一种快速鉴定花生品种对黄曲霉抗性的方法与流程

本发明涉及一种快速鉴定花生品种对黄曲霉抗性的方法，属于植物种质鉴定技术领域。

背景技术：

花生是我国重要的经济作物、油料作物和出口创汇作物，我国花生年种植面积接近500万公顷，年产量1700万吨左右。我国花生的种植面积占世界总种植面积的20％，居世界第2位；产量占世界总产量的40％左右，居世界第1位。但是花生在田间管理、收获、晾晒、储藏、运输和加工过程中容易遭受黄曲霉菌的污染而产生黄曲霉毒素，对人类的健康造成极大的危害，并严重影响我国花生及其制品的品质，成为了我国花生绿色贸易的壁垒。随着人们食品安全意识的提高，花生及其制品中的黄曲霉毒素污染已经成为一个严重的粮食安全问题。

黄曲霉毒素主要由黄曲霉和寄生黄曲霉产生的一组化学结构类似的次生代谢产物构成，目前已分离鉴定出包括B₁，B₂，G₁，G₂，M₁，M₂等12种亚型，在天然食物中以黄曲霉毒素B₁最为多见，其毒性和致癌性也最强，远远高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性。在所有黄曲霉毒素中，B的毒性最强，其毒性相当于氰化钾的10倍，砒霜的68倍。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。黄曲霉毒素的检测方法包括：薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、微柱筛选法、酶联免疫吸附法(ELISA)、多功能柱净化-柱后衍生化-高效液相色谱法、免疫亲和柱净化-荧光光度计法、免疫亲和柱净化-柱后衍生化-高效液相色谱法等。各种检测方法的前处理方法不尽相同，检测方式各异，检出限等指标也有所差异。

黄曲霉在自然界分布很广，常存在于土壤和其他物质中，侵染粮食、油料作物的种子、各种食品和饲料等。花生荚果和花生仁是黄曲霉的主要污染对象，产毒菌株侵染花生并在籽仁内产生黄曲霉毒素，食用被侵染的花生会给人畜生命造成潜在的威胁。在高温、高湿条件下，花生仁很容易受到黄曲霉的污染。近年来，人们常以防为主，强化在收获、晒种、运输、储存加工和销售等环节上的防霉措施，并采取霉挑选、物理吸附、加热去毒、氨水熏蒸、碱炼去毒、光电剔除等方法去除黄曲霉毒素，但这些方法存在成本高、药剂残留及去毒不彻底、改变花生制品的风味等缺点，从经济和生态考虑，推广和种植对黄曲霉高抗的花生品种是防止花生黄曲霉毒素污染根本措施。因此，对花生品种黄曲霉抗性的准确和快速鉴定对于花生品种的评价至关重要。

过去鉴定花生对黄曲霉侵染的抗性的方法主要由以下几种：

(1)通过人工接种后，利用为薄层色谱法和高效液相色谱法检测黄曲霉的含量，该方法操作复杂、样品检测费用高、对设备要求高，不能有效应用于花生育种研究中的抗性鉴定；

(2)通过人工接种后用肉眼观察估计黄曲霉侵染种仁的数量和程度，这种方法操作简单，但是误差较大不能有效的评价花生对黄曲霉侵染的抗性；(3)通过人工接种后分析黄曲霉毒素含量、蛋白酶抑制剂活性、脂肪氧化酶活性、几丁质酶活性等评价花生对黄曲霉的抗性，该方法较为准确，但是过程较为复杂，实际应用和推广困难；(4)通过黄曲酶菌株接种花生种子后进行暗培养，然后采用计量仪器分析天平，将暗培养后的种子称重，最后计算黄曲霉感染指数并进行抗性评价。但是该方法中，黄曲霉菌的生长量是通过不同的花生种子在侵染前和侵染后称重决定的，由于花生种子本身在侵染前后含水量的不同可能会对评价结果造成干扰，因而准确性和稳定性值得考虑；(5)前人一些田间鉴定黄曲霉抗性的实验，不仅操作困难、费时费力，而且花生品种对黄曲霉抗性表达随不同年份、种植地点、播种季节、土壤质地及轮栽类型的改变而发生波动，稳定性不强。

例如，中国专利文献CN1556391A(申请号200310111682.5)公开了一种花生对黄曲霉菌产毒抗性鉴定的方法。“花生黄曲霉产毒抗性鉴定方法，其特征是由如下步骤实现：1)花生种子表面消毒和复水；2)花生种子接种：以黄曲霉菌株接种健康花生；3)培养：接种后在培养箱中培养7天；4)提取黄曲霉毒素：经烘烤、研磨，再以甲醇提取黄曲霉毒素液；5)毒素测定：加入氨汞溶液，在荧光分光光度计上测定荧光值，以黄曲霉毒素B1与荧光值之间的标准曲线计算黄曲霉毒素B1含量并评价抗性等级。”该方法需要烘烤、研磨，再用甲醇提取黄曲霉毒素液，并需要加入氨汞溶液，通过标准曲线计算黄曲霉毒素B1的含量。操作复杂、样品检测费用高、检测过程中用到多种有毒试剂、操作不当很容易导致检测环境的污染，因此推广和应用相对困难；

中国专利文献CN102818740A(申请号201210332642.2)公开了一种花生对黄曲霉侵染的抗性的鉴定方法及其应用。该发明以黄曲酶菌株接种花生种子后进行暗培养，然后采用计量仪器分析天平，将暗培养后的种子称重，最后计算黄曲霉感染指数并进行抗性评价。由于花生种子本身在侵染前后含水量的不同可能会对评价结果造成干扰，因而该方法的准确性和稳定性值得考虑。

技术实现要素：

本发明针对现有鉴定花生对黄曲霉侵染抗性方法的缺陷，提供一种快速、准确鉴定花生黄曲霉的抗感品种的方法。该方法弥补了现行的花生黄曲霉抗性鉴定方法周期长、操作繁琐、无法定性定量观察黄曲霉侵染情况的不足，可以在较为简单的实验条件下有效的鉴定花生品种对黄曲霉的抗性，操作简单，抗性鉴定成本低，实验结果精确度高。

本发明的技术方案如下：

一种快速鉴定花生品种对黄曲霉抗性的方法，步骤如下：

(1)黄曲霉菌种活化，制备黄曲霉孢子悬浮液；

(2)将播种后80～100天的种子剥去果皮，取种皮完好的种子作为样品，用升汞进行表面消毒；然后在种子上制备(5.5～6.5mm)×(4.5～5.5mm)的去除种皮的伤口；

(3)在种子的伤口上覆盖无菌棉条，在棉条上滴加步骤(1)制备的黄曲霉孢子悬浮液10～30微升，置于无菌培养皿中；

(4)将无菌培养皿置于培养箱中进行暗培养，培养20～28小时后揭掉棉条，再培养132～156小时后，统计不同花生品种感染黄曲霉程度，计算其感染指数，来判断该品种是否抗黄曲霉，感染指数计算公式如下：

感染指数＝{(0.1n+0.2n+0.5n+0.8n+1.0n)/N}×100

其中：n为各个级别染菌的种仁粒数；N为供试总粒数；

(5)品种抗性判断标准为：感染指数＜5.0的是高抗品种；感染指数≥5.0，且＜10.0的是中抗品种；感染指数≥10.0，且＜30.0是中感品种；感染指数≥30.0，且＜50.0的是感病品种；感染指数≥50.0的是高感品种。

所述步骤(1)中的黄曲霉菌种活化为在PDA固体培养基上划线培养活化黄曲霉菌种，活化条件为在30℃的黑暗培养箱中培养6～7天；

PDA固体培养基每升组分如下：

马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂20g,pH值自然。

所述步骤(1)中黄曲霉孢子悬浮液的制备步骤如下：

用灭菌蒸馏水将长满PDA固体培养基表面的黄曲霉菌丝冲洗下来，无菌水重悬，调整菌液浓度为10⁶个/ml。

所述步骤(2)中的种子为健康花生植株的新鲜种子。

所述步骤(2)中的消毒，步骤如下：

将样品置于浓度为0.1％的升汞溶液中，50～150r/min消毒10min，再用蒸馏水冲洗三遍，冲洗第三遍时，在50～150r/min的条件下冲洗5min。

所述步骤(2)中所述的伤口为6mm×5mm；进一步优选的，所述的伤口位于花生两片子叶的中间位置。该位置去掉种皮可以增加侵染效率。

所述步骤(2)中每种样品的数量至少为15粒。

所述步骤(3)中无菌棉条大小与伤口大小相同。

所述步骤(3)中每个培养皿至少有5粒样品。

所述步骤(3)中的无菌培养皿是将卫生纸折叠两层剪成圆形铺于培养皿内，灭菌，每个培养皿加入灭菌蒸馏水，使培养皿中的含水量达到80％。含水量达到80％有利于黄曲霉的生长；湿润的卫生纸形成的褶皱，可以阻挡花生种子的晃动，这样既对花生种子起到固定作用又保持培养皿内湿润的环境来保障黄曲霉的生长。

所述步骤(4)中所述的暗培养的温度为30℃，时间为7天。此温度为黄曲霉的最适生长温度，有利于黄曲霉快速感染花生种子。

所述步骤(4)中培养24小时后揭掉棉条，再培养144小时。

步骤(4)中所述的培养20～28小时后揭掉棉条原因在于覆盖棉条20～28小时使得黄曲霉孢子悬浮液与花生种子充分接触以完全侵染，20～28小时后揭掉是为了让生长的黄曲霉与花生种子充分接触，有利于黄曲霉的生长，且方便观察侵染效率；

所述步骤(4)中种仁染菌级别的分级标准为：0级[0.0]：种仁正常；I级[0.1]：种仁长出霉物占种衣面积1/10以下；II级[0.2]：种仁长出霉状物占种衣面积大于1/10且不超过1/5；III级[0.5]：种仁长出霉状物占种衣面积大于1/5且不超过1/2；IV级[0.8]：种仁长出霉状物占种衣面积大于1/2且不超过4/5；V级[1.0]：种仁表面布满霉状物。

有益效果

1、和过去的一些方法相比，例如薄层色谱法、高效液相色谱法、人工接种后分析黄曲霉毒素含量、蛋白酶抑制剂活性、脂肪氧化酶活性、几丁质酶活性等检测方法，本发明对设备要求高，检测费用低；

2、相比过去人工接菌的方法，本发明设计了制造伤口的环节，提高了黄曲霉菌接菌的效率；

3、和肉眼观察估计鉴定黄曲霉侵抗性的方法相比，本发明利用黄曲霉侵染指数鉴定品种的抗性，更加科学、准确；

4、和接菌后称量黄曲霉菌生物量的方法相比，本发明可以不考虑花生种子本身含水量的误差，评价结果更加准确和稳定。

附图说明

图1花生品种粤油20接菌培养后的照片；

图2花生品种Tifrunner接菌培养后的照片；

图3花生品种鲁花14号接菌培养后的照片；

图4花生品种冀花11号接菌培养后的照片；

图5花生品种中花5号接菌培养后的照片；

图6花生品种豫花6号接菌培养后的照片；

图7花生品种中花6号接菌培养后的照片；

具体实施方案

下面结合说明书附图及实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。

生物材料

花生品种粤油20、Tifrunner、鲁花14号、冀花11号、中花5号、豫花6号、中花6号。

实施例中所述黄曲霉菌种购自中国农业科学院油料作物研究所，编号SDAFZ1。

实施例1：黄曲霉菌的培养和孢子的收集

(1)将黄曲霉菌种在PDA固体培养基上划线活化培养，在30℃的黑暗培养箱中培养6天；

PDA固体培养基每升组分如下：

马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂20g,pH值自然。

(2)待黄曲霉菌丝长满培养基表面后，用灭菌蒸馏水将其冲洗下来，无菌水重悬，用血球计数板计算其浓度，将孢子浓度调整到10⁶个/ml，作为黄曲霉孢子悬浮液备用。

实施例2：花生种子的处理

(1)取花生品种粤油20、Tifrunner、鲁花14号、冀花11号、中花5号、豫花6号、中花6号健康花生植株的种子各15粒，剥去果皮，取种皮完好的种子作为样品，分装于锥形瓶中(如果为晾干的种子，需要将种子在无菌水中浸泡并充分吸水)；

(2)加入质量浓度0.1％的升汞消毒10min，期间100r/min摇晃，再用蒸馏水冲洗三遍，冲洗第三遍时100r/min冲洗5min，然后在种子上都制造6mm×5mm的伤口，去掉伤口部分的种皮。

实施例3：接种黄曲霉菌

(1)在实施例2中种子的伤口上覆盖上同样大小的无菌棉条，在棉条上滴加实施例1中制备的黄曲霉孢子悬浮液20微升，分装于已编号的灭菌的培养皿进行培养；

(2)将吸水纸折叠两层剪成圆形铺于培养皿内，每个培养皿加入5ml的灭菌蒸馏水，润湿卫生纸，使培养皿中的含水量达到80％，每个培养皿放五颗种子，每个样品设3个重复；

(3)将培养皿置于培养箱中，在温度为30℃进行暗培养24小时后揭掉棉条，再暗培养培养144小时。

实施例4：感染指数的统计和计算

(1)统计花生的感染黄曲霉程度，计算其感染指数，来判断该品种是否抗黄曲霉。

感染指数＝{(0.1n+0.2n+0.5n+0.8n+1.0n)/N}×100

其中：n为各个级别染菌的种仁粒数；N为供试总粒数。

品种抗性判断标准为：感染指数＜5.0的是高抗品种；感染指数≥5.0，且＜10.0的是中抗品种；感染指数≥10.0，且＜30.0是中感品种；感染指数≥30.0，且＜50.0的是感病品种；感染指数≥50.0的是高感品种。

种仁染菌分级标准与种仁症状的关系为：

实施例5：花生品种抗性的鉴定

接种黄曲霉后，在30℃恒温培养箱中培养6天，观察粤油20、Tifrunner、鲁花14号、冀花11号、中花5号、豫花6号、中花6号各品种的感染情况，结果如图1～7所示。在大部分粤油20和中花5号的种子表面观察不到黄曲霉菌菌丝，而大部分Tifrunner种子的表面已经长满了黄曲霉菌的菌丝，表明粤油20和中花5号对黄曲霉菌的抗性比Tifrunner要强。

表1花生品种的抗病性鉴定结果

结果分析

根据种仁染菌分级标准，统计上述花生品种在接菌6天后种仁染菌级别，计算感染指数，鉴定上述花生品种对黄曲霉的抗性，鉴定结果如表1所示。中花5号和粤油20属于高抗黄曲霉品种；Tifrunner属于高感品种；中花6号属于中抗品种；冀花11号、鲁花14号和豫花6号属于中感品种。

花生品种的抗性鉴定结果与以往研究结果(文献1：Guo B,Chen X,Dang P,et al.Peanut gene expression profiling in developing seeds at different reproduction stages during Aspergillus parasiticus,infection[J].Bmc Developmental Biology,2008,8(1):1-16.；文献2：Guo,B.,Fedorova,N.D.,Chen,X.,Wan,C.H.,Wang,W.,Nierman,W.C.,Bhatnagar,D.and Yu,J.(2011)Gene expression profiling and identification of resistance genes to Aspergillus flavus infection in peanut through EST and microarray strategies.Toxins(Basel),3,737-753.文献3：郭静佩.花生品种对黄曲霉菌的抗性鉴定和抗侵染机制研究[D].河南师范大学硕士学位论文,2012.)一致，显示本发明所述的方法具有较高的准确性。

与以往的方法相比，本发明在较为简单的实验条件下，可以有效的鉴定花生品种对黄曲霉侵染的抗性，尤其适合对花生育种材料作批量筛选，抗性鉴定成本低。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。