一种新疆穴居狼蛛Lycosasingoriensis抗菌肽及应用的制作方法

本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及一种从新疆穴居狼蛛Lycosa singoriensis蜘蛛毒液获得的抗菌肽在抗菌药物中的应用。

背景技术：

在临床使用的多种抗生素的抗菌耐性已经对世界上的公共卫生产生了严重威胁。因此开发一种新型的抗生素来克服细菌的耐药性成为了一个亟待解决的难题。而在开发新型抗耐药菌的抗生素方面，抗菌肽(AMPs)表现出的广谱抗菌活性一度被认为是一个强有力的新型武器用来对抗日益增长而又对传统的抗生素产生抗性的病原体。因此，获得具强抗菌活性的抗菌肽是非常值得追求的目标。

技术实现要素：

本发明的目的旨在于提供一种具抗菌作用的多肽lycosin-II及其在制备抗菌药物中的应用。

上述发明目的是通过以下技术方案实现的:

本发明提供的抗菌肽包含21个氨基酸残基，氨基酸序列为：Val Trp Leu Ser Ala Leu Lys Phe Ile Gly Lys His Leu Ala Lys His Gln Leu Ser Lys Leu。

所述的抗菌肽的分子量为2418.647Da(M+H+)，等电点10.48。

将所述的新疆穴居狼蛛Lycosa singoriensis抗菌肽或含有新疆穴居狼蛛

Lycosa singoriensis抗菌肽的药物组合物用于制备抗菌药物。

Lycosa singoriensis抗菌肽来自于新疆穴居狼蛛Lycosa singoriensis的蜘蛛粗毒，通过分离纯化而得到的一种具有21个氨基酸残基的多肽，命名为lycosin-II。抗菌肽lycosin-II具有很强的抗菌活性，另外，还具有一定的耐盐性和较低的人红细胞毒性，可作为现有的抗生素的替代药物或辅助药物。可有效解决日益严重的抗药性问题及顽固感染对广大患者造成的痛苦。可以用作人类药物和/或牲畜药物、兽用药物或者作为农业、食品及工业上有效的化合物试剂。

Lycosa singoriensis蜘蛛毒素抗菌肽lycosin-II的分离纯化方法

(1)lycosin-II的分离纯化

将新疆穴居狼蛛Lycosa singoriensis的10mg的粗毒干粉用10ml双蒸水溶解后，3000转/分钟离心五分钟，取上清液进行用C18RP-HPLC进行分离纯化(图1A)(美国Waters公司,Alliance HPLC&Millennium高效液相色谱工作站，2690溶剂输送系统，996PDA检测器，分离柱：反相柱，Vydac,C18,4.6mm×250mm；洗脱液分别为：A液(0.1％TFA/H2O)、B液(0.1％TFA/ACN)；洗脱梯度，0-60min,0-60％B液；流速，1ml/min；温度，40℃)，在215nm下监测多肽的洗脱，收集星号洗脱峰，冻干，并用质谱测定其分子量。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定其分子量为2418.647Da(M+H+)(图1B)。使用自动Edman降解得出它的氨基酸序列为Val Trp Leu Ser Ala Leu Lys Phe Ile Gly Lys His Leu Ala Lys His Gln Leu Ser Lys Leu，是一个无半胱氨酸残基的线性多肽。lycosin-II的cDNA序列表明其氨基酸残基“GK”在c-末端这意味着在转运后加工的过程其c-末端发生了酰胺化修饰。

(2)lycosin-II的化学合成及纯化

Lycosin-II的合成用的是Fmoc/叔丁基策略和HOBt/TBTU/NMM偶联的方法在多肽自动合成仪上合成。图1C为化学合成Lycosin-II的RP-HPLC纯化图谱，质谱结果显示其与天然粗毒分离的Lycosin-II具相同分子量。进一步抗菌实验显示化学合同的Lycosin-II与天然Lycosin-II具同样的抗菌作用。

图1D展示了Lycosin-IIα-螺旋的二级结构的构型，lycosin-II的α-螺旋环状结构图表明其形成的是一个双亲性阳离子α-螺旋。这样的结构特征一定程度上可以预测lycosin-II是通过和细菌的细胞膜相互作用来行使其抗菌活性。该多肽的物理化学性质为：纯化冻干粉为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色透明。

附图说明

图1 lycosin-II的纯化及表征；

图1A.lycosin-II的RP-HPLC纯化图谱(星号标记峰为lycosin-II峰)；图1B.lycosin-II的MALDI-TOF MS鉴定图谱；图1C.化学合成lycosin-II的RP-HPLC 纯化图谱；图1D.lycosin-II的α-helical环形图谱。

图2是lycosin-II的抗菌效应；

图2A.lycosin-II对三种菌株的剂量依赖性效应。图2B.lycosin-II对三种菌株的时间依赖抑制效应。

图3 Mg²⁺存在的条件下，lycosin-II对A.baumannii.菌株的抗菌活性。

图4 lycosin-II对人类红细胞的溶血效应。

具体实施方式

为了揭示lycosin-II的抗菌作用，我们检测了lycosin-II对不同菌株的抑制特性，并对lycosin-II的溶血活性进行了分析。实验的开展都是严格的根据临床和标准化研究所标准进行。

1.主要材料和仪器

化学合成的相关试剂在吉尔生化(上海)有限公司购买，其余生化试剂购自sigma公司。实验所用的测试菌都是在2014年1月到7月从湘雅二医院的临床病人中收集。E.coli,k.pneumonia,S.pyogenes,S.saprophyticus,S.epidermidis,P.aeruginosa and V.Streptococci是从病人腹水中收集。A.baumannii and S.aureus是从病人唾液中收集。实验仪器主要有美国Waters公司的高效液相色谱仪器(HPLC)及Bruker高性能串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)。

2.实验方法和结果

2.1lycosin-II的抗菌活性

lycosin-II的抗菌活性由医院病人的腹水中所分离得到的临床细菌株以及对这些病菌的抗性所决定。进行实验的病菌都是从ICU中严重患者中分离而来，这些病菌被认为是多抗药性菌株。如图2A所示，lycosin-II对Escherichia coli,Staphylococcus epidermidis和Acinetobacter baumannii三种菌株表现出明显的抑制效果，这种抑制效果并且具剂量依赖性，在3.1-12.5μM中，lycosin-II可以完全抑制这3中病菌的生长；lycosin-II对病菌的MIC值用微稀释实验测定(表1)，表1显示Lycosin-II能够抑制所有细菌菌株的生长，对于不同的测试病菌，它的MIC值在3.1μM到25μM之间。lycosin-II对Staphylococcus saprophyticus,S.epidermidis,Viridans Streptococci,S.aureus及A.baumannii的抑制作用尤其明显， 而对Klebsiella pneumoniae和Streptococcus pyogenes的抑制效果并不显著，只有在lycosin-II达到最高剂量(50μM)时才表现出明显的抑制作用；实验显示lycosin-II的抑菌作用具有时间依赖性(图2B所示)，使用E.coli,S.epidermidis和A.baumannii 3种病菌株进行检测，在lycosin-II孵育的24小时中，细菌的存活数量都在逐渐减少。这些数据与早前有关研究的有快速抗菌活性的抗菌肽的报道一致，对病菌快速致死的效应大概是由于lycosin-II对病菌生长抑制所表现的强有力活性有关。

表1lycosin-II抗临床病株的MIC值

2.2lycosin-II与Mg²⁺的竞争性作用

为了验证lycosin-II与细菌细胞膜之间的结合作用，我们检测了lycosin-II在有无5mM Mg²⁺存在的A.baumannii菌株中抑菌的MIC值。如图3所示，Mg²⁺降低了lycosin-II对菌株的抑制强度和效果。lycosin-II的MIC值在有无5mM Mg²⁺的存在下分别为12.5μM和3.1μM这说明了Mg²⁺使lycosin-II的MIC值增加了4倍。这些数据表明，Mg²⁺可能与lycosin-II竞争在细菌表面的结合位点。这种现象说明lycosin-II与大多数其他的阳离子抗菌肽相同，可以通过其所带的净正电荷与带负电荷性的细菌细胞膜强烈的结合。另一方面，尽管在高浓度的盐离子的存在下减弱了lycosin-II的抑菌作用，lycosin-II还是表现出了对A.baumannii的强抑制性(甚至在5mM Mg²⁺的情况下抑制作用依然较强)。这些结果表明lycosin-II除具抗菌活性外还具有一定的耐盐性。

2.3Lycosin-II有低溶血活性

实验进一步检测了Lycosin-II对人红细胞的毒性。

图4结果显示，随着lycosin-II浓度的增加其溶血效应也增加，在50μM浓度时lycosin-II表现出20％的溶血反应。但与病原细胞相比，人类红细胞对lycosin-II的敏感性较小。

上述实验结果表明Lycosin-II具有很强的抑菌作用，它通过与菌株的细胞膜结合破坏细菌细胞膜来发挥其抑菌作用，同时具有低溶血活性。因此，lycosin‐II可作为巨大潜力的开发新型抗耐药菌的抗生素的候选药物。

<110> 中南大学

<120> 一种新疆穴居狼蛛Lycosa singoriensis抗菌肽及应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 新疆穴居狼蛛(Lycosa singoriensis)

<400> 1

Val Trp Leu Ser Ala Leu Lys Phe Ile Gly Lys His Leu Ala Lys His

1 5 10 15

Gln Leu Ser Lys Leu

20