技术领域本发明属于医药技术领域，具体涉及一种CK19、Galectin-3和CD56mRNA在囊实性甲状腺癌变表达中的应用。
背景技术：
甲状腺结节由于胶质贮积、变性或出血而出现部分囊实性变。既往的报道认为甲状腺内出现囊性结节大多数为良性，但近年来随着甲状腺疾病发病率的增高，甲状腺癌囊实性变随之增多，有报道认为甲状腺癌出现囊实性变的比例为13％～26％。DaUgla认为甲状腺囊实性变或者反复出现的囊性病变，其恶性变的风险达到14％。超声诊断对那些微小病变较难发现，常常出现漏诊，关注这类病变对提高患者诊治有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种CK19、Galectin-3和CD56mRNA在囊实性甲状腺癌变表达中的应用，通过联合检测CK19、GaleCtm-3及CD56mRNA在甲状腺癌囊实性变和良性病变组织中的表达，为甲状腺肿瘤的早期诊断提供新的思路。本发明所采用的技术方案是，一种CK19、Galectin-3和CD56mRNA在囊实性甲状腺癌变表达中的应用。本发明的特点还在于，CD56的扩增引物序列如下：CD56上游引物如SEQIDNO1所示；CD56下游引物如SEQIDNO2所示。CK19的扩增引物序列如下：CK19上游引物如SEQIDNO3所示；CK19下游引物如SEQIDNO4所示。Galectin-3的扩增引物序列如下：Galectin-3上游引物如SEQIDNO5所示；Galectin-3下游引物如SEQIDNO6所示。本发明的有益效果是：相关性分析中CK19与Galectin-3呈正相关(P<0.01)，与CD56呈负相关(P<0.01)，Galectin-3与CD56呈负相关(P<0.01)。提示上述3项分子标志物与甲状腺囊实性变的病理变化有关，在该病变的鉴别诊断中有一定的意义。本发明结果提示，单独检测三项指标的灵敏度较联合检测显著降低(P<0.01或P<0.05)，单独检测的特异度较联合检测无统计学意义(P>0.05)。因此，联合检测甲状腺组织CK19、Galectin-及CD56可减少影像学及病理学诊断的漏检率，为囊实性甲状腺疾病的早期诊断提供新的思路。附图说明图1是本发明不同病变组织CD56mRNA表达；其中，M：DL2000；1:囊实性结节性甲肿；2：囊实性腺瘤；3：囊实性滤泡腺癌；4：囊实性乳头癌；5：阴性对照；图2是本发明不同病变组织Galectin-3mRNA表达；其中，M：DL2000；1：囊实性结节性甲肿；2：囊实性乳头癌：3：囊实性滤泡腺癌；4：囊实性腺瘤：5:阴性对照；图3是本发明不同病变组织CK19mRNA表达；M：DL2000；1：囊实性腺瘤；2:囊实性乳头癌；3：囊实性滤泡腺癌；4:囊实性结节性甲肿；5:阴性对照。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。1资料与方法1.1一般资料选取2003年9月至2013年9月在咸阳市第一人民医院行甲状腺切除术的标本130例，经病理证实筛选出囊实性病变标本58例分为4组，滤泡状癌囊实性变6例；乳头状癌囊实性变23例；囊实性结节性甲状腺肿18例；囊实性腺瘤11例。甲状腺癌患者男10例，女19例，年龄23～74(52.3±12.7)岁，甲状腺乳头状癌19例，滤泡状癌6例，结节性甲状腺肿伴乳头状癌4例，均为单发结节；病变部位于左侧、右侧、峡部和双侧者分别为12例、11例、1例和5例；病变分化较好者22例，较差者7例；有淋巴转移者19例，无淋巴转移者10例；良性囊实性结节性甲状腺患者男9例，女20例，年龄23～76(50.8±11.7)岁，无完整包膜者26例，有包膜者3例；结节性甲状腺肿囊实性变18例，甲状腺腺瘤囊实性变11例；病变部位于左侧、右侧、峡部和双侧者分别为12例、12例、1例和4例；全部无淋巴转移；所有患者的病理类型均经术后病理证实，所有病例病理诊断标准参照2004年甲状腺WHO组织学分类标准。各组性别和年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。人选的研究对象均排除自身免疫性疾病、存在分化型甲状腺癌以外的其他肿瘤、怀孕及甲状腺球蛋白抗体阳性者。此研究经咸阳市第一人民医院伦理委员会批准，所有研究对象并签署知情同意书。1.2仪器和检测方法1.2.1仪器、试剂和引物RNA提取为美国Invitrogen公司产品。lightCycler荧光PCR仪为德国Roche公司产品。RQPCR试剂盒采用上海久盛医疗用品有限公司产品。1.2.2细胞分离和总RNA的提取、保存及鉴定Trizol一步法提取组织中的总RNA，在分光光度计上检测A260//280的比值以验证RNA的纯度。1.2.3逆转录反应前及逆转录反应按上海久盛医疗用品有限公司提供的试剂盒说明进行。1.2.4PCR扩增：CD56的引物序列为：上游5’-GCCCATCCTCAAATACAAAGC-3’，下游5’-GGTCCTGAACACAAAATGAGC-3’，扩增产物为335bp；CK19的引物序列为：上游:5’-AGCGGCAGAATCAGGAGTA-3：下游:5’-GAGGACCTTGGAGGCAGAC-3’产物350bp；Galectin-3的引物序列为:上游：5’-GATGCGTTATCTTGGGTCTG-3’，下游:5’-TCTCATTGAAGCGTGGGT-3’，扩增产物为350bp。β-atin作为内参照，其上游序列为5’-CTCATTGACAATGGTGAT-3’，下游为5’-ACCGAGCGCGGCTACAGC-3’：扩增产物为650bp。采用同管扩增。反应体系为12.5μl。反应条件：95℃，5min，95℃，30s，58℃，30s，72℃，45s，30个循环；72℃，5min，4℃保存。1.2.5基因片段序列测定和分析使用测序仪对PCR产物进行序列测定。将测序结果通过BLAST应用软件与Gen-Bank中的已知序列进行同源性比较相符。1.2.6对扩增的目的片断进行凝胶电泳，通过紫外光凝胶成像系统进行扫描并记录，用四维成像处理系统，测定各组的cDNA的特异性RNA表达量与内参间的比值代表mRNA表达量。1.3统计学处理应用SPSS11统计软件进行分析，组间均数比较采用X检验，率比较采用《检验，CK19、Galetin-3和CD56mRNA相对表达量以表示。相关性分析用Peroo法。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1CK19、Galectin-3和CD56mRNA的表达三种标志物表达率在乳头状癌囊实性变与囊实性结节性甲肿、囊实性腺瘤比较中，其差异均有统计学意义(P<0.01)，在两良性病变组织相比较中则差异无统计学意义(P>0.05)。在滤泡状癌囊实性变与囊实性结节性甲肿、囊实性腺瘤比较中，CK19mRNA表达率差异无统计学意义(P>0.05)，Galec-tin-3mRNA表达率差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)在滤泡状癌囊实性变与囊实性结节性甲肿组比较中，CD56mRNA表达率差异有统计学意义(P<0.05)，在滤泡状癌囊实性变与囊实性腺瘤组比较中，CD56mRNA表达率差异无统计学意义(P＝0.05)，见表1。半定量RT-PCR显示，滤泡状癌囊实性变、乳头状癌囊实性变中的CK19、Galec-tin-3和CD56mRNA表达量与囊实性结节性甲肿、囊实性腺瘤相比较差异均有统计学意义(P<0.01)。见表2、图1和图2。表1组织CK19、Galectin-3和CD56mRNA阳性检测率比较例(％)组别病例CK19Galecti-3CD56囊实性结节性甲肿组183(16.7)2(11.1)14(77.8)囊实性腺瘤组113(27.3)2(18.2)8(72.7)滤泡状癌囊实性变组62(33.3)5(83.3)c1(16.7)c乳头状癌囊实性变组2320(87.0)ab19(82.6)3(13.0)ab注:与囊实性结节性甲肿比较，x2＝20.25，20.65，17.43，aP均＝0.000，x2＝11.36，7.17，aP＝0.008，0.015；与囊实性腺瘤比较，x2＝12.11，13.07，12.11，bP＝0.001；x2＝6.80，dP＝0.035；表2组织CK19、Galectin-3和CD56mRNA在甲状腺病变组织中的半定量比较组别病例CK19Galecti-3mRNACD56囊实性结节性甲肿组180.17±0.030.28±0.041.35±0.17囊实性腺瘤组110.36±0.050.66±0.071.30±0.18滤泡状癌囊实性变组60.83±0.09ab0.87±0.08ab0.60±0.07ab乳头状癌囊实性变组230.80±0.08cd0.90±0.09cd0.62±0.07cd注:与囊实性结节性甲肿比较，＝31.15，26.59，17.32，aP均＝0.000；t＝32.17，24.33，15.37，cP均＝0.000；与囊实性腺瘤比较，t＝18.70，3.87，18.32，bP均＝0.000；t＝17.72，3.98，18.75，dP均＝0.000；2.2相关分析58例囊实性甲状腺病例中，CK19mRNA表达量与Galectin-3mRNA、CD56mRNA具有相关性(r＝0.576，-0.537，P<0.01)，Galectin-3mRNA表达量与CD56mRNA呈负相关(r＝-0.523，P<0.01)。2.3敏感度和特异度在鉴别良性和恶性甲状腺病变、滤泡癌和腺瘤、乳头癌和良性增生及乳头癌和腺瘤中，联合检测CK19和Galectin-3、Galectin-3和CD56、CK19和CD56较单独检测CK19、Galetin-3和CD56的敏感度显著增高(P<0.01或P<0.05)；联合检测的特异度较单独检测差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。表3CK19、Galectin-3和CD56检测囊实性甲状腺病变的灵敏度和特异度(％)3讨论CK19上皮标记物存在于正常上皮和各种上皮来源的肿瘤中，研究发现，CK19在甲状腺乳头状癌中大部分表达呈强阳性，而良性乳头状增生、结节性甲状腺肿或伴腺瘤样增生则多数表达为弱阳性或阴性。Naer等[]通过细针穿刺细胞学活检，免疫组化染色发现CK19在乳头癌的阳性表达率为34/37，其他各种良恶性病变的阳性表达率只有1/36。还有报道认为，CK19在甲状腺乳头状癌及甲状腺微小乳头状癌中大部分表达呈中阳性或强阳性，而乳头状增生则多数呈阴性表达，少数表达为中阳性，而在这些中阳性表达的病例中，甲状腺微小乳头状癌和甲状腺乳头状增生这两种病变则较难鉴别。ISc等研究认为，CK19在甲状腺乳头状癌病例中阳性表达率高，而在大部分非乳头癌病变中表达缺失。CK19在甲状腺囊实性病变的表达也基本印证了上述的观点。本实验通过RT-PCR技术研究显示甲状腺乳头状癌囊实性变患者CK19mRNA阳性表达率显著高于囊实性结节性甲肿和囊实性腺瘤患者(P<0.01)，滤泡状癌囊实性变患者与囊实性结节性甲肿、囊实性腺瘤比较，CK19mRNA阳性表达率均无统计学意义(P>0.05)。半定量分析中乳头癌囊实性变和滤泡状癌囊实性变患者甲状腺组织CK19mRNA显著高于囊实性结节性甲肿和囊实性腺瘤患者(P<0.01)。以上说明CK19在甲状腺乳头状癌囊实性变、滤泡状癌囊实性变及良性囊实性病变的诊断中起着重要作用，是鉴别囊实性甲状腺病变的重要分子标记物。CO等报道认为Galectin-3在甲状腺乳头癌和滤泡癌中有较高的表达率，在甲状腺腺瘤与结节性甲状腺肿中无表达或呈弱阳性表达。Batolazi等通过对618例甲状腺外科手术标本的回顾性研究发现，Galectin-3在乳头癌、滤泡癌和滤泡腺瘤中的表达率分别为97％、95％和3％；他们对226例甲状腺结节患者进行了细针穿刺细胞学活检，病理证实良性病变标本Galectin-3的表达率为3/192，34例不同类型甲状腺癌标本Galectin-3的表达率全部为阳性，特异度、敏感度、阳性预测值、诊断正确率分别为98％、100％、92％、99％。Ga-lectin-3在囊实性甲状腺病变组织的表达也符合上述观点。本研究显示乳头状癌囊实性变和滤泡状癌囊实性变患者组织Galectin-3阳性表达率显著高于囊实性结节性甲肿和囊实性腺瘤患者(P<0.01或P<0.05)。在RT-PCR半定量分析中，两恶性病变患者组织Galetin-3表达同样高于囊实性结节性甲肿和囊实性腺瘤患者(P<0.01)。提示Galectin-3在甲状腺恶性肿瘤中高度表达而良性肿瘤少量表达，可作为甲状腺分子生物学诊断标志。CD56为神经细胞黏附分子，是神经内分泌肿瘤最敏感的标记物。其在正常甲状腺组织、滤泡状腺瘤和髓样癌中都有不同程度的表达，但在甲状腺乳头状癌中表达降低，甚至道无表达。黄悦等认为，在其实验的甲状腺肿和腺瘤标本中均可检测到CD56表达，而在甲状腺癌标本中只有1例为阳性。本实验中CD56在囊实性结节性甲肿和囊实性腺瘤病变组织的阳性表达率为77.8％和72.7％，在乳头状癌囊实性变和滤泡状癌囊实性变组织的阳性表达率为13.0％和16.7％，两良性病变组的CD56表达率显著高于乳头癌组(P<0.01)。囊实性结节性甲肿组的CD56表达率显著高于滤泡状癌囊实性变组(P<0.05)。囊实性腺瘤组的CD56表达率与滤泡状癌囊实性变组比较差异无统计学意义(P＝0.05)，以上显示CD56可用于囊实性甲状腺良性病变与恶性病变的鉴别诊断。