、密封盖及大胶膜、小胶膜按孔上相应位置组装好，跟烘干好的印刷电路板对准位置在气液增压机上压制成电化学基因传感器生物芯片，并盖好塑料外壳。本发明中涉及的引物、信号探针及捕获探针序列如下：rs2734583，rs3094011，rs3131643，rs9267445，rs9263726，rs9263733，rs9263745，rs4084090和rs1634776与别嘌醇引起的严重皮肤不良反应强相关，其中的rs9263726与HLA-B*5801完全连锁不平衡。而rs3117583，rs2855804，rs1150793则在中国台湾汉族人群中检测到与别嘌醇引起的严重皮肤不良反应相关。黄嘌呤氧化酶抑制剂引起严重皮肤不良反应与MHCⅢ区(包括BAT3、MSH5、MICB基因)的SNPs(rs3117583、rs2855804、rs1150793)强相关，p<10-7。日本的一项GWAS研究发现与SJS/TEN最明显相关的大多数SNPs位于或者接近于横跨6p21区，特别是与HLA-B基因相邻的区域，提示6p21区在别嘌醇相关的SJS/TEN的发病中起重要作用；与黄嘌呤氧化酶抑制剂相关SJS/TEN最明显相关的SNPs(rs2734583，rs3094011)的OR值为66.8(95％CI为18.3-202.5)。rs2734583、rs3131643、rs9267445、rs9263726、rs1634776这5个SNP与SJS/TEN明显相关，在所有携带有HLA-B*5801的SJS/TEN患者中观察到。3个SNP(rs2734583,rs9267445和rs9263726)显示与HLA-B和Cw等位基因强连锁不平衡关系。其中PSORS1C1基因上的rs9263726与HLA-B*5801等位基因完全连锁不平衡(D’＝1，r2＝1)。在6p21区的PSORS1C1是银屑病易感基因，在瑞典和加拿大人群中与银屑病相关，并且，在加拿大人群中表现与HLA-Cw0602连锁不平衡。这结果提示携带HLA-B*5801的个体与rs9263726A等位基因一致。因此，rs9263726在日本人群中是HLA-B*5801的替代生物标志物。而一项中国人群的研究发现黄嘌呤氧化酶抑制剂相关的SCAR患者中，携带HLA-B*5801和rs9263726A等位基因携带率分别为94.57％和91.30％。HLA-B*5801和PSORS1C1rs9263726(G>A)多态位点间呈强连锁不平衡(D’＝0.966，r2＝0.902)。rs9263726(G>A)多态位点A等位基因用于预测该人群别嘌呤醇致SCAR发生的灵敏度、特异度及阳性预测值和阴性预测值分别为91.30％,88.89％,90.32％和90.00％。信号探针:电化学杂交液中用于特异性结合PCR产物并指示各个黄嘌呤氧化酶抑制剂易感基因位点的寡核苷酸信号探针有24条，下列信号探针的顺序和上面表格中的24条序列是一一对应关系，该序列包括：SP-1：CAGTCTGATTCCACAGTSP-2：GGAAGACGCAACATGATTSP-3：GGGCCTTCCTTCCSP-4：GGGCCCTCCTTCCSP-5：AGACCCCTAAGGAGAGSP-6：AGACCCCCAAGGAGASP-7：CTACAAGATACACATTGCSP-8：CTACAAGACACACATTGCSP-9：TCTGTTATGCATGTGTTTSP-10：TTCTGTTATGTATGTGTSP-11：GGCAGACGTTTGCTCSP-12：GGCAGATGTTTGCTCSP-13：CCCAGAGCAGAGTCCTSP-14：CCCAGAGGAGAGTCCTSP-15：GGGGACGAGTTTCCSP-16：GGGATGAGTTTCCTTSP-17：GGAAGACGCAACATGASP-18：GGAAGACACAACATGATTSP-19：CCTGTCCCCACTTTCSP-20：CCCTGTCTCCACTTTCSP-21：CCATTCCTATAGATTGTTGSP-22：CCATTCCTACAGATTGTTSP-23：GCCCAGGAGCCGSP-24：GCCCAAGAGCCGA3、固定在特制的印刷电路板金电极表达的特异性捕获探针(通过杂交反应结合PCR多重扩增引物)，捕获探针的下列序列是和上述表格中扩增后的序列为一一对应关系。序列为：CP-1：ACCATAGGATTAGCGTCGTGACCP-2：TCTGGTCTGAGCAACAGCCP-3：GGTCTTCCCTCCATCCCACTCCCP-4：CTCAGAGATTATCCTAAATTAACTCCP-5：CAGATAGCCCTGATTCTCCACAGTCP-6：CGGGATGCACTGGCAGGCP-7：ACTGCAGCTTTTGGGTCTGCCP-8：TCGGTCAGGATTAACGTGGCP-9：CCTCACTCCCCAAACAAAGCP-10：GCATCTCTTTTTCCCTTACTCP-11：TTTCAACCAACAGTCAAAAAGCP-12：CCACTGCCAAGCTGGCT。具体的操作步骤如下：扩增：12个SNP位点分为单独A、B管进行一次独立的PCR反应(A管扩增第1、2、3、4、6、11SNP位点；B管扩增第7、8、9、10、12、5SNP位点)，反应的体系为总体积25μl，包含浓度为5ng/μl的DNA模板5μl、10XPCR反应缓冲液(含Mg2+)5μl、5MBetain4μl、酶系3μl(包括25mMdNTP混合液0.9μl，10u/μl热启动Taq酶0.6μl、1μ/lUDG酶0.1μl、热启动酶稀释液1.4μl)、A管反应引物包括20μM的正向引物1(0.5μl)，反向引物1(0.15μL)，正向引物2(1μL)，反向引物2(0.2μL)，正向引物3(0.5μL)，反向引物3(0.15μL)，正向引物4(0.5μL)，反向引物4(0.15μL)，正向引物11(0.5μL)，反向引物11(0.15μL)，正向引物6(0.5μL)，反向引物6(0.1μL)，去离子水为3.6μL；B管反应引物包括20μM的正向引物7(0.5μL)，反向引物7(0.1μL)，正向引物8(0.5μL)，反向引物8(0.15μL)，正向引物9(0.5μL)，反向引物9(0.15μL)，正向引物10(0.5μL)，反向引物10(0.15μL)，正向引物5(0.5μL)，反向引物5(0.15μL)，正向引物12(0.5μL)，反向引物12(0.1μL)，去离子水为3.95μL。在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50℃、3分钟，95℃、15分钟，进行45个循环的94℃、30秒，55℃、30秒，72℃、30秒；72℃、7分钟，4℃维持。杂交操作：取一0.2mL的离心管，依次加入70μL杂交液Ⅰ(含有每条信号探针各0.175ul,MES即2-(N-吗啉代)乙磺酸3.8ul,ABF即氟化氢铵62ul)，10μL杂交液Ⅱ(含有小牛血清)，20ul杂交液Ⅲ(为高氯酸钠)以及50ulPCR产物A,B管混合液，充分混匀。将混匀的液体移入电化学传感器(芯片)的管中，压紧管盖。在传感器插入DA9000仪器的检测模块前，检查是否已正确地标记，确认样本管的序列号与传感器是否匹配。然后选定与本试剂盒匹配的专用杂交检测程序，开始运行。大约30分钟后，杂交完成，输出报告单。结果分析：检测报告中会提供12个SNP型别结果，检测突变型的SNP型别对应的结果显示为突变型“Positive”，野生型“Negative”；检测为杂合型别的SNP对应的结果显示为突变型“Positive”，野生型“Positive”；检测为野生型型别的SNP对应的结果显示为突变型“Negative”，野生型“Positive”。本发明的有益效果在于：本发明针对12个黄嘌呤氧化酶过敏易感的SNP位点设计特异引物和探针，可分型检测12个SNP位点的型别，特异性好，本发明提供的检测试剂盒反应灵敏、能快速的检测人全血样本中12个SNP型别。具体实施方式实施例1PCR扩增A管：扩增第1、2、3、4、6、11SNP位点，反应的体系为总体积25μl，包含浓度为5ng/μl的DNA模板5μl、10XPCR反应缓冲液(含Mg2+)5μl、5MBetain4μl、酶系3μl(包括25mMdNTP混合液0.9μl，10u/μl热启动Taq酶0.6μl、1μ/lUDG酶0.1μl、热启动酶稀释液1.4μl)、A管反应引物包括20μM的正向引物1(0.5μl)，反向引物1(0.15μL)，正向引物2(1μL)，反向引物2(0.2μL)，正向引物3(0.5μL)，反向引物3(0.15μL)，正向引物4(0.5μL)，反向引物4(0.15μL)，正向引物11(0.5μL)，反向引物11(0.15μL)，正向引物6(0.5μL)，反向引物6(0.1μL)，去离子水为3.6μL；B管：B管反应引物包括20μM的正向引物7(0.5μL)，反向引物7(0.1μL)，正向引物8(0.5μL)，反向引物8(0.15μL)，正向引物9(0.5μL)，反向引物9(0.15μL)，正向引物10(0.5μL)，反向引物10(0.15μL)，正向引物5(0.5μL)，反向引物5(0.15μL)，正向引物12(0.5μL)，反向引物12(0.1μL)，去离子水为3.95μL；将A管和B管于ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50℃、3分钟，95℃、15分钟，进行45个循环的94℃、30秒，55℃、30秒，72℃、30秒；72℃、7分钟，4℃维持。杂交操作：取一0.2mL的离心管，依次加入70μL杂交液Ⅰ(含有每条信号探针各0.175ul,MES即2-(N-吗啉代)乙磺酸3.8ul,ABF即氟化氢铵62ul)，10μL杂交液Ⅱ(含有小牛血清)，20ul杂交液Ⅲ(为高氯酸钠)以及50ulPCR产物A,B管混合液，充分混匀。将混匀的液体移入电化学传感器(芯片)的管中，压紧管盖。在传感器插入DA9000仪器的检测模块前，检查是否已正确地标记，确认样本管的序列号与传感器是否匹配。然后选定与本试剂盒匹配的专用杂交检测程序，开始运行。大约30分钟后，杂交完成，输出报告单。结果分析：采用本发明中的引物制备的试剂盒对25个样本进行检测，检测结果如下，从表中可以看出，各SNP位点检测的黄嘌呤氧化酶过敏的灵敏度和特异度均较高，在80％左右，其中SNP位点8rs9263726预测的灵敏度和特异度最高。实施例2电化学传感器的制备制备步骤如下：1、空白电化学基因传感器生物芯片处理工艺：在印刷电路板的电极上均匀覆盖预混好的银胶，点好银胶的印刷电路板放在恒温干燥箱中95℃60分钟烘干；等离子处理1分钟。2、在电极上偶联捕获探针工艺：在等离子处理之后的印刷电路板的金电极表面点上相应的捕获探针，在85％湿度、温度26.7℃的条件下孵育12分钟。3、清洗工艺：使用去离子纯化水将印刷电路板表面没有结合的探针溶液冲洗2分钟，取出置于真空干燥箱中30℃15分钟干燥。4、成品组装工艺：将塑料板、密封盖及大胶膜、小胶膜按孔上相应位置组装好，跟烘干好的印刷电路板对准位置在气液增压机上压制成电化学基因传感器生物芯片，并盖好塑料外壳。