技术领域本发明涉及一种胶类中药动物源性检测技术领域，具体涉及一种阿胶中驴、猪源性巢式荧光PCR检测引物、探针组合物、试剂盒及检测方法与应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
阿胶为马科动物驴的皮，经煎煮、浓缩制成的固体胶，原产自山东省泛东阿区，始载于《神农本草经》，与人参、鹿茸并称为“滋补三宝”，至今已有近三千年历史。阿胶补血圣药，味甘平，入肺、肝、肾经，具有补血止血、滋阴润燥等功效，药食两用，长期服用可补血养血、美白养颜、抗衰老、抗疲劳、提高免疫力，适用人群广泛。李时珍著《本草纲目》载：“阿胶《本经》上品。2015版《中国药典》明确规定阿胶为马科动物驴(EquusanimusL.)的皮熬制而成的阿胶为正品阿胶。然而随着胶类市场的不断发展，随着熬胶原料供应紧张和价格上涨，由于阿胶功效独特，市场供不应求，掺假伪劣产品层出不穷，并不断被媒体曝光。这些劣质阿胶多采用牛、马、骡子、猪、羊等动物皮、骨、结缔组织熬制，用肉眼难以鉴别，《中国药典》通过驴的特征态测驴源成分，已不能满足鉴别杂皮源的需求。伪劣阿胶在临床使用后不仅达不到治疗效果，还对消费者健康安全带来巨大隐患。为了取缔和预防假冒伪劣阿胶产品，需要质量监管部门加大执法力度，而首要前提是具备科学可靠的检测方法。传统的巢式PCR反应由于有2次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶点的可能性，增加了检测的灵敏度和可靠性，主要应用于分子生物学领域和医学检测研究中。但也有耗时长、易污染和假阳性等缺点，即从PCR扩增开始全程耗时约5h，检测结果需要电泳及凝胶成像系统才能看到结果，多次开管操作，交叉污染的可能性大。此外，由于阿胶经过多个工序的高温煎煮，导致线性基因组DNA断裂成小片段，甚至降解掉，虽然环状线粒体DNA对高温的耐受力相对线性基因组DNA较强，但阿胶经过深度加工后都会对DNA不同程度的破坏，如何解决降解DNA成为基于DNA检测技术来检测阿胶真伪的一大瓶颈。中国专利(CN104988231.A)利用半巢式PCR技术鉴别阿胶真伪，扩增片段700bp左右，对于深度加工的胶类中药来将，DNA已高度破坏，大片段扩增很难成功，加上需要两轮PCR扩增，不但耗时、开管操作极易造成交叉污染导致假阳性及结果的准确性低，所以传统PCR检测方法已经不能满足当前阿胶真伪检测的要求。
技术实现要素：
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种阿胶中驴、猪源性多重巢式荧光PCR(Mini-NEST-MultipleqPCR)检测引物、探针组合物、试剂盒及检测方法与应用，该试剂盒检测灵敏度高、特异性好，可以实现阿胶中驴、猪源性成分快速定性检测；该检测方法(Mini-NEST-MultipleqPCR)快速简便、准确度高。为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：一种同时鉴别阿胶中驴、猪源性成分的多重巢式荧光PCR检测引物、探针组合物，包括：(1)多重巢式荧光PCR检测驴、猪源性通用外侧引物，其扩增片段为202bp，其核苷酸序列如下：正向引物序列：5'CCTGTATCAACACATAGAAGCAATA3'，如SEQNO.1所示；反向引物序列：5'TCCTTTTACTTCTTTTAATCTTTCC3'，如SEQNO.2所示；(2)多重巢式荧光PCR检测驴、猪源性通用内侧引物，，其扩增片段为143bp，其核苷酸序列如下：正向引物序列：5'TATGAGTAACAAGAATTATTTCTCC3'，如SEQNO.3所示；反向引物序列：5'AGCCTGTGTTGGGTTAACAA3'，如SEQNO.4所示；(3)驴特异性探针，其核苷酸序列如下：5'CAACAAAATAGACACAACCCAAAAACT3'，如SEQNO.5所示；(4)猪特异性探针，其核苷酸序列如下：5'CTCCTCGCACACGCTTACATCAGTA3'，如SEQNO.6所示；其中，所述驴、猪特异性探针的5’端修饰有报告基团，3’端修饰有淬灭基团，所述报告基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任一种。本发明还可以具有以下附加技术特征：进一步的，驴特异探针序列(SEQNO:5)为：5'JOE-CAACAAAATAGACACAACCCAAAAACT-BHQ23'；猪特异探针序列(SEQNO:6)为：5'FAM-CTCCTCGCACACGCTTACATCAGTA–BHQ13'。优选的，还包括内标质控体系，所述内标质控体系包括质控体系引物、质控体系探针和质控体系序列，各核苷酸序列如下：(1)质控体系引物：上游引物序列如SEQNO.1所示，下游引物如SEQNO.2所示；(2)质控体系探针：CntP：5'TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT3'，如SEQNO.7所示；(3)质控体系序列：CCTGTATCAACACATAGAAGCAATATGGAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATTGGTGACCTCGGAAAGATTAAAAGAAGTAAAAGGA，如SEQNO.8所示；进一步的，内标致控体系探针为：CY3-TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT–BHQ2，如SEQNO.7所示。其中，质控体系探针的5’端修饰有报告基团，3’端修饰有淬灭基团，所述报告基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任一种。设计构建含有阳性扩增内标DNA的重组质粒，并设计相应的TaqMan探针(如SEQIDNO.7所示)，其方法为：使用DNA随机生成软件产生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后没有出现与之同源的DNA片段，在这段随机DNA序列上游5’端连接上驴和猪通用外侧上游引物(如SEQIDNO.1所示)，下游3’端驴和猪源性通用外侧下游引物序列(如SEQIDNO.2所示)，从而形成110bp的阳性扩增内标DNA序列(如SEQIDNO.8所示)，将这段扩增内标序列委托基因合成公司人工基因合成，合成片段连接载体PMD18-T，转化感受态DH5a，质粒提取，并测序验证，得到能与驴和猪源性共用一对特异性引物(如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示)，从而构建阳性内标DNA的重组质粒。本发明还提供一种同时鉴别阿胶中驴、猪源性成分的多重巢式荧光PCR检测试剂盒，包括上述的同时鉴别阿胶中驴、猪源性成分的多重巢式荧光PCR检测引物、探针组合物，以及阿胶DNA提取液和多重巢式荧光PCR反应所需试剂。优选的，还包括驴、猪阳性标准品、阴性对照品和空白对照品。优选的，所述多重巢式荧光PCR反应所需试剂包括：多重巢式荧光PCR反应缓冲液2×qPCRMasterMix，Taq热启动酶，镁离子浓度2.0mM，4种dNTP的终浓度各为200μM，Tris-H2SO4pH9.0终浓度为300mM，KCl终浓度为600mM，终浓度为5M/L的甜菜碱和超纯水；所述试剂盒为20μlPCR反应扩增体系：2×qPCRMasterMix10μl，外侧引物对10μM取0.5μl，内侧引物对10μM取1μl，探针用量10μM取0.5μl，DNA用量1-50ng/μl取2μl，用双蒸水补足20μl。优选的，所述试剂盒的PCR扩增步骤为两步：第一步反应外侧引物优先扩增，反应条件为95℃10min，95℃10s，70℃，35s，在此收集荧光信号，15个循环；第二步反应内侧引物优先扩增，反应条件为95℃10s，60℃，35s，在此收集荧光信号，40个循环。本发明还提供一种鉴别阿胶中驴、猪源性成分多重巢式实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：(1)提取待测样品DNA；(2)使用上述引物、探针组合物或试剂盒进行两步PCR扩增：第一步反应驴、猪源性通用外侧引物优先扩增，反应条件为95℃10min，95℃10s，70℃，35s，在此收集荧光信号，15个循环；第二步反应驴、猪源性通用内侧引物优先扩增，反应条件为95℃10s，60℃，35s，在此收集荧光信号，40个循环；(3)设立阳性对照、阴性对照及空白对照；(4)根据不同探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定阿胶中是否含有驴、猪源性成分。优选的，所述多重巢式实时荧光定量PCR检测是将多重巢式荧光PCR检测驴、猪源性通用内、外侧引物以及驴、猪特异性探针放入同一反应体系中共同扩增，无需开管。优选的，所述PCR扩增为扩增阶段反应需在至少3通道型号的荧光定量PCR仪上进行。本发明另提供上述试剂盒在鉴别阿胶中驴、猪源性成分中的应用。本发明多重巢式实时荧光定量PCR检测方法，具体步骤为：(1)阿胶中核酸提取利用专利CN.201410317118阿胶DNA提取技术提取核酸DNA，在此不再赘述。(2)靶基因的选择与引物设计：相比基因组而言，线粒体在组织中拷贝数高，而且阿胶经过深度加工后破坏程度相对小，所以优先选用线粒体16SrDNA基因。设计驴和猪通用外侧引物及内侧引物。见表1.表1.引物和探针序列(3)使用上述试剂盒进行巢式实时荧光PCR检测，是将内外侧引物及探针放入同一反应体系中共同扩增，无需开管，避免污染。PCR反应体系见表2。表2多重巢式荧光PCR反应体系(4)PCR扩增条件为95℃10min；95℃10s，70℃，35s，15个循环；95℃10s，60℃，35s，在此收集荧光信号，40个循环。(5)结果分析：每次试验设立阳性对照、阴性对照及空白对照，试验结束后打开分析软件，分析实验结果，给出ΔRn(第n个循环时的荧光增加值)与扩增曲线Ct值，根据不同探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定阿胶中是否含有驴、猪源性成分。本发明与现有的检测技术相比其有益效果在于：迷你巢式实时荧光多重PCR(Mini-NEST-MultipleqPCR)检测技术原理：是一种改良后的巢式PCR技术结合TaqMan探针法的多重实时荧光PCR检测技术，是在一段200-250bp左右的待扩增靶序列上设计外侧、内侧两对引物，在内侧靶序列上设计TaqMan探针，然后内外侧引物及探针同时放入荧光定量PCR反应液中，在荧光定量PCR仪上进行热循环反应，使内外侧引物同时引导新链合成，获得由外-外，内-内，内-外，外-内组合的聚合酶链式反应产物，大大提高扩增效率，结合物种特异性TaqMan荧光探针，实现了荧光信号的放大积累与PCR产物形成完全同步检测。该技术整合了巢式PCR与荧光定量PCR的优势特点，大大提高了检测灵敏度，特别适用于深度加工制品导致DNA降解及痕量DNA检材领域研究。本发明提供了一种巢式多重荧光PCR(MultiplenestedfluorescencePCR)检测技术同时鉴别阿胶中是否含有驴源、猪源性动物源性成分，该方法有以下优点：(1)鉴于阿胶为深度加工制品，DNA破坏性程度大、本发明在靶基因选择上优先选用线粒体基因其原因在于拷贝数相对基因组高，环状结构相对线性基因组更稳定的特点，因此大大提高检测灵敏度；(2)本发明针对阿胶中微量DNA或降解DNA，采用mini-NEST-qPCR技术，通过巢式PCR及小片段扩增技术，大大提高了引物及探针有效识别靶点的几率，因此大大提高检测准确性和灵敏度；(3)本发明采用mini-NEST-qPCR，闭管操作、污染率低、检测灵敏度高、特异性好、准确度高、通量大等有益效果；与常规PCR相比，本发明建立的多重巢式荧光PCR方法具有独特的优势，首先全程闭管操作避免交叉污染，高效扩增效率将检测时间缩短至2.5小时，增加阳性内部质控体系有效避免假阳性，荧光PCR更将检测灵敏度提高至皮克级别。荧光PCR的多重荧光技术特点为提高检测通量和增加检测多种动物源性提供了可能。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1，JOE荧光修饰驴源性特异探针有扩增曲线，说明待检样本检出驴源性成分。图2，FAM荧光修饰猪源性特异探针有扩增曲线，说明待检样本检出猪源性成分。图3，JOE和FAM荧光修饰探针同时有扩增曲线，说明待检样本检出驴和猪源性成分。图4，为试剂盒驴源性检测灵敏度扩增曲线图，检测限为0.1pg。图5，为试剂盒猪源性检测灵敏度扩增曲线图，检测限为0.1pg。具体实施方式以下结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应该理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。除非特别说明，本发明采用的除引物、探针之外的试剂、方法和设备为本领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明使用的试剂和试剂盒均为市购。1.下列实施例中，所用实验材料、试剂与仪器如下：实验材料：牛、猪、马、驴、骆驼、牦牛、山羊、绵羊、兔、鱼、鸡、鸭、狗、水貂及狐狸等动物皮张或新鲜组织，阿胶不同厂家不同生产批次20份，均为济南市购。所用试剂：动物组织提取试剂盒为OMEGA品牌。DNA分子量MakerDL1000、电泳上样缓冲液等PCR反应试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。引物与探针由生工生物工程(上海)有限公司负责合成。2×TaqManMasterMix为DBIBioscience品牌。DNA测序由山东省农业科学院生物技术中心测序中心完成。所用仪器：ABI7500荧光定量PCR仪为ABI公司产品，TakaraPCR仪为宝生物工程(大连)有限公司产品。5424D型高速离心机为Eppendorf公司产品。实施例1基于阿胶样品DNA提取：采用专利201410317118.7(一种从阿胶中快速提取DNA的试剂盒及其提取方法)中公开的方法进行提取，步骤不再赘述，提取的基因组DNA经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定OD260/OD280值均为1.8-1.9左右，浓度在10ng/μl以上，说明DNA纯度较高，浓度适中，符合PCR扩增要求。。1、靶基因的选择与引物设计：相比基因组而言，线粒体在组织中拷贝数高，而且阿胶经过深度加工后破坏程度相对小，所以优先选用线粒体16SrDNA基因。设计驴和猪通用外侧引物及内侧引物，扩增片段小，使引物与靶点更容易结合。引物和探针序列见表1.2、多重巢式荧光检测试剂盒的设计：该试剂盒包括上述驴和猪通用外侧引物及内侧引物组合物，驴和猪特异探针混合物，2×qPCRMasterMix(由Taq热启动酶、镁离子浓度2.5mM、4种dNTP的终浓度各为250μM、Tris-H2SO4pH9.0、甜菜碱3％和超纯水组成)，此外还包括驴和猪阳性标准品、阴性对照品(其他源性DNA)和空白对照(双蒸水)。使用上述试剂盒进行多重巢式实时荧光PCR检测，是将内外侧引物及探针放入同一反应体系中共同扩增，无需开管，避免污染。PCR反应体系20μL见表2。3、PCR扩增条件为两步法:95℃10min；95℃10s，70℃，35s，在此收集荧光信号，15个循环；95℃10s，60℃，35s，在此收集荧光信号，40个循环。6、结果分析：每次试验设立阳性对照、阴性对照及空白对照，试验结束后打开分析软件，分析实验结果，给出ΔRn(第n个循环时的荧光增加值)与扩增曲线Ct值，根据不同探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定阿胶中是否含有驴、猪源性成分。结果见附图1，JOE荧光修饰驴源性特异探针有扩增曲线，说明待检样本检出驴源性成分，图2，FAM荧光修饰猪源性特异探针有扩增曲线，说明待检样本检出猪源性成分，图3，JOE和FAM荧光修饰探针同时有扩增曲线，说明待检样本检出驴和猪源性成分。实施例2试剂盒特异性验证利用本发明提供的检测试剂盒，分别以牛、猪、马、驴、骆驼、牦牛、山羊、绵羊、兔、鱼、鸡、鸭、水貂及狐狸等动物皮张或新鲜组织提取基因组DNA为模板，按照上述方法进行多重巢式实时荧光PCR检测，验证本试剂盒的特异性。检测结果见表3，只有驴、猪的基因组DNA被检出，其余动物源性均未检出，说明本试剂盒检测方法具有很好的特异性。表3特异性验证实施例3灵敏度实验将驴、猪基因组DNA分别定量到5×10-2ng/μl，5pg/μl和0.5pg/μl，0.05pg/μl，0.005pg/μl每个PCR反应分别加入驴和猪不同浓度的DNA为模板，加量为2μl，即DNA含量分别为0.1ng，0.01ng，1pg，0.1pg,0.01pg，按照上述PCR体系及检测方法进行扩增，结果见图4和图5，从图中可以看出，本发明检测限为0.1pg，检测灵敏度到皮克级，相对其他检测灵敏度提高了1000倍。实施例4实际样品检测应用市售样本30份，不同品牌厂家及不同生产批次样本，按照本发明提供的检测方法，提取DNA，进行多重巢式实时荧光PCR检测，见表4，其中18份样本检出驴源性，7份样本同时检出驴和猪源性成分，5份样本未检出驴和猪源性。说明本发明提供的检测方法具有很好的应用价值。表4实际样品检测上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。