与相关申请的交叉参考本申请要求来自2011年2月24日提交的名称为“MOLECULARTESTINGOFTWINPREGNANCIES”的美国临时申请号61/446,256的优先权，并且是它的非临时申请，所述美国临时申请的完整内容以引用方式并入本文用于所有目的。本申请涉及2010年11月5日提交的、Lo等人共同拥有的名称为\FetalGenomicAnalysisFromAMaternalBiologicalSample\的美国专利申请号12/940,993(代理人案号80015-006710US)，所述美国专利申请的公开内容全文以引用方式并入。
背景技术：
多胎妊娠指的是其中孕妇怀有超过一个胎儿的妊娠。双胎妊娠是最常见形式的多胎妊娠。单卵双生指的是源自相同受精卵的一对双胞胎。因此，该对双胞胎具有整个全基因组的相同基因构成。二卵双生是源自两个不同受精卵的一对双胞胎。该对双胞胎的基因构成将是不同的。相反，这对双胞胎的基因构成的相似性将类似在不同时间出生的一对同胞。关于双胎妊娠的接合性的信息常规上已通过超声扫描(ChauhanSP等人AmJObstetGynecol2010；203:305-315)或侵入性产前诊断(例如羊膜穿刺术)(ChenCP等人HumReprod2000；15:929-934)获得。此类接合性信息可用于后续产科管理。例如，在执行羊膜穿刺术以用于非整倍性检测的事件中，涉及二卵双生的妊娠将要求每个羊膜囊的个别取样。对于涉及两个羊膜囊的单卵双生妊娠，理论上仅需要两个羊膜囊之一的取样。然而，超声扫描可以是不准确或受限制的(例如胎儿具有不同性别)，并且侵入性产前诊断可导致对胎儿和/或母亲有害。相应地，希望提供关于具有多胎儿的妊娠的接合性信息的新技术。
技术实现要素：
本发明的实施例提供了用于使用取自母亲的生物样品测定多胎妊娠的接合性的方法、系统和仪器，其对于胎儿是非侵入性的。可对于特定染色体区域分析样品(例如血浆)中的胎儿和母体DNA，以鉴定胎儿中的基因差异。例如，当胎儿是二卵的时，用于测量主要(primary)或次要(secondary)等位基因的标准化参数可显示关于不同染色体区域的变化。如果胎儿是遗传上相同的，则此类变化可相对于期望值进行测定。提供统计方法以用于分析标准化参数的变化，以测定胎儿DNA浓度和在多个基因座处的母系-胎儿混合的基因型。亲本基因型和单元型信息也可用于鉴定不同亲本单元型的继承，以指示在胎儿中的遗传差异。在其他利益中，多胎妊娠的接合性的测定可帮助例如使用母血完成的非侵入性产前测试程序的使用。根据一个实施例，用于分析具有多个胎儿的妊娠女性的生物样品以测定妊娠女性的至少两个胎儿是否是二卵的方法。生物样品包含胎儿和母体DNA。在第一染色体区域内的一个或多个第一基因座中的每一基因座处测定妊娠女性的基因型。母亲在第一基因座中的每一基因座处是纯合的，或在第一基因座中的每一基因座处是杂合的。第一基因座中的每一个显示出生物样品中各自的主要等位基因和各自的次要等位基因。对于第一基因座中的每一个，各自的主要等位基因比各自的次要等位基因更丰富。在生物样品中在一个或多个第一基因座处测量一个或多个主要等位基因的第一个量和/或一个或多个次要等位基因的第二个量。获得对于第一个量或第二个量的标准化参数。比较标准化参数与截断值，以测定如果胎儿对于第一染色体区域是遗传上相同的，则标准化参数是否在统计上不同于期望值。期望值得自生物样品的测量。基于标准化参数与截断值的比较，测定妊娠女性的至少两个胎儿是否是二卵的。根据另一个实施例，在生物样品中测量在一个或多个第一基因座处测量的一个或多个胎儿特异性序列的第一个量。获得对于第一个量的标准化参数。比较标准化参数与截断值，以测定如果胎儿对于第一染色体区域是遗传上相同的，则标准化参数是否在统计上不同于期望值。期望值得自生物样品的测量。随后，基于标准化参数与截断值的比较，测定妊娠女性的至少两个胎儿是否是二卵的。根据另一个实施例，对于多个染色体区域中的每一个，在生物样品中在各自的染色体区域中的一个或多个基因座中的每一基因座处测量一个或多个等位基因，并且在每个基因座处测定每个测量的等位基因的各自量。基于测量的等位基因的各自量测定胎儿中的至少两个是否已继承来自第一亲本的各自染色体区域的不同单元型。测定其中胎儿中的至少两个已继承来自第一亲本的不同单元型的染色体区域的第一个量。比较第一个量与一个或多个截断值，以测定胎儿中的至少两个是否是二卵的。根据另一个实施例，如下制备直方图。对于多个染色体区域中的每一个：鉴定在各自的染色体区域中的一个或多个基因座，在生物样品中在所述基因座处检测到各自的第一等位基因和各自的第二等位基因，在生物样品中在一个或多个基因座处测量一个或多个第一等位基因的第一个量和/或一个或多个第二等位基因的第二个量，并且获得对于第一个量或第二个量的标准化参数。基于对于标准化参数具有指定值的多个染色体区域增大直方图的计数器。鉴定对应于基因座的染色体区域，在所述基因座处母亲是纯合的并且胎儿中的至少一个是杂合的，或在所述基因座处母亲是杂合的并且胎儿中的至少一个是纯合的。使多组分混合模型与对应于鉴定的染色体区域的直方图拟合。多组分混合模型包括对于多个组分中的每一个的混合系数。使用混合系数中的至少两个测定胎儿中的至少两个是否是二卵的。根据另一个实施例，提供了测定来自具有至少两个胎儿的妊娠女性的生物样品中的胎儿DNA百分比的方法。对于多个染色体区域中的每一个：鉴定在各自的染色体区域中的一个或多个基因座，在生物样品中在所述基因座处检测到各自的第一等位基因和各自的第二等位基因，在生物样品中在一个或多个基因座处测量一个或多个第一等位基因的第一个量和/或一个或多个第二等位基因的第二个量，并且获得对于第一个量或第二个量的标准化参数。基于对于标准化参数具有指定值的多个染色体区域增大直方图的计数器。使概率分布的线性组合与直方图拟合，其中胎儿DNA百分比是概率分布的线性组合的输入。改变输入胎儿DNA百分比，以发现最佳化概率分布的线性组合与直方图的拟合的最佳胎儿DNA百分比。其他实施例涉及与本文描述的方法相关的系统和计算机可读介质。本发明的性质和优点的更佳理解可关于下述详述和附图获得。附图说明图1是示出根据本发明的实施例的方法100的流程图，所述方法100用于分析具有多个胎儿的妊娠女性的生物样品，以测定妊娠女性的至少两个胎儿是否是二卵的。图2A和2B显示了当对于给定染色体区域已知在两个基因座处的亲本单元型时，用于测定胎儿的接合性的例子。图2A显示了其中母亲在两个基因座处是纯合的并且父亲是杂合的例子。图2B显示了其中母亲在两个基因座处是杂合的并且父亲是纯合的例子。图3还显示了其中基因座具有四个不同等位基因的微卫星分析的例子。图4是示出根据本发明的实施例的方法400的流程图，所述方法400用于分析具有多个胎儿的妊娠女性的生物样品，以测定妊娠女性的至少两个胎儿对于第一染色体区域是否是遗传上不同的。图5是示出方法500的流程图，所述方法500用于通过测定对于来自第一亲本的第一染色体区域的表观部分参数(fractionalparameter)(例如胎儿DNA浓度)测定妊娠女性的至少两个胎儿对于该第一染色体区域是否是遗传上不同的。图6和7示出了根据本发明的实施例，使用母体血浆中的胎儿DNA部分(fraction)中的区域基因组变化揭示双胎妊娠的接合性。图8显示了根据本发明的实施例，对于贡献等量的胎儿DNA的二卵双生的胎儿DNA浓度的示例直方图。图9显示了根据本发明的实施例，当两个胎儿对母体血浆样品贡献不同量的DNA时，基于SNP分析的部分(fractional)胎儿DNA分布的直方图。图10显示了在怀有一对二卵双生的孕妇中重组对表观部分胎儿DNA浓度(fractionalfetalDNAconcentration)的作用的例子。图11是示出根据本发明的实施例的方法1100的流程图，所述方法1100测定来自具有至少两个胎儿的妊娠女性的生物样品中的胎儿DNA百分比，并且测定胎儿中的至少两个是否是二卵的。图12A-12E是显示根据本发明实施例的推导SNP分析的结果的表。图13显示了关于二卵妊娠的两个不同峰的鉴定。图14显示了关于单卵妊娠的一个峰的鉴定。图15显示了对于怀有单卵和二卵双生的孕妇的不同染色体区域的血浆部分胎儿DNA浓度。图16显示了假定一对单卵双生的存在，测定随机变异的水平的模拟分析。图17显示了根据本发明的实施例，示出对于三个胎儿(胎儿A、B和C)的多个可能峰的直方图。图18显示了可与根据本发明的实施例的系统和方法一起使用的示例计算机系统1800的方框图。定义如本文使用的术语“生物样品”指的是取自受试者(例如人，例如孕妇)并含有一种或多种目的核酸分子的任何样品。例子包括血浆、唾液、胸膜液、汗、腹水液、胆汁、尿、血清、胰液、粪便和宫颈涂片样品。术语“核酸”或“多核苷酸”指的是以单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非具体限制，该术语包含含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参考核酸相似的结合性质并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，特定核酸序列无疑还包含其保守修饰的变体(例如简并密码子置换)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指示的序列。具体地，简并密码子置换可通过生成其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三个位置由混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列来实现(BatzerMA等人，NucleicAcidRes1991；19:5081；OhtsukaE等人，JBiolChem1985；260:2605-2608；和RossoliniGM等人，MolCellProbes1994；8:91-98)。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、小非编码RNA、微小RNA(miRNA)、Piwi-相互作用RNA和由基因或基因座编码的小发夹RNA(shRNA)互换使用。术语“基因”意指涉及于产生多肽链或转录的RNA产物的DNA区段。它可包括在编码区前和后的区域(引导区和非转录尾区)以及在各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。如本文使用的术语“反应”指的是涉及化学、酶促或物理反应的任何过程，所述反应指示特定目的多核苷酸序列的存在或不存在。“反应”的例子是扩增反应例如聚合酶链反应(PCR)。“反应”的另一个例子是通过合成、连接、杂交或降解的测序反应。“信息反应”是指示一个或多个特定目的多核苷酸序列的存在的反应，并且在一种情况下仅存在一个目的序列。如本文使用的术语“孔”指的是在局限结构内的预定位置处的反应，所述局限结构例如孔形小瓶、小室、PCR阵列中的室、乳状液中的小滴、颗粒、纳米孔或表面上的区域。如本文使用的术语“过度表现的核酸序列”指的是比生物样品中的其他序列更丰富的在两个目的序列(例如临床有关序列和本底序列)中的核酸序列。如本文使用的术语“基于”意指“至少部分基于”，并且指的是在另一个值的测定中使用的一个值(或结果)，例如在方法的输入和该方法的输出的关系中发生的。如本文使用的术语“衍生”还指的是方法的输入和该方法的输出的关系，例如当衍生是公式的计算时发生的。如本文使用的术语“定量数据”意指得自一个或多个反应且提供一个或多个数值的数据。例如，显示用于特定序列的荧光标记的孔数目将是定量数据。如本文使用的术语“参数”意指表征定量数据集和/或定量数据集之间的数字关系的数值。例如，在第一核酸序列的第一个量和第二核酸序列的第二个量之间的比(或比的函数)是参数。如本文使用的，术语“基因座”或其复数形式是在整个基因组上具有变化的任何长度的核苷酸(或碱基对)的位置或地址。术语“等位基因”指的是在相同物理基因组基因座处的备选DNA序列，其可导致或不导致不同的表型性状。在具有每个染色体(除了男性人受试者中的性染色体外)的两个拷贝的任何特定二倍体生物中，关于每个基因的基因型包含在那个基因座处存在的等位基因对，其在纯合子中是相同的并且在杂合子中是不同的。生物群体或物种一般包括在多个个体中的每个基因座处的多个等位基因。其中在群体中发现超过一个等位基因的基因组基因座称为多态位点。在基因座处的等位基因变化可测量为存在的等位基因数目(即多态性程度)，或群体中的杂合子比例(即杂合性率)。序列(例如基因)的存在或不存在也视为等位基因变化的类型，因为基因座可包括该序列或不包括该序列。例如通过连接通常在缺失序列前和后出现的序列，可鉴定序列(例如RHD基因)的这种不存在。如本文使用的，术语“多态性”指的是人基因组中的任何个体间变化，与其频率无关。此类变化的例子包括但不限于单核苷酸多态性、简单串联重复多态性、插入-缺失多态性、突变(其可以是引起疾病的)和拷贝数变化。如本文使用的术语“单元型”指的是在相同染色体或染色体区域上一起传递的在多个基因座处的等位基因组合。单元型可指的是少至一对基因座或染色体区域或整个染色体。“染色体区域”指的是关于特定染色体的多个核苷酸位置。染色体区域可以是整个染色体或较小的部分。在正常人中，染色体区域将具有两个单元型，区域在其内的染色体的每个拷贝一个。两个单元型在染色体区域中可以是相同或不同的。如本文使用的术语“截断值”意指其值用于在生物样品分类的两个或更多个状态(例如患病和非患病)之间仲裁的数值。例如，如果参数大于截断值，则作出定量数据的第一分类(例如患病状态)；或如果参数小于截断值，则作出定量数据的不同分类(例如非患病状态)。如本文使用的术语“不平衡”意指如通过一些临床有关核酸序列中的至少一个截断值定义的与参考数量的任何显著偏差。例如，参考数量可以是3/5的比，并且因此如果测量的比是1:1，则将发生不平衡。术语“测序标签”指的是得自核酸分子的全部或部分的序列，例如DNA片段。在一个实施例中，仅测序片段的一个末端，例如约30bp。测序标签随后可与参考基因组比对。作为另外一种选择，可测序片段的两个末端，以生成两个测序标签，其可提供比对中的更大准确度，并且还提供片段长度。在另外一个实施例中，线性DNA片段可例如通过连接而环化，并且可测序跨越连接位点的部分。术语“通用测序”指的是其中衔接子加入片段的末端并且用于测序的引物附着至衔接子的测序。因此，任何片段均可用相同引物进行测序，并且因此测序可以是随机的。如本文使用的术语“分类”指的是与样品的特定性质相关的任何数目或其他字符(包括字)。例如，“+”号可表明样品分类为具有缺失或扩增。术语“截断”和“阈值”指的是在操作中使用的预定数目。例如，截断大小可指的是超过其的片段被排除的大小。阈值可以是超过或低于其就应用特定分类的值。这些术语中的任一均可在这些背景中的任一中使用。术语“直方图”指的是贮存在指定范围内的多个数据点的计数的数据结构。例如，染色体区域数目显示出在一组值上的参数(例如胎儿DNA百分比)。术语“最佳的”指的是测定为在数字上优于一个或多个其他值的任何值。例如，最佳值不一定是最可能的值，而是可仅仅满足标准(例如来自先前值的成本函数中的变化在容许量内)。具体实施方式胎儿DNA已显示存在于孕妇的血浆和血清中(Lo等人Lancet1997；350:485-487；和美国专利6,258,540)。母体血浆或血清中的胎儿DNA的分析具有它是相对非侵入性的优点，仅需要母亲血液的样品。与用于产前筛选的常规非侵入性方法例如超声扫描比较，测试母体血浆或血清中的胎儿DNA将允许胎儿遗传信息的直接评估。此处，我们示出了可如何分析母体血浆或血清(或其他生物样品)中的DNA的原理，以区分孕妇是怀有单卵还是二卵胎儿(例如一对单卵或二卵双生)。首先，跨越多个染色体区域的分析测定在胎儿基因组之间的差异水平，其用于执行关于胎儿接合性的分类。接下来，我们讨论分析特定染色体区域的具体例子，以测定当两个不同父系单元型在多个基因座处是已知的，并且母亲在这些基因座处是纯合的时(还讨论了其中母亲是杂合的并且父亲是纯合的例子)，胎儿在该区域中是否在遗传上不同(例如如果双胞胎各自已继承不同的父系单元型)。还描述了当两个亲本的基因型信息均是已知时的其他例子，例如当三个或更多个不同等位基因在特定基因座处时。随后，描述了比较和/或鉴定在表观胎儿DNA浓度的量度中的变化或跨越区域的其他参数的变化的技术。此类技术可使用明确的母系基因型信息，或经由含有胎儿和母体DNA的生物样品的测量例如孕妇的血浆推导母系基因型。还解释了用于多胎妊娠的推导技术。I.使用不同染色体区域测定接合性单卵胎儿是遗传上相同的，而二卵胎儿是遗传上不同的。遗传差异的程度将类似于在其他妊娠时相同亲本生育的其他同胞。然而，由于统计机率，二卵胎儿可共享在基因组的部分处的相同遗传序列。胎儿通常对于特定染色体区域具有两个单元型(其可以是相同或不同的)，关于染色体的两个拷贝各自的一个单元型。如果胎儿是单卵的，则胎儿将在染色体区域中具有相同的两个单元型。此外，由于统计机率，二卵胎儿可对于给定染色体区域具有相同对的单元型。实施例可分析多个染色体区域，以测定胎儿是否已继承不同单元型，并且随后不同的区域百分比(或其他参数)用于测定胎儿是单卵的还是二卵的。可分析指定数目的染色体区域以获得所需统计显著性。A.方法图1是示出根据本发明的实施例的方法100的流程图，所述方法100用于分析具有多个胎儿的妊娠女性的生物样品，以测定妊娠女性的至少两个胎儿是否是二卵的。生物样品包括胎儿和母体DNA。例如，可使用来自孕妇的血浆。方法100可使用计算机系统实现，如本文描述的任何方法可以一样。在步骤110中，对于多个染色体区域中的每一个，在各自的染色体区域中的一个或多个基因座中的每一基因座处测量生物样品中的一个或多个等位基因。在生物样品中的DNA可通过多种技术进行分析，所述多种技术包括定量聚合酶链反应(PCR)、数字PCR、测序(例如Sanger测序和大规模平行测序)、连接、杂交和质谱法(例如SequenomMassARRAY平台)，以测量在该基因座处的特定等位基因。对于测序，在测序前可执行富集步骤，以增加来自特定组的染色体区域的DNA片段的百分比。在一个实施例中，可使用溶液相(例如使用AgilentSureSelect平台)或固体相(例如使用RocheNimbleGen平台)杂交执行此类富集步骤。测量步骤自身可使用得自任何一种或多种上述技术的数据实现。例如，测序标签可与参考基因组比对，以鉴定由其获得测序标签的相应DNA片段的位置和等位基因。可用于分析生物样品中的DNA的一种方法是称为选择区域数字分析(DANSR)的技术，其涉及杂交、连接、扩增和大规模平行测序的步骤(SparksAB等人AmJObstetGynecol2012；doi:10.1016/j.ajog.2012.01.030)。可使用的大规模平行测序平台的例子包括IlluminaGenomeAnalyzer平台、LifeTechnologiesSOLiD、IonTorrentandIonProton系统、Roche454系统、来自Helicos的单分子测序系统、PacificBiosciences、或基于纳米孔的系统(例如来自OxfordNanoporeTechnologies的系统)。在另一个实施例中，执行靶标测序，其中捕获或扩增所选基因组区域(例如含有SNP或其他类型的变化例如微卫星多态性的那些)，并且随后优先对于此类捕获或扩增区域执行大规模平行测序。在一个实施例中，使用AgilentSureSelect系统执行靶标测序(LiaoGJ等人ClinChem2011；57:92-101)。靶标测序还可使用RocheNimbleGen系统执行。数字PCR可用于分析母体血浆中的单个DNA分子(VogelsteinB和KinzlerKW.ProcNatlAcadSciUSA1999；96:9236-9241；LoYMD等人ProcNatlAcadSciUSA2007；104；13116-13121)。数字PCR可使用多种平台执行，包括但不限于微流体(LunFMF等人ClinChem2008；54:1664-1672)，乳滴PCR(DressmanD等人ProcNatlAcadSciUSA2003；100:8817-8822)，包括RainDance平台(KissMM等人AnalChem2008；80:8975-8981)。在步骤120中，测定每个测量的等位基因的各自量。例如，可测序(例如使用通用测序)样品中的DNA片段，以获得测序标签(其可以是配对末端标签)，并且测序标签可与参考基因组比对，以鉴定片段的基因组位置。如果母亲和/或胎儿的基因组在基因座处均具有变化，则对于该基因座测量不同等位基因。可跟踪对应于在基因座处的每个等位基因的片段的各自量。在特定基因座处的特定等位基因的各自量可以多种方式进行测量，例如通过片段的数目或比例、在相同多态位点处的不同等位基因之间的比、在微阵列杂交上的信号强度、在实时PCR中的阈值循环或阈值循环中的差异、如通过数字PCR检测的对于等位基因阳性的反应的比例或数目、和质谱法分析中的峰高。在步骤130中，对于多个染色体区域中的每一个，基于测量的等位基因的各自量测定胎儿中的两个是否已继承来自第一亲本的各自染色体区域的不同单元型。如果一个胎儿继承第一单元型并且另一个胎儿继承不同单元型，则这指示二卵。如果存在超过两个胎儿，则一对可继承相同单元型并且不同对可继承不同单元型。在一个实施例中，不同单元型的继承可由在一个或多个基因座处测量的等位基因数据推断。例如，推导方法可用于鉴定胎儿基因组中的差异，如下文描述的。在另一个实施例中，来自亲本中的一个或多个的基因型信息可以是已知的。此类信息可允许来自仅一个胎儿的测量用于测定不同单元型是否已从第一亲本继承。例如，如果在第一基因座处在亲本中存在三个不同基因型，则随后可使用仅第一基因座作出决定。然而，如果在基因座处仅存在两个基因型，则随后可能需要在另一基因座处的测量。一些例子在下文提供。如果多个基因座用于染色体区域，则来自基因座的数据可以不同方式组合。例如，如果已知等位基因与特定单元型相关，则随后在特定基因座处具有特定等位基因的片段数目的计数有效成为关于特定单元型的片段数目的计数。例如，通过总计具有第一单元型的等位基因和基因座的片段计数，可测定对应于第一亲本(例如父亲)的第一单元型的片段数目。作为另外一种选择，可对于每个基因座独立地作出测定，并且关于每个基因座的测定可就一致性进行比较。在步骤140中，测定其中胎儿中的至少两个已继承来自第一亲本的不同单元型的染色体区域的第一个量。第一个量可仅仅是已鉴定为在胎儿之间具有差异的染色体区域数目。作为另一个例子，第一个量可以是鉴定为在胎儿之间具有差异的染色体区域百分比。在步骤150中，比较第一个量与一个或多个截断值，以测定两个胎儿是单卵的还是二卵的。例如，第一个量可以是百分比(或其他比例)，例如10％，并且这个量可与截断值比较，其中超过5％分类为二卵的。可基于所需准确度、步骤130中的测定准确度、使用的染色体区域数目、和群体中的不同染色体区域的连锁不平衡和分析的不同染色体区域之间的重组概率，测定截断值，其在下一个部分中描述。在一个方面，如果存在超过两个胎儿，则测定可仅是一对是二卵的，从而留下另一对是单卵的可能性。B.关于单元型检测的统计分析如上所述，来自亲本的染色体区域的两个单元型(即当不同时)的继承指示该对双胞胎是二卵而不是单卵的。例如，在染色体区域的第一基因座处的两个父系单元型的检测将指示该对双胞胎是二卵的。然而，存在用于检测母体血浆样品中的染色体区域的仅一个父系单元型的几种可能解释。首先，两个胎儿可仅偶然地已继承来自父亲的染色体区域中的相同父系单元型。当它们是一对单卵双生时，它们将跨越全基因组一直继承来自父亲的相同父系单元型。然而，即使它们是二卵双生，对于任何特定区域也存在它们将继承来自父亲的相同父系单元型的50％机率。然而，该对二卵双生将跨越全基因组继承相同父系单元型将是非常不可能的。在另一种情况下，两个二卵双生胎儿可继承不同的父系单元型，但由于取样不足，仅一个父系单元型在特定分析中检测到。这些多种情况发生的概率依赖对于特定染色体区域分析的在母体血浆样品中的部分胎儿DNA浓度和母体血浆DNA分子数目。下文，我们提供了关于对应于染色体区域的多少分子以及多少染色体区域可用于取得具有足够统计力的强分类的计算，以使由于取样不足的假单元型解读的机率降到最低。需要分析的对应于特定染色体区域的分子数目可以下述方式进行测定。当父系单元型存在于母体血浆中时，在特定母体血浆DNA样品中检测到它的概率依赖携带那个父系单元型的胎儿DNA的部分浓度和分析的分子总数目，并且受泊松分布控制。表1显示了对应于需要分析的目的染色体区域的分子数目，使得具有在母体血浆中存在但在特定样品中未检测到的父系单元型的概率小于1％。该数字基于下式进行计算：0.01>exp(–Nxf/2)，其中N是需要分析的分子数目；f是由单个双胞胎儿贡献的部分胎儿DNA浓度；并且exp是指数函数。分子数目是用于分析染色体区域的任何基因座处的DNA片段数目。需要分析以实现检测父系单元型的所需确定性的分子数目可通过测量染色体区域中的一个基因座直到表1中列出的数目来取得。作为另外一种选择，如果分析相同染色体区域中的几个基因座，则需要分析的分子数目/基因座可减少至基因座数目乘以分析的平均分子数目/基因座达到表1中列出的分子数目的程度。表1：待分析以对于各种胎儿DNA浓度达到检测父系单元型的小于1％概率的DNA片段数目还可测定需要分析的染色体区域数目。假定染色体区域不处于连锁不平衡，两个二卵双生继承不同父系单元型的机率对于不同染色体区域中的每一个将是50％。如果染色体区域的数目是n，则对于这n个染色体区域中的每一个已继承相同父系单元型的一对二卵双生的概率将是2-n。因此，当分析七个独立染色体区域时，对于7个区域中的每一个已继承相同父系单元型的一对二卵双生的概率将小于1％。在这种情况下，在步骤140中的截断可以是14％，其中在七个中显示不同继承单元型的一个区域将提供二卵的分类。还可使用一个区域的绝对值。如果使用大量区域(例如50或100个)，则可允许一个或多个区域指示不同的继承单元型，同时仍提供单卵的分类。II.使用亲本基因型鉴定胎儿单元型如上所述，在染色体区域的一个或多个基因座处的亲本基因型可用于帮助测定两个胎儿是否已继承来自亲本的不同单元型。例如，可使用对应于母体血浆样品中的相同基因组区域的两个不同父系单元型的检测，所述母体血浆样品得自具有双胎妊娠的女性。尽管下文分析集中于基于两个不同父系单元型的检测的例子，但技术的变动也可应用于两个不同的母系单元型。a.在两个基因座处的SNP分析图2A显示了当对于给定染色体区域已知在两个不同基因座处的母亲基因型和父亲单元型时，用于测定接合性的例子。这个实施例集中于双胞胎的妊娠母亲是纯合的并且双胞胎的父亲是杂合的SNP基因座。在图2A中所示的例子中，母亲在SNP基因座1和2处是纯合的，分别具有基因型AA和TT。父亲在SNP基因座1和2处是杂合的，分别具有基因型AC和GT。假定基因座1和2是紧密的，即重组不太可能(例如在两个基因座之间发生重组的概率<0.1％)在两个基因座之间发生，在两个基因座处的等位基因将由胎儿一起继承且形成单元型。因为母亲对于基因座1和基因座2是纯合的，所以她具有两个相同的单元型。我们将这两个相同的母系单元型定义为HapI和HapII。另一方面，父亲具有两个不同的单元型，并且如图2A中示出的，我们将它们定义为HapIII和IV。当孕妇携带一对单卵双生时，两个胎儿的基因构成将是相同的。换言之，两个父系单元型中的仅一个将由这两个双胞胎儿继承。在示出例子中，两个胎儿均继承来自父亲的HapIII。当分析母体血浆样品时，仅等位基因A将对于基因座1检测到，因为母亲和两个胎儿对于等位基因A均是纯合的。当待分析的对应于基因座1的分子数目足够大时，母体血浆中的C等位基因的不存在将指示胎儿无一已继承来自父亲的HapIV。需要分析的分子数目将依赖母体血浆DNA样品中的部分胎儿DNA浓度，和排除母体血浆样品中的C等位基因的存在所需的统计力，例如如表1中所示。另一方面，T和G等位基因将在关于基因座2的母体血浆样品中检测到。因为母亲对于T等位基因是纯合的，这指示胎儿中的至少一个继承来自父亲的HapIII。来自基因座1和基因座2的信息一并考虑，两个胎儿将均已继承来自父亲的HapIII。在二卵双生的情况下，两个双胞胎儿可继承来自父亲的不同单元型。在图2A的例子中，双胞胎1已继承来自父亲的HapIII，并且双胞胎2已继承来自父亲的HapIV。因此，在母体血浆中，A和C等位基因可对于基因座1检测到，并且G和T等位基因可对于基因座2检测到。可定量在基因座处的等位基因检测，以确保检测不是假的(例如由于分析误差，测量特定类型的仅一个或两个等位基因)。例如，可测量特定类型的等位基因数目且与阈值比较，这确保已测量统计上显著量的特定等位基因。截断可基于对于样品作出的测量数目(例如对于特定基因座测量的等位基因数目)改变。例如，如果对于基因座测量1,000个等位基因，则阈值可大于仅在该基因座处测量100个等位基因的情况。因此，如果测量的量超过阈值，则等位基因可视为检测到。这些发现指示父系HapIII和HapIV均存在于母体血浆中。因为每个胎儿可仅继承来自父亲的一个单元型，这些发现还指示两个胎儿已继承来自父亲的不同单元型，并且因此它们在遗传上不同。因此，两个胎儿将鉴定为已继承关于包括基因座1和2的染色体区域的不同单元型，并且像这样两个胎儿可测定为一对二卵双生，例如仅使用这个染色体区域或与来自其他染色体区域的数据组合。相应地，当第一亲本是父亲时，第一亲本的两个单元型可对于第一染色体区域在多个基因座处进行测定。例如，对于特定染色体区域可测定HapIII和HapIV。测定胎儿中的两个已继承来自第一亲本的第一染色体区域的不同单元型可如下进行。可在第一染色体区域中鉴定在该处第一亲本是杂合的第一基因座和第二基因座(例如基因座1和基因座2)，并且在基因座1和基因座2处的父系独特的等位基因(即在母体基因组中不表示)不存在于相同父系单元型上。可在生物样品中检测在第一基因座处统计上显著量的第一亲本的第一单元型。如上所述，当母亲对于第一单元型上的第一等位基因(对于基因座1，A)是纯合的，并且父亲对于第二等位基因是杂合的时(其对于基因座1是HapIV)，可实现这点。可检测具有第二等位基因(对于基因座1，C)的DNA片段数目，并且与截断(阈值)值比较，以测定是否已检测到统计上显著量的第一单元型。含有第二等位基因的DNA片段数目(第二等位基因的测量量的例子)可单独使用(例如截断可以是绝对数)或标准化(例如截断可以是比例)。随后可在生物样品中检测在第二基因座处统计上显著量的第一亲本的第二单元型。如上所述，当母亲对于第二单元型上的第三等位基因(对于基因座2，T)是纯合的，并且父亲对于第四等位基因是杂合的时(其对于基因座2是HapIII)，可实现这点。可检测具有第四等位基因(对于基因座1，G)的DNA片段数目，并且与截断(阈值)值比较，以测定是否已检测到统计上显著量的第一单元型。应注意到第三和第四等位基因可再次是A和C，但在HapIII上具有C。相应地，实施例可测定对于染色体区域的第一亲本的第一单元型是否由胎儿中的任一个继承。如果第一单元型已继承，则随后测定对于染色体区域的第一亲本的第二单元型是否由胎儿中的任一个继承。如果第二单元型也已对于染色体区域继承，则随后将胎儿分类为二卵的。上文讨论提供其中第一亲本是父亲的例子，现在提供其中第一亲本是母亲的例子。两个母系单元型的定量分析也可用于测定两个胎儿是单卵的还是二卵的。图2B显示了当对于给定染色体区域已知在两个不同基因座处的父亲基因型和母亲单元型时，用于测定接合性的例子。在其中两个胎儿是单卵的情况下，两个胎儿将对于所有染色体区域继承相同的母系单元型。由胎儿继承的单元型将以更高浓度存在于母体血浆中。两个母系单元型的浓度中的差异与母体血浆中的胎儿DNA的部分浓度成比例。这显示于图2B中，对于基因座1，其中A等位基因通过与20％胎儿DNA浓度成比例的差异比B等位基因更频繁出现。随后，对于基因座2，存在等量的等位基因A和等位基因B，因为父亲对于等位基因B是纯合的。如果胎儿贡献不等百分比的胎儿DNA，则关于基因座1的等位基因A与B的比将依赖总胎儿DNA百分比(即各个胎儿DNA百分比的总和)。如果胎儿贡献不等百分比的胎儿DNA，则关于基因座1的等位基因A与B的比将与总部分胎儿DNA浓度(即各个部分胎儿DNA浓度或胎儿DNA百分比的总和)正相关。在本发明中，术语部分胎儿DNA浓度和胎儿DNA百分比可互换使用。另一方面，当两个胎儿是二卵的时，两个胎儿可继承在任何染色体区域处的不同母系单元型。当两个胎儿继承在特定染色体区域处的不同母系单元型时，两个母系单元型将以等量存在于母体血浆中。因此，在一个或多个染色体区域处的两个母系单元型的等量表示的存在可潜在地用于指示一对二卵双生的存在。这个相等表示将其自身表现为对于基因座1和基因座2在等位基因A和B之间的相同差异，但过度表现的等位基因是不同的。过度表现的等位基因来自不同单元型的事实可用于鉴定胎儿已鉴定母亲的不同单元型。应注意到过度表现的程度是总胎儿DNA百分比的一半(如所示的10％)。此类现象在以后更详细地讨论。如果胎儿贡献不等百分比的胎儿DNA，则关于基因座1的等位基因A与B的比将依赖由双胞胎1贡献的胎儿DNA百分比；并且关于基因座2的等位基因A与B的比将依赖由双胞胎2贡献的胎儿DNA百分比。应注意到在HapI上的等位基因对于两个基因座无需是相同的。相应地，当母系单元型在第一基因座和第二基因座处是已知的时，方法可检测被检测母亲的不同单元型。如图2B中，父亲对于第一等位基因在第一基因座处是纯合的(如所示的A)，并且母亲对于在第一基因座处的第一等位基因和第二等位基因(如所示的B)是杂合的。第一等位基因在母亲的第一单元型上(如所示的HapI)，并且第二等位基因在第二单元型上(如所示的HapII)。检测在第一基因座处的第一亲本的第一单元型可包括测定在第一基因座处测量的第一等位基因的各自量以统计上显著量超过在第二基因座处测量的第二等位基因的各自量。这由110:90的比显示。在一个实现中，截断值可用于确保在值之间的差异是统计上显著的。对于第二基因座，父亲对于第三等位基因在第二基因座处是纯合的(如所示的B，但可以是任何等位基因包括A)，并且母亲对于在第一基因座处的第三等位基因和第四等位基因(如所示的A)是杂合的。第三等位基因在母亲的第一单元型上，并且第四等位基因在第二单元型上。在生物样品中检测在第二基因座处的第一亲本的第二单元型可包括测定在第二基因座处测量的第四等位基因的各自量以统计上显著量超过在第二基因座处测量的第三等位基因的各自量。b.关于其他类型的多态性的分析上文例子涉及在基因座处的不同核苷酸，所述基因座用于测定对于染色体区域不同单元型是否已从第一亲本继承。然而，SNP以外的多态性也可用作不同父系单元型的标记。其他类型的多态性的例子包括但不限于微卫星、限制性片段长度多态性、插入/缺失多态性和拷贝数变异(CNV)。此类其他多态性可导致图2A和2B的构型，但其中第一等位基因和第二等位基因起因于这些其他多态性之一。对于任何多态性，还可存在超过两个等位基因。下文是例子。图3还显示了其中基因座具有四个不同等位基因的微卫星分析的例子。微卫星是包含可变数目的短串联重复(STR)的基因组中的多态性区域。在这个例子中，母亲对于这个微卫星区域具有两个不同等位基因，即等位基因I和等位基因II，分别包含4和7个重复。父亲也具有两个不同等位基因，即等位基因III和等位基因IV，分别包含5和8个重复。因此，基因座实际上在亲本中具有四个不同等位基因。因为一对单卵双生的基因构成将是相同的，所以它们将已继承相同父系等位基因。因此，仅一个父系等位基因可在母体血浆中检测到。在这个例子中，仅具有5个重复的父系等位基因III连同具有4个重复的母系等位基因I一起可在母体血浆样品中检测到。当对于给定染色体区域分析多个基因座并且对于基因座中的每一个仅一个父系等位基因可在母体血浆样品中检测到时，随后将如上所述在统计上测定双胞胎是单卵的概率。另一方面，当该对双胞胎是二卵的时，两个双胞胎儿可继承不同父系等位基因。如图3中示出的，二卵双生之一已继承来自父亲的等位基因III，并且另一个已继承等位基因IV。因此，两个父系等位基因均可例如经由上文描述的检测方法在母体血浆样品中检测到。换言之，如果两个父系等位基因均可同时在母体血浆样品中检测到，则双胞胎儿将是二卵的，除非胎儿具有染色体异常(例如胎儿在基因座处是三体的)。如果母亲在该基因座处是纯合的，例如对于为4个的重复(或多态性的任何其他等位基因)，则可执行相似分析。因此，在其中多态性具有三个或更多个等位基因的情况下，如果两个父系继承的等位基因(两者在孕妇的基因组中均不存在)在母体血浆中检测到，则可检测二卵双生妊娠。在一个实施例中，母体血浆中的此类基因型模式由双胎妊娠的存在的超声证据支持。在不存在双胎妊娠的此类超声证据的情况下，此类血浆基因型模式将指示三体胎儿的存在(GhantaS等人PLoSONE2010；5:e13184)。III.鉴定基因组区域中的变化先前部分描述了用于测定染色体区域的不同单元型是否从第一亲本继承的示例技术。在此类例子中，亲本基因型信息对于两个亲本是已知的并且在分析中使用。在下述说明中，不需要亲本的基因型，尽管它可使用。例如，胎儿DNA浓度(或其他参数)将显示对于二卵胎儿在多个基因座处的不同值。A.一般方法图4是示出根据本发明的实施例的方法400的流程图，所述方法400用于分析具有多个胎儿的妊娠女性的生物样品，以测定妊娠女性的至少两个胎儿对于第一染色体区域是否是遗传上不同的。与其他方法一样，生物样品包括胎儿和母体DNA。方法400可用于执行方法100的步骤130。在步骤410中，妊娠女性的基因型在第一染色体区域内的一个或多个第一基因座中的每一基因座处进行测定。第一基因座是这样的：妊娠女性在一个或多个第一基因座中的每一基因座处是纯合的，或在一个或多个第一基因座中的每一基因座处是杂合的。相应地，第一基因座中的每一个对于母系基因型具有相同种类(即纯合或杂合的)。基因型可以多种方法进行测定。例如，可分析来自妊娠女性的全血的血沉棕黄层或细胞团块层，其中占优势地仅存在母体DNA或其他仅母体样品。可使用标准基因型技术。作为另一个例子，可由包括胎儿和母体DNA的生物样品的分析推导基因型(此类技术在下文更详细地描述)。第一基因座中的每一个显示出主要等位基因和次要等位基因，即生物样品含有关于基因座中的每一个的主要等位基因和次要等位基因。当母亲在第一基因座处是纯合的时，次要等位基因由至少一个胎儿贡献。在此类情况下，每个基因座将具有主要等位基因和次要等位基因，其中主要等位基因比次要等位基因更丰富。当母亲是杂合的并且至少一个胎儿是纯合的时，主要等位基因也比次要等位基因更丰富。然而，当母亲是杂合的并且所有胎儿也是杂合的时(对于相同等位基因)，主要等位基因和次要等位基因均不是更丰富的。基因座各自具有主要等位基因和次要等位基因的事实可以多个方法进行测定，例如通过检测等位基因(参见步骤420)或亲本基因型的了解(推导或明确的)。在步骤420中，可在生物样品中检测在第一基因座中的每一基因座处各自的主要等位基因和/或各自的次要等位基因。对于其中仅主要等位基因或仅次要等位基因检测到的实施例，其他等位基因的存在的了解可通过关于亲本基因型的一些信息获得。例如，如果检测到次要等位基因B并且母亲已知在基因座处对于主要等位基因A是纯合的，则随后可测定生物样品在该基因座处具有两个等位基因。此类例子是下述情况：其中母亲是RhD阴性的(并且因此关于等位基因纯合通过RHD基因的不存在表示)，并且RHD基因在生物样品中检测到。还可检测在每个基因座处的两个等位基因。如果主要和次要等位基因已知在基因座处存在，则随后可鉴定胎儿基因型，以有效地具有相似种类。例如，如果母亲对于在基因座之一处的等位基因A是纯合的，则随后等位基因A将是主要等位基因。另外，因为将检测到次要等位基因B，所以已知胎儿中的至少一个是杂合的。因此，所有第一基因座将具有种类AAAB，其中下标指示胎儿中的至少一个是杂合的。对于其中母亲是杂合AB并且胎儿中的至少一个是纯合AA的例子，随后B再次将是次要等位基因，并且A将是主要等位基因。在这种情况下，所有第一基因座将具有种类ABAA，其中下标指示胎儿中的至少一个是纯合的。在步骤430中，在生物样品中在一个或多个基因座处测量一个或多个主要等位基因的第一个量和/或一个或多个次要等位基因的第二个量。每个基因座可具有不同的主要等位基因，但可合并(例如总计)每个主要等位基因的量，以获得第一个量。这可同样对于第二个量完成。在一个实施例中，仅测定第一个量。在另一个实施例中，仅测定第二个量。在另外一个实施例中，测定第一个和第二个量。步骤420和430可同时完成，并且因此有效地是相同步骤。在步骤440中，获得对于第一个量或第二个量的标准化参数。在一个实施例中，通过计算对于第一区域的部分参数值(例如部分胎儿DNA浓度)获得标准化参数，其中部分(fraction)是相对于第二个量的第一个量。在一个方面，部分胎儿DNA浓度是表观值，因为当两个胎儿在第一染色体区域中是遗传上不同的时(例如仅一个是杂合的)，它可不同于实际胎儿DNA浓度。在另一个实施例中，标准化参数以校准方式即以相同方式或相关方式获得作为期望值，其在下文描述。相关方式可以是重现性地提供具有固定差异或比的值的任何程序(例如一种技术有规则地提供另一种技术的值的1.2倍，或存在关于将得自一种技术的结果转换为另一种技术的期望值的转换曲线。因此，标准化参数可仅仅是第一个量(或第二个量)，如果它以校准方式获得。标准化参数也可通过计算来自另一个染色体区域内的一个或多个基因座的一种或多种其他序列(例如等位基因或纯合序列)的第三个量进行测定，并且随后使用第三个量标准化第一个量或第二个量。此类标准化(以及其他类型的标准化)可允许使用不同技术或未校准的技术对于其他区域计算的量的比较。对于校准技术，第一个量或第二个量可与来自其他区域的测量比较。使用第一个量或第二个量可传递相同信息。在步骤450中，比较标准化参数与截断值，以测定如果胎儿对于第一染色体区域是遗传上相同的，则标准化参数是否统计上不同于期望值。例如，当所有胎儿均为杂合或纯合的时，如果仅胎儿中的一个与数目比较是杂合的，则次要等位基因的数目将是不同的。期望值(例如胎儿DNA浓度)可得自生物样品的测量，例如来自其他染色体区域，定量染色体Y序列的量或使用一种或多种后生标记，如下文更详细地描述。其他期望值可源自胎儿DNA浓度的此类测量或可直接测量，并且因此期望值并不限于预期的胎儿DNA浓度。截断值可基于所需准确度进行选择。例如，可已知期望值测量的标准差。随后，截断可选择为期望值减去(或当情况允许时加上)三倍标准差(SD)。以这种方式，实施例可基于与截断值的相关测定标准化参数与期望值的差异(或比与1的偏差)是统计上显著的。在其他实施例中，截断可以是2.0、2.5、3.5或4个SD。在步骤460中，基于标准化参数与截断值的比较，测定妊娠女性的两个胎儿是否是二卵的。例如，可测定当标准化参数统计上不同于期望值时，妊娠女性的两个胎儿对于第一染色体区域是遗传上不同的。如果标准化参数与期望值并无统计上不同，则随后胎儿可测定为单卵的。染色体区域的此类测定可与来自其他染色体区域的用于测定接合性的测量(例如如上文对于步骤150描述的)组合。作为另外一种选择，对于第一染色体区域不是相同的两个胎儿的测定可提供二卵的分类，而无需其他染色体区域的测量。B.表观部分参数(胎儿DNA浓度)如上所述，步骤440中的标准化参数可以是部分值(fractionalvalue)，包括第一个量和第二个量。图5是示出方法500的流程图，所述方法500用于通过测定关于来自第一亲本的第一染色体区域的表观部分参数(例如胎儿DNA浓度)测定妊娠女性的至少两个胎儿对于该第一染色体区域是否是遗传上不同的。方法500分析具有多个胎儿的妊娠女性的生物样品，如方法400中。尽管方法500描述的是其中母亲在第一基因座处是纯合的情况，但该方法可同样对于其中母亲是杂合的基因座执行。在步骤510中，鉴定在第一染色体区域内的一个或多个基因座，在所述基因座处妊娠女性是纯合的并且胎儿中的至少一个是杂合的。在此类情况下，每个基因座将具有主要等位基因和次要等位基因，其中主要等位基因比次要等位基因更丰富。例如，如果母亲对于等位基因A是纯合的，那么则随后等位基因A将是主要等位基因。作为另外一种选择，可鉴定一个或多个基因座，在所述基因座处妊娠女性是杂合的并且胎儿中的至少一个是纯合的，其中对于胎儿纯合的等位基因将是主要等位基因。此类基因座可通过分析起因于测量步骤例如步骤110的等位基因进行鉴定。例如，在特定基因座处的等位基因的测量可显示大多数例如大于70％是等位基因A(主要等位基因)，并且仅一个另一等位基因(例如T)以显著量计数。此类测量可指示母亲对于等位基因A是纯合的，并且胎儿中的至少一个对于等位基因T是杂合的。不同截断(例如更高部分的次要等位基因)可用于测定母亲是否是杂合的并且至少一个胎儿是否是纯合的。可基于假定或测量的胎儿DNA浓度测定用于测定基因座是否满足上文条件的多个截断值。美国专利申请号12/940,993对于具有一个胎儿的妊娠更详细地描述了此类技术。下文的其他部分提供了用于获得在多胎妊娠中的基因座的基因型信息的更复杂程序。在步骤520中，在生物样品中在一个或多个基因座处测量一个或多个主要等位基因的第一个量q。每个基因座可具有不同的主要等位基因，但可合并(例如总计)每个主要等位基因的量，以获得第一个量。以这种方式，关于染色体区域的分析的覆盖深度是基本上增加的，因为使用多个基因座。例如，可对于每个基因座测量有限量的等位基因，但一旦基因座以聚集体显现，就可测量足够数目的等位基因，以获得统计坚固性。可选择在染色体区域内的基因座，以使得在基因座之间的重组概率很低，例如小于1％。在步骤530中，在生物样品中在一个或多个基因座处测量一个或多个次要等位基因的第二个量p。以相似方式，每个基因座可具有不同的次要等位基因，但可合并(例如总计)每个次要等位基因的量，以获得第二个量。次要等位基因可起于基因座中的不同单元型。在步骤540中，由第一个量和第二个量测定第一参数。第一参数提供在第一个量和第二个量之间的相对量。例如，第一参数可以是如下计算的部分胎儿DNA浓度F的量度：F＝2p/(p+q)。其他例子包括两个量的任何比，第一个量的函数比，或此类比的函数。另一个例子是可以是可标准化的两个量之间的差异。在步骤550中，比较第一参数与截断值，以测定如果两个胎儿在第一染色体区域中是遗传上相同的，则第一参数是否在统计上不同于期望值。例如，如果两个胎儿对于第一染色体区域中的基因座处的主要和次要等位基因是杂合的，则随后当使用上式时，第一参数应等于总胎儿DNA浓度。然而，如果胎儿之一在基因座处也是纯合的，则随后胎儿DNA浓度将小于总胎儿DNA浓度。预期的胎儿DNA浓度可得自生物样品的测量，例如来自其他染色体区域，如果两个胎儿均已知是男性(例如通过超声扫描)则测量染色体Y序列的量，或使用一种或多种后生标记，两者均在下文更详细地描述。其他期望值可源自胎儿DNA浓度的此类测量或可直接测量，并且因此期望值并不限于预期的胎儿DNA浓度。在步骤560中，基于第一参数与截断值的比较，测定妊娠女性的两个胎儿是否是二卵的。例如，可测定当第一参数统计上不同于期望值时，妊娠女性的两个胎儿在第一染色体区域中是遗传上不同的。如果标准化参数与期望值并无统计上不同，则随后胎儿可测定为单卵的。当第一参数是部分胎儿DNA浓度时，第一参数可以是表观部分胎儿DNA浓度，并且不是实际胎儿DNA浓度。使用术语表观是因为当两个胎儿是二卵的时，部分胎儿DNA浓度的计算可不同，并且因此计算的值不是实际部分胎儿DNA浓度。相应地，根据下式可测定在多态基因座(例如SNP基因座)处的母体血浆样品中的表观部分胎儿DNA浓度(F)，所述多态基因座在母亲中是纯合的并且对于双胞胎中的至少一个是杂合的：F＝2p/(p+q)，其中p是携带胎儿特异性等位基因的DNA分子的计数，并且q是携带由胎儿和母亲共享的等位基因的DNA分子的计数。适合于表观部分胎儿DNA浓度分析的SNP基因座是其中两个不同等位基因对于个别SNP基因座在母体血浆中检测到的那些，如本申请的先前部分中描述的。此类基因座可具有其中母亲是纯合或杂合的类型，但当比较时区域应具有相同类型。对于部分胎儿DNA浓度的计算，可使用来自一个SNP基因座或多个SNP基因座的信息。来自多个SNP基因座的红色计数可总计在一起。换言之，将整个基因组的SNP基因座分成“组”。一组的基因座应优选在同一邻接DNA段中。在一个实施例中，此类组涉及在相同染色体臂上的SNP。另一个实施例中，此类组涉及在1kb、5kb或10kbDNA段内的SNP。在每组内的SNP基因座数目将依赖部分胎儿DNA浓度的测量和每个SNP基因座的覆盖深度(即检测且定量每个SNP基因座的数目)的所需精确度。在一个方面，部分浓度的测量的所需精确度将是允许测定两个不同组的SNP基因座是否具有相同或至少两个不同的表观部分胎儿DNA浓度的最小精确度。对于每个SNP基因座的更高覆盖深度，可减少精确地测量部分胎儿DNA浓度所需的SNP数目。在一个实施例中，关于目的SNP基因座的覆盖深度可通过靶标测序方法增加(LiaoGJ等人ClinChem2011；57:92-101.)。在这种方法中，血浆DNA分子首先与探针杂交，所述探针与目的区域中的序列互补，并且使捕获分子进行大规模平行测序。关于所需分子数目的计算将在以后部分中讨论。C.使用关于不同区域的量作为期望值如上所述，可由另一个染色体区域的分析测定期望值。例如，可对于第二染色体区域测定第二参数(例如以与上文描述相似的方式)，并且此类值可用作期望值。在对于第二染色体区域的基因座处(例如当母亲是纯合的A:A并且父亲已知是T:T时)所有胎儿均为杂合例如A:T的情况下，随后得自两个等位基因的两个量的第二参数可提供关于总胎儿DNA浓度的期望值。随后，当关于第一区域的第一参数统计上不同于期望值时，如对于第二区域测定的，数据暗示仅一个胎儿在第一染色体区域中的基因座处是杂合的，并且胎儿是遗传上不同的。其他技术可用于测定期望值，如下一个部分中解释的。还可测定其他染色体区域的参数，并且每一个均可用于方法400的多次迭代中。多个实施例可将测定参数分组成簇并且测定簇是否彼此不同，如以后更详细地描述的。此类簇可首先滤过，以确保使用母亲的相似区域，例如以确保母亲在参数值被聚簇的区域处是纯合的。随后，如果参数值的两个或更多个簇在数据中出现，则可推测一些区域在胎儿之间是相同的，但其他区域不同，从而指示二卵。相应地，在母体血浆中的胎儿DNA部分中的区域基因组变化可揭示双胎妊娠的接合性。在下文例子中，使用表观部分胎儿DNA浓度分析，但还可使用其他参数。一对双胞胎是单卵还是二卵的测定可通过使用多个SNP基因座分析表观部分胎儿DNA浓度来实现。表观胎儿DNA浓度是使用胎儿特异性遗传标记在特定区域处测量的胎儿DNA浓度。当胎儿中的至少两个是二卵的时，在特定区域处的表观胎儿DNA浓度可不同于实际胎儿DNA浓度。对于单卵双生，表观部分胎儿DNA浓度将在整个全基因组的不同SNP基因座处是相似的。然而，对于二卵双生，由于两个胎儿的基因型中的差异，表观部分胎儿DNA浓度将显示双峰或三峰分布。在此类方法中，不需要关于父亲和/或母亲的单元型信息，尽管也可使用。使用表观胎儿DNA浓度的例子图6和7示出了根据本发明的实施例，使用母体血浆中的胎儿DNA部分中的区域基因组变化揭示双胎妊娠的接合性。图6显示了其中双胞胎是单卵的例子，并且图7显示了其中双胞胎是二卵的例子。显示了在两个SNP基因座(基因座1和基因座2)处的父亲、母亲和该对双胞胎(单卵或二卵)的基因型。这两个基因座均来自不同染色体区域，并且因此是两个不同组的部分，其中使用上文术语。为了示出目的，我们假定两个双胞胎各自将贡献10％的母体血浆DNA，并且在母体血浆样品中存在总共100个基因组当量的DNA。一个基因组当量是在整倍体人细胞中含有的DNA量。在其他情况下，两个胎儿各自对生物样品(例如母体血浆)贡献不同量的DNA。对于单卵双生(如图6中所示)，它们的遗传组成是相同的。因此，两个双胞胎在基因座1和基因座2处均为杂合的，并且适合于通过定量母体血浆样品中的共享和胎儿特异性等位基因测定表观部分胎儿DNA浓度的任何其他基因座。对于基因座1，携带A等位基因的180个分子和携带T等位基因的20个分子存在于母体血浆中，因此产生20％的表观部分胎儿DNA浓度[20x2/(180+20)]。对于基因座2，还通过定量G和C等位基因检测到20％的表观部分胎儿DNA浓度。因为两个双胞胎儿的遗传构成是相同的，当双胞胎1在特定SNP基因座处是杂合的时，双胞胎2也将在相同SNP基因座处是杂合的。因此，在整个全基因组任何SNP基因座处测量的表观部分胎儿DNA浓度将是相似的。对于二卵双生，关于至少部分基因组的基因型将是不同的。如图7中示出的，双胞胎1和双胞胎2在基因座1处均为杂合的，因此给出20％的表观部分胎儿DNA浓度。另一方面，双胞胎1对于在基因座2处的G等位基因是纯合的，而双胞胎2是杂合的。因此，基于G和C等位基因的数量，在基因座2处的表观部分胎儿DNA浓度是10％[10x2/(10+190)]。换言之，当两个胎儿在基因座处均为杂合的时，表观部分胎儿DNA浓度将是20％。然而，当仅一个胎儿在基因座处是杂合的时，表观部分胎儿DNA浓度将是减少的(例如如果通过双胞胎的每个成员释放的胎儿DNA的量是相等的，则为10％)。因此，当表观部分胎儿DNA浓度在多个SNP基因座处进行测量时，当两个胎儿贡献等量的胎儿DNA时，将存在双峰分布。双胞胎的每个成员将不同量的DNA释放到母体血浆内是可能的。在这种情况下，当分析母体血浆DNA时，将可见部分胎儿DNA浓度的三峰分布，这在下文讨论。D.用于测量期望值的其他技术如上所述，可由在其他染色体区域处的遗传测量测定期望值(例如实际部分胎儿DNA浓度)。用于测量这个变化的另一种方法是比较使用遗传标记测定的胎儿DNA的部分浓度(或一些其他参数)与使用另一种方法测量的那种，例如基于性质不是遗传性的标记的那种。因此，还可通过其他测量来测定期望值(例如来自所有胎儿的总部分胎儿DNA浓度)。一个实施例涉及生物样品中的胎盘特异性后生标记例如DNA甲基化的量的测量。在一个实施例中，可使用后生标记测量胎儿DNA的部分浓度。在一种实现中，后生标记可以是DNA甲基化标记。胎儿DNA甲基化标记的一个例子是在血浆中显示出源自胎儿的和源自母体的DNA之间的差异DNA甲基化模式的标记(美国专利6,927,028)。此类标记的一个例子是编码乳腺丝抑蛋白(maspin)的SERPINB5基因，其在母体血浆中存在的胎儿DNA中是低甲基化的，但对于母体血浆中的母体DNA是超甲基化的(美国专利8,026,067)。另一个例子是RASSF1A基因，其在母体血浆中存在的胎儿DNA中是超甲基化的，但对于母体血浆中的母体DNA是低甲基化的(美国专利7,754,428)。其他DNA甲基化标记在其他地方描述(PapageorgiouEA等人AmJPathol2009；174:1609-1618)。此类DNA甲基化标记可使用本领域技术人员众所周知的许多技术在母体血浆中进行检测，包括甲基化特异性PCR(HermanJG等人ProcNatlAcadSciUSA1996；93:9821-9826)、实时甲基化特异性PCR(LoYMD等人CancerRes1999；59:3899-3903)或MethyLight(EadsC等人NucleicAcidsRes2000；28:E32)、亚硫酸氢盐测序(FrommerM.ProcNatlAcadSciUSA1992；89:1827-1831)、甲基化敏感的限制性酶消化(ChanKCA等人ClinChem2006；52:2211-2218)、甲基-BEAMing(LiM等人NatBiotechnol2009；27:858-863)、和大规模平行测序(KomoriHK等人GenomeRes2011；21:1738-1745)。作为例子，使用RASSF1A作为分子标记，可通过测量母体血浆中的超甲基化RASSF1A序列在总体(即超甲基化的加上低甲基化的)RASSF1A序列上的比例，计算母体血浆中的部分胎儿DNA浓度。对于单卵双生妊娠，使用跨越基因组不同部分的一个或一系列胎儿遗传标记测量的母体血浆中的部分胎儿DNA浓度应与使用如这段第一句中所述的RASSF1ADNA甲基化标记系统测量的浓度具有紧密关联。然而，对于二卵双生妊娠，使用胎儿遗传标记测量的部分胎儿DNA浓度之间的关联应显示出与RASSF1ADNA甲基化标记系统的更弱关联。在一个实施例中，可使用一系列这些类型的标记中的每一个分析在遗传和DNA甲基化标记系统之间的关联。例如，关联可使用皮尔森相关或线性回归进行检查。其他类型的后生标记包括基于组蛋白修饰例如甲基化和乙酰化的那些。另一个实施例是测量在胎儿基因组中存在但在母体基因组中不存在的遗传序列的量。此类遗传序列的例子包括关于妊娠的RHD基因，其中母亲是RhD-阴性的，并且父亲对于RHD是纯合阳性的。因此，如果所有胎儿均为RhD-阳性的，并且母亲是RhD-阴性的，RHD基因可用于测定实际胎儿DNA浓度。另一个例子是仅涉及男性胎儿的多胎妊娠中的染色体Y序列的量的测量。例如，如果所有胎儿均为男性，则随后可使用在Y染色体上的基因座测量实际胎儿DNA浓度。因此，通过测量具有选自一种或多种胎儿特异性序列的胎儿特异性序列的DNA片段的第三个量，一个实施例可使用遗传标记计算期望值(例如胎儿DNA浓度)。因为计算具有期望值(例如胎儿DNA浓度)，如果胎儿是遗传上相同的，则所有胎儿均具有胎儿特异性序列(例如上文例子之一)。例如经由本文描述的方法获得关于第三个量的标准化值，以测定标准化参数。标准化值随后可用作期望值(例如胎儿DNA浓度)。一种实现鉴定一个或多个第二基因座，在所述基因座处胎儿具有各自的第一等位基因，并且母亲不具有各自的第一等位基因。胎儿特异性序列随后是各自的第一等位基因。可通过测量在一个或多个第二基因座处的等位基因总量，并且由第三个量与总量的比计算胎儿DNA浓度，获得关于第三个量的标准化值。E.非多态性胎儿特异性序列在另一个实施例中，非多态性胎儿特异性序列可用于测量表观部分胎儿DNA浓度。例如，可就非胎儿特异性序列例如编码瘦素的LEP基因而言测量母体血浆样品中的染色体Y序列的量。染色体Y与LEPDNA比可与期望值比较，所述期望值例如如使用胎盘特异性DNA甲基化标记测量的总部分胎儿DNA浓度。如果部分染色体Y浓度不同于期望值，则它暗示妊娠涉及至少一组二卵胎儿，并且至少一个胎儿是男性，以及至少一个胎儿是女性。除了部分染色体Y量外，在母体血浆样品中的染色体Y序列的量的绝对值也可用作测定接合性的量度，如以后在下文描述的。相应地，可在生物样品中在一个或多个第一基因座处测量一种或多种胎儿特异性序列(其可包括非多态序列)的第一个量。可获得对于第一个量的标准化参数，并且随后如本文描述的用于测定胎儿中的至少两个是否是二卵的。F.绝对胎儿DNA浓度作为部分胎儿DNA浓度的替代，可使用关于染色体区域的次要等位基因的测量(例如计数)的绝对值，只要执行一些校准(绝对标准化)。此类用途在不计算明确部分的意义上称为“绝对的”。例如，如果可校准测量步骤以使得来自区域的一定量的DNA片段可得到控制或从一个实验关联到另一个，主要等位基因的量无疑可测定为总数减去关于次要等位基因的第二个量。除了了解关于区域(即对于该区域的特定基因座)的DNA片段的量(例如数目)的绝对值外，DNA片段从一个区域到另一个的固定比可提供校准。例如，可调用以特定方式制备样品的方案，使得来自第一区域的DNA片段总数目是关于第二区域的DNA片段总数目的数目的1.4倍。这个定标因子随后可用作比较的部分。在一个实施例中，已知量的DNA或其他类型的校准物可加入生物样品中。以这种方式，来自不同染色体区域的次要等位基因(或其他胎儿特异性遗传标记)的量可直接彼此比较。在此类情况下，参数仍使用主要等位基因的第一个量有效计算，但此类值由于校准而消失(即第一个量，或第一个量加上第二个量是相同的，并且因此它们从等式中抵消)。例如，除了计数数字PCR结果或分析测序数据外，标记也可通过适当构建的校准曲线进行测量，使得如果靶标浓度是相同的，则标记将进行校准以给出相同的定量读数。以相似方式，来自不同染色体区域的主要等位基因的第一个量可彼此比较，并且此类变化可对于次要等位基因的量提供本文描述的相同结果，因为第一个量将与第二个量中的方差相反改变(例如对于二卵胎儿将可见第一个量中的两个峰，与图8比较)。相应地，对于给定组的此类胎儿特异性遗传标记，它们在单卵和二卵双生妊娠中的关联将是不同的。在一个实施例中，标记使用数字PCR进行定量，在所述情况下它们将在单卵双生妊娠中都给出相同或相似的测量量。相反地，在二卵双生妊娠中，此类标记的比例将给出更分散的结果。为了示出起见，假定二卵妊娠中的两个胎儿均将相同浓度的胎儿DNA释放到母体血浆内(尽管不一定是这种情况)。随后对于其中两个胎儿均已继承在母亲基因组中不存在的相同父系继承的等位基因的第一标记，测量的第一标记(例如当母亲是纯合的时，次要等位基因)的量应是通过第二标记测量的量的两倍，在第二标记中仅胎儿中的一个已继承在母亲基因组中不存在的父系继承的等位基因。对于各自释放不同量的胎儿DNA的二卵双生，测量的第一标记的量将超过第二标记的量，但两个值将不相差2倍。作为校准程序的例子，使用数字PCR分析，可使用相同的母体血浆DNA样品和以相同平均模板分子浓度/数字PCR反应，执行关于在基因座1处的胎儿特异性等位基因的定量和关于在基因座2处的另一种胎儿特异性等位基因的定量。在此类情况下，非胎儿DNA的本底量对于基因座1和基因座2是相同的。因此，可仅仅计数对于在基因座1处的胎儿特异性等位基因阳性的数字PCR孔数目，以测定在基因座1处的胎儿DNA的表观绝对量。可在基因座2处执行相同过程，以测定胎儿DNA的表观绝对量。两个绝对值随后可彼此比较(例如其中一个用作期望值)或与以另一种方式(例如如上所述)测定的期望值比较，以测定统计上显著的差异是否存在。G.检测胎儿DNA浓度中的差异图8显示了根据本发明的实施例，对于贡献等量的胎儿DNA的二卵双生的胎儿DNA浓度的示例直方图800。在直方图中，横(X)轴是胎儿DNA浓度。对于染色体区域测量的胎儿DNA浓度(绝对或部分)可用于增大关于包括测量值的范围的计数器。因为当仅胎儿中的一个具有胎儿特异性等位基因时，可见第一个峰810对应于对于基因座测量的胎儿DNA浓度，而当两个胎儿均具有胎儿特异性等位基因时，第二个峰820对应于对于基因座测量的胎儿DNA浓度。峰820对应于实际胎儿DNA浓度，而峰810对应于表观胎儿DNA浓度。因为可见两个峰，所以可推测胎儿是二卵的。在一个方面，峰的相对高度可用于测定接合性，例如作为步骤150的部分。直方图800还可帮助示出其中实际胎儿DNA浓度使用除了由多个染色体区域处的参数值制备直方图外的技术测量的方法。例如，实际胎儿DNA浓度可测量为2F％(例如使用后生方法)。随后，如果分析属于峰810的区域，则关于表观DNA浓度的测量参数应出现在峰810附近，这将是远离2F％值的统计上显著距离。峰的位置是一组标准化参数(这个例子中为胎儿DNA浓度)的统计值的一个例子，其中所述组是关于曲线815和820之一的数据点(即标准化参数的计数)。例如，峰820是关于由曲线825表示的标准化参数组的统计值，并且峰820可用作期望值。应注意到曲线815和825(当与潜在(underlying)数据拟合时)是概率分布和混合模型的组分的例子，如以后将讨论的。测定从两个不同部分胎儿DNA浓度区分出一个需要多少读数计数可如下进行。假定两个二卵双生各自将贡献F％的母体DNA。将存在SNP基因座的两个群体(簇)，显示在母体血浆中的两个不同部分胎儿DNA浓度。在一个SNP群体中，表观部分浓度是F％，而在另一个SNP群体中，表观部分浓度是2F％。先前组的SNP基因座的分布标准差(SD)将是其中N是与这组SNP基因座比对的读数总数目。后面一组SNP基因座的SD也近似等于如果则两个SNP基因座群体可以小于5％重叠区分。因此，N>16(1-F％)/F％。表2显示了对于F％的多个值，区分起因于两个SNP基因座群体的两个表观部分胎儿DNA浓度(F％与2F％相比较)所需的序列读数数目。表2H.关于每个胎儿的不同峰可能双胞胎的每个成员将不同量的DNA释放到母体血浆内。在这种情况下，当分析母体血浆DNA时，可见部分胎儿DNA浓度的三峰分布。三个峰中的两个将代表由两个个体双胞胎各自贡献的部分胎儿DNA浓度，而第三个峰将代表总计的两个胎儿的部分胎儿DNA总和。因此，实施例还可提供由此可推导由双胞胎的每个成员释放的DNA相对量的方法。由每个双胞胎释放的DNA量中的大偏差可能与不利结果例如双胞胎之一的危急死亡相关，这是可能的。可随着时间过去跟踪每个胎儿的胎儿DNA的不同贡献，以监控胎儿的健康。由每个双胞胎释放的相对DNA量的另一个效用将是使用母体血浆DNA的大规模平行测序用于检测胎儿染色体非整倍性，例如21三体(ChiuRWK等人ProcNatlAcadSciUSA2008；105:20458-20463；FanHC等人ProcNatlAcadSciUSA2008；105:16266-16271；SehnertAJ等人ClinChem2011；57:1042-1049；SparksAB等人AmJObstetGynecol2012；doi:10.1016/j.ajog.2012.01.030)。部分胎儿DNA浓度是此类方法的诊断灵敏度中的重要参数。因此，如果双胞胎可显示为单卵的，则随后可基本上仅使用相同算法用于处理关于胎儿21三体的非侵入性检测的大规模平行测序数据。另一方面，如果情况涉及二卵双生，则随后可首先测量由每个双胞胎贡献的胎儿DNA的相对比例；并且随后察看已将更少量的DNA释放到母体血浆内的双胞胎的部分胎儿DNA浓度是否可在使用的测序深度处检测到。需要时，可增加测序深度。换言之，实施例允许甚至对于双胎妊娠执行胎儿染色体非整倍性筛选。作为示出，假定在特定二卵双生妊娠中，胎儿1和胎儿2分别贡献妊娠母亲的血浆中的3％和2％DNA。假定希望使用母亲血浆的大规模平行测序执行21三体检测(ChiuRWK等人ProcNatlAcadSciUSA2008；105:20458-20463)。使用实施例将允许我们测定3％和2％的部分胎儿DNA浓度，以及由两个胎儿一起贡献的部分胎儿DNA浓度，即5％。如果部分胎儿DNA浓度是2％，则允许强21三体检测需要完成的测序深度将是足以检测21三体胎儿的那种。在所需的测序深度和胎儿DNA的部分浓度之间的关系先前已得到报道(FanHC等人PLoSONE2010；5:e10439；ChiuRWK等人BMJ2011；342:c7401)。相似考虑还可应用于13三体、18三体(ChenEZ等人PLoSONE2011；6:e21791；PalomakiGE等人GenetMed2012；doi:10.1038/gim.2011.73)、性染色体非整倍性(LauTK等人JMaternFetalNeonatalMed2011；doi:10.3109/14767058.2011.635730)、染色体易位(LunFM等人ClinChem2011；57:917-919)和染色体少量缺失(PetersD等人NEnglJMed2011；365:1847-1848)的产前检测。相应地，部分胎儿DNA浓度的计算对于产前诊断的其他应用可以是必需的。例如，通过母体血浆分析的非侵入性产前诊断的准确度可依赖在母体血浆样品中预期评估的由胎儿贡献的DNA部分浓度。对于染色体非整倍性的产前检测，母体血浆中的受累染色体的另外染色体剂量与部分胎儿DNA浓度成比例。由两个胎儿各自贡献的部分胎儿DNA浓度可使用上文描述的技术如下进行测定。图9显示了根据本发明的实施例，当两个胎儿对母体血浆样品贡献不同量的DNA时，基于SNP分析的部分胎儿DNA分布的直方图900。观察到部分胎儿DNA浓度的三个峰且对应于4％、7％和11％的部分浓度。当仅胎儿中的一个在对于其母亲是纯合的SNP基因座处是杂合的时，前两个峰对应于由两个胎儿各自贡献的部分浓度，由胎儿特异性等位基因贡献的部分将用于反映那个特定双胞胎儿的部分胎儿DNA浓度。最后一个峰对应于两个胎儿是杂合的但母亲是纯合的SNP基因座。使用这些SNP基因座计算的部分胎儿DNA浓度将是由两个胎儿贡献的总部分胎儿DNA浓度。对于需要最小部分胎儿DNA浓度以便作出准确诊断的任何应用，三个数字中最低的将是有关的，因为这将反映来自对母体血浆样品具有最小DNA贡献的胎儿的胎儿DNA的部分浓度。考虑到后面一个胎儿的部分胎儿DNA浓度，随后可调整测序深度，以提供统计上强的诊断结果。I.使用关于整个群体的统计变化在一个实施例中，关于两个或更多峰的合并群体的SD值可用于测定接合性。对于单卵胎儿，SD(在参数值扩展中的量度例子)将小于关于二卵双生的SD。这是因为潜在数据实际上来自两个峰，并且因此参数值将比存在一个峰更不同，并且测量的参数值中的扩展仅仅是由于统计变化。此类技术将不要求在特定母系基因型内的分开基因座群体的鉴定。例如，对于其中检测到两个等位基因的基因座，仍可能需要区分其中母亲是杂合的区域与其中母亲是纯合的区域。因此，在二卵双生妊娠中，如通过与母体血浆中的总DNA比较，一系列胎儿特异性遗传标记的部分浓度中的每一个或所选组合测量的，母体血浆或血清中的胎儿DNA的部分浓度将显示出比单卵双生妊娠中的部分浓度更大的变化。变化可通过本领域技术人员众所周知的统计方法进行测量，所述统计方法例如SD、范围、四分位数间距等。相应地，标准化参数中的标准差或其他方差(例如，如步骤440中计算的)可用于测定接合性。方差可与阈值比较，并且如果方差超过阈值，则随后可测定胎儿中的至少两个是二卵的。比较标准化参数与截断值以测定标准化参数是否在统计上不同于期望值的动作通过计算方差和与阈值比较有效地实现。J.关于减数分裂重组的考虑如上所述，可选择在染色体区域内的基因座，以使得在基因座之间的重组概率很低，例如小于1％。下文例子解决了当重组在染色体区域的基因座之间发生时出现的问题。如上所述，对于任何染色体区域，当两个胎儿继承相同父系单元型时，基于胎儿特异性等位基因计算的表观部分胎儿DNA浓度将代表由两个胎儿贡献的总DNA。另一方面，当在父亲是杂合(AB)并且母亲是纯合(AA)的任何SNP基因座处，两个胎儿继承来自父亲的不同父系单元型时，仅胎儿中的一个将对母体血浆贡献胎儿特异性等位基因。因此，在这些基因座处测量的表观部分胎儿DNA浓度将低于在其中两个胎儿均继承相同父系单元型的基因座处测量的值。图10显示了在怀有一对二卵双生的孕妇中重组对表观部分胎儿DNA浓度的作用的例子。在这个例子中，当父系单元型传递给双胞胎1时，在父系HapIII和HapIV之间存在重组。重组在SNP基因座3和4之间发生。有效地，双胞胎1继承关于基因座1至3的HapIII，和关于基因座4至6的HapIV。双胞胎2继承来自父亲的HapIV，而无任何重组。在关于这个孕妇的部分胎儿DNA浓度的分析过程中，仅1、2、3和5是提供信息的，因为胎儿特异性等位基因(B等位基因)将存在于母体血浆中。基因座4和6将变成不提供信息的，因为两个胎儿均继承来自父亲的A等位基因，其等于母系等位基因。另一方面，在基因座5处，两个胎儿均继承来自父亲的B等位基因，导致与对于基因座1至3测定的值比较的更高表观胎儿DNA。如果整个区域(涉及基因座1至6)用于分析表观胎儿DNA浓度，则估计浓度将在关于两个胎儿均继承相同父系单元型的区域和两个胎儿继承不同父系单元型的区域的表观部分胎儿DNA浓度之间。IV.推导的SNP调用当关于两个亲本的基因型信息是已知的时，并且当仅母亲的基因型是已知的时，上文部分描述了用于鉴定接合性的例子。然而，当不了解关于亲本的基因型信息时，可应用实施例(例如方法100和400)。在此类情况下，测量的参数值可进行分组，以便鉴定母系基因型，或至少最可能鉴定母系基因型。以这种方式，在分析取自母亲的生物样品前，无需了解先验知识。因此，实施例可推导母系基因型和胎儿基因型。应注意到一些区域可保持未分类。一旦至少一些染色体区域被分类(例如分为其中母亲是纯合的并且胎儿中的至少一个是杂合的组)，本文描述的方法就可用于测定胎儿的接合性。例如，一对双胞胎是单卵还是二卵的测定可通过使用多个SNP基因座分析表观部分胎儿DNA浓度(或其他参数)来实现。对于单卵双生，表观部分胎儿DNA浓度在跨越全基因组的不同SNP基因座处将是相似的。然而，对于二卵双生，由于两个胎儿的基因型中的差异，表观部分胎儿DNA浓度将显示双峰分布。除了测定接合性外，胎儿DNA浓度也可由遗传分析进行测定，其如上所述由于多胎妊娠而是复杂的。如上所述，除了测定接合性外，胎儿DNA浓度对于其他非侵入性胎儿诊断技术是有用的。A.方法为了测定直接来自测序数据(例如具有高倍覆盖)或PCR数据的部分胎儿DNA浓度，我们定义在SNP位点i处的可变比其中ai是在SNP基因座(位点)i处的特定等位基因(即主要等位基因)的最大计数，bi是在SNP基因座i上的另一等位基因(即次要等位基因)的次最大计数。这个值是对于其中母亲是纯合的基因座使用上式的表观胎儿DNA浓度的一半。这种技术也可与其他标准化参数一起使用，包括如上所述的绝对胎儿DNA浓度。考虑单胎妊娠的母体血浆中的SNP位点(或其他多态位点)，基于母系基因型和胎儿基因型组合，即所谓的母系-胎儿混合基因型，这些SNP位点可分类成四个种类，无疑为AAAA,、AAAB、ABAA和ABAB的形式，其中上标代表母系基因型，下标代表胎儿基因型。AA指示纯合性并且AB指示杂合性。因此，在每个SNP基因座i处的测量由等位基因A出现数目(ai)(其对应于最大计数)和等位基因B出现数目(bi)(其对应于来自测序数据的次最大计数)组成。对于种类AAAB和ABAA，部分胎儿DNA浓度将影响在每个SNP位点处的理论上，关于种类AAAA的是0，关于种类ABAB的是0.5。因此，部分胎儿DNA浓度可测定母体血浆中的母系-胎儿混合基因型的分布。原则上，部分胎儿DNA浓度的最佳估计将产生生成具有最高概率的观察到的概况的分布。实施例可区分四个种类且执行种类AAAB和ABAA的更多分析，如上文例如在方法400中所述。作为区分不同种类的部分(即，哪个染色体区域属于哪个种类)，实施例可通过发现将数据与概率分布的线性组合最佳拟合的最佳浓度来测定胎儿DNA浓度。图11是示出根据本发明的实施例的方法1100的流程图，所述方法1100测定来自具有至少两个胎儿的妊娠女性的生物样品中的胎儿DNA百分比，并且测定至少两个胎儿是否是二卵的。生物样品包含胎儿和母体DNA。在步骤1110中，通过测定对于多个染色体区域中的每一个的标准化参数(例如如上文对于方法400描述的)制备直方图。对于多个染色体区域中的每一个，鉴定在各自的染色体区域中的一个或多个基因座，在生物样品中检测在所述染色体区域处各自的第一等位基因和各自的第二等位基因。此类区域对应于上文描述的四个不同种类。等位基因可以任何合适的方式进行检测，并且可确保统计上显著量的每个等位基因。在生物样品中在一个或多个基因座处测量一个或多个第一等位基因的第一个量和/或一个或多个第二等位基因的第二个量。在基因座中的第一等位基因可以是不同等位基因，如第二等位基因可以是一样。在一种实现中，如果在染色体区域中的特定基因座处的第一等位基因比第二等位基因更丰富，则随后在各自的基因座处的所有第一等位基因均比第二等位基因更丰富。以此类方式，可合并来自多个基因座的等位基因的计数。获得对于第一个量或第二个量的标准化参数。标准化参数可以是如本文描述的任何类型。例如，标准化参数可由第一个量和第二个量进行测定，并且提供在第一个量和第二个量之间的相对量度。例子包括部分胎儿DNA浓度。标准化参数还可以是绝对部分胎儿DNA浓度，如可用合适校准测定的。在一个实施例中，使用如上定义的一旦对于每个染色体区域测定标准化参数，这些数据点就可用于制备直方图。可通过将标准化参数的可能值分离成多个子范围制备直方图的数据结构。例如，如果范围在0–0.5之间，则子范围可具有各0.01的大小。计数器可与每个子范围相关。随后可基于对于标准化参数具有指定值(即对于在相应子范围内的值)的多个染色体区域增大计数器。在步骤1120中，使概率分布的线性组合与直方图拟合。例如，两个概率分布可用于拟合关于种类AAAB和ABAA的数据。如下所述，关于这些种类中的每一个的数据点位置依赖胎儿DNA百分比。因此，胎儿DNA百分比是对概率分布的线性组合的输入。还可使用关于其他种类的分布，例如如下所述的。在另一个实施例中，数据点可已限制于特定种类AAAB和ABAA。对于双胎妊娠，如果两个胎儿对生物学血浆贡献等量的DNA，则分布数目将是二，或如果两个胎儿对母体血浆贡献不同量的DNA，则分布数目将是三。对于涉及3个或更多个胎儿的妊娠，如果每个胎儿对母体血浆贡献等量的DNA，则分布数目将等于胎儿数目。在此类实施例中，步骤1150可作为冗余省略，并且步骤1160将使用概率分布的系数。在步骤1130中，改变输入胎儿DNA百分比以发现最佳化概率分布的线性组合与直方图的拟合的最佳胎儿DNA百分比。术语“最佳的”在上文定义。作为最佳化过程的部分，可在概率分布的数据和线性组合之间测定误差。这个误差项可用于测定值何时提供与数据的足够拟合(即误差足够小，使得值称为最佳的)。在步骤1140中，一旦已知胎儿DNA百分比就鉴定对应于基因座的概率分布，在所述基因座处母亲是纯合的并且胎儿中的至少一个是杂合的，或在所述基因座处母亲是杂合的并且胎儿中的至少一个是纯合的。例如，如果使用两个线性组合，则胎儿DNA百分比可提供关于分布峰的近似位置。因为胎儿可能是二卵的(或其中至少两个)，所以峰将不在由预测的确切位置处，但两个分布可以被区分。例如，对于种类AAAB将是具有最接近于值的峰的分布，并且对于种类ABAA将是具有最接近于的峰的分布。在步骤1150中，使多组分混合模型与鉴定的概率分布拟合。多组分混合模型包括关于多个组分中的每一个的混合系数。在一个方面，组分对应于图8或9中的峰。组分可使用任何合适的函数形式例如高斯进行限定，其中每个组分将对应于不同高斯函数。如下所述，附加峰将由三胞胎导致。如果胎儿对母体血浆贡献等量的DNA(例如以解释显示实际胎儿DNA浓度的区域)，则测定混合模型中的组分数目的一种方法是使组分数目等于胎儿数目。作为另外一种选择，贝叶斯信息判据(BIC)或阿开克信息判据(AIC)可用于测定混合模型的组分数目。因此，混合模型可具有关于双胞胎的两个组分(其贡献相同量的胎儿DNA)或当双胞胎各自贡献不同量的DNA时，或对于涉及超过两个胎儿的妊娠，具有更高数目的组分。在一个实施例中，可通过将母亲基因分型来发现鉴定的分布，以便以那种方式测定种类AAAB或ABAA。在此类实施例中，将不完成步骤1130和1140。此外，值可通过其他方法例如使用后生标记进行测定。相反，可通过测定对应于特定染色体区域的概率分布来鉴定在特定染色体区域处的母亲基因型。例如，可测定对于特定染色体区域的标准化参数具有最高值的概率分布，并且使用那个概率分布测定母系基因型。因为概率分布不同地依赖胎儿DNA百分比，所以相应母系基因型是直接测定的。类似地，可通过测定概率分布(其可以是混合模型的组分)鉴定在特定染色体区域处的胎儿基因型，所述概率分布对应于特定染色体区域。例如，可测定对于特定染色体区域的标准化参数具有最高值的概率分布，并且使用那个概率分布测定在各自的SNP基因座处是杂合的胎儿的数目。因为概率分布依赖在各自的SNP基因座处是杂合的胎儿的数目以及胎儿DNA百分比，所以可推导胎儿的基因型信息。在步骤1160中，使用混合系数中的至少两个测定胎儿中的至少两个是否是二卵的。例如，混合系数中的至少两个可与阈值比较。系数的值可用于测定峰实际上是否存在。如果峰很小，则随后混合系数将是很小的，并且可假定附加峰实际上不存在(例如如果2F％是实际胎儿DNA百分比，则峰将在F％处出现)。在那种情况下，混合模型将传递实际上存在仅一个峰，并且胎儿是单卵的。如果混合系数中的两个超过阈值，则随后实际上存在至少两个峰，并且胎儿中的至少两个是二卵的。阈值可以是绝对值或与其他组分的系数比较的相对值(例如阈值可依赖系数中的一个或多个的值，例如最大值的百分比或系数的超额)。应注意到术语“系数”包含乘以系数或在组分中牵涉的任何定标因子。如果使用三个组分(例如因为每个胎儿对总胎儿DNA百分比的各个贡献是期望的或因为测试的是三胞胎)，则二卵的测定可在仅测试两个系数后停止，因为随后已鉴定二卵。在一个实施例中，混合模型的组分的峰的位置受约束，以具有超过预定值的分离缺口。分离缺口是从一个峰到最近峰的距离(如以直方图的参数值单位测量的)。预定值可依赖所需准确度和期望的结果。例如，如果希望仅仅鉴定接合性，则随后可使用模型的两个组分(例如因为来自每个个体胎儿的贡献的峰之间的区分不是期望的)，并且预定值可依赖测定的胎儿DNA浓度(例如更大的胎儿DNA浓度可导致更大的分离距离)。预定值也可依赖胎儿数目，例如对于三胞胎，不同峰的分离在相对基础上可以是更少的，因为峰可大致对应于实际胎儿DNA浓度的三分之一而不是一半。可使用峰的相对大小。例如，相对大小可指示是否存在其中胎儿是遗传上相同或胎儿是遗传上不同的更多个区域。这将依赖染色体区域的选择。然而，在胎儿的情况下，如果染色体区域的选择是随机的，则两个二卵双生继承相同父系单元型和不同父系单元型的区域数目应是相似的。此处，使用峰的相对大小可使得数据与不同分布曲线的拟合更准确。B.通过推导SNP调用分析的部分胎儿DNA测定为了示出上文原理的操作，我们执行靶标测序且应用二项式混合模型，以估计胎儿DNA浓度。二项式混合建模已成功应用于鉴定肿瘤基因组中的单核苷酸变体(GoyaR等人Bioinformatics2010；26:730-736；ShahSP等人Nature2009；461:809-813)。我们采用模型估计妊娠母体血浆中的胎儿DNA浓度。我们假定在血浆中在SNPi处的母系-胎儿混合基因型Gi＝k,k∈{AAAA,AAAB,ABAA,ABAB