本发明涉及红枣深加工技术领域。更具体地，涉及从南疆骏枣中提取及分离纯化降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的方法。
背景技术：
高脂血症表现为人体内脂质代谢发生异常，血浆里某一种或多种脂质成份浓度高低超过正常范围的病症，是冠心病和动脉粥硬化的主要发病因素之一。由于血浆中总胆固醇和甘油三酯过高，高密度脂蛋白胆固醇过低从而出现的一种疾病状态。主要是因为脂质不溶或微溶于水，它必须与蛋白质结合形成脂蛋白才能存在人体。常见的高血脂症主要主要指标变化有：血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)和甘油三酯(TG)的含量升高；高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低等。
高血脂症的危害不言而喻，可引起很多种疾病，如高血压、糖尿病、动脉粥样硬化、冠心病等疾病。血脂中主要指标含量超出正常范围，容易使血液出现“血稠”，可能会堵塞血管，使血管压力变高，而血液流速变慢，很容易引起高血压症状，严重时将会导致血管中血流中断，若发生在人体中的不同器官，产生不同类型的病症。若发生在脑部，会发生脑中风；若发生在心脏，很可能容易出现冠心病；若发生在下肢，就会引起肢体溃烂、坏死等；高血脂还会引起肝功能损伤，如果肝功能紊乱，则会发生脂质和脂蛋白代谢紊乱，长期如此容易引起脂肪肝，甚至肝癌。
红枣是一种药食同源的食品，作为药物，已有2000多年历史，有着丰富的营养成分和活性成分，有“补品王”、“上等补品”的美称。中医认为红枣具有很多种食用和药用作用。研究表明，红枣中含有黄酮类、糖类、环磷酸腺苷等生物活性成分，有很好的药用作用，具有增强免疫力、抗肿瘤、降血脂等多种生物活性。
目前，对红枣的研究主要为中东部地区红枣，并未分离纯化，而对于生长在自然条件优越，光照充沛、盐碱程度高的天山南麓南疆红枣降血脂活性研究未见报道。南疆骏枣种植面积广，产量高，品质好，与内地大枣化学成份含量相比较，有显著差异，因此对南疆骏枣降血脂活性成分的应用研究迫在眉睫。
技术实现要素：
本发明的一个目的在于提供一种南疆骏枣中提取及分离纯化降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的方法。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
从南疆骏枣中提取及分离纯化降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的方法，包括如下步骤：
(Ⅰ)南疆骏枣中提取降血脂活性物质；
(1-1)将枣肉和枣核分离；
(1-2)用醇溶液对枣肉进行提取，得醇提取物溶液和固体残渣，将醇提取物溶液浓缩得干浸膏；
(Ⅱ)山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的分离及纯化。
上述从南疆骏枣中提取及分离纯化降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的方法，在步骤中(Ⅰ)，还包括如下步骤：
(1-3)将干浸膏按照料液比为1：4g/mL溶于水中得干浸膏溶液，用醚对干浸膏溶液进行萃取，得醚相和醚提取剩余水相。
上述从南疆骏枣中提取及分离纯化降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的方法，还包括如下步骤：
(1-4)用氯仿对醚提取剩余水相进行提取，得氯仿相和氯仿提取剩余水相。
上述从南疆骏枣中提取及分离纯化降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的方法，还包括如下步骤：
(1-5)用酯对氯仿提取剩余水相进行提取，得酯相和酯提取剩余水相。
上述从南疆骏枣中提取及分离纯化降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的方法，步骤(1-2)中：醇的水溶液为乙醇水溶液，料液比为1:(2～4)g/mL，乙醇水溶液中乙醇的体积分数为60-80％，回流提取。
上述从南疆骏枣中提取及分离纯化降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的方法，步骤(1-3)中：醚为石油醚，干浸膏与石油醚的料液比为4:(0.5～2)g/mL。
上述从南疆骏枣中提取及分离纯化降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的方法，步骤(1-4)中：干浸膏与氯仿的料液比为4:(0.5～2)g/mL。
上述从南疆骏枣中提取及分离纯化降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的方法，步骤(1-5)中：酯为乙酸乙酯，干浸膏与乙酸乙酯的料液比为4:(0.5～2)g/mL；将得到的乙酸乙酯相浓缩之后得降血脂活性物质。
上述从南疆骏枣中提取及分离纯化降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的方法，在步骤(Ⅱ)中，包括如下步骤：
(2-1)将步骤(Ⅰ)中提取得到的降血脂活性物质过第一硅胶柱，洗脱剂为石油醚和丙酮的混合物，石油醚和丙酮的体积比为5:1；
(2-2)将步骤(2-1)中得到的洗脱液过第二硅胶柱，洗脱剂为氯仿和甲醇的混合物，氯仿和甲醇的体积比为5:1；
(2-3)将步骤(2-2)中得到的洗脱液过凝胶柱，洗脱剂为氯仿和甲醇的混合物，氯仿和甲醇的体积比为1:1，每10mL收集一管，将第41管至第123管洗脱液收集合并；
(2-4)将步骤(2-3)中得到的第41管至第123管洗脱液过中压柱，洗脱剂为甲醇水溶液，甲醇的体积分数为70％，每10mL收集一管，将第54管至第62管洗脱液收集合并；
(2-5)将步骤(2-4)中得到的第54管至第62管洗脱液过高效液相色谱柱，收集洗脱液，将洗脱液蒸干浓缩的得浅黄色粉末，即为降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷。
上述从南疆骏枣中提取及分离纯化降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的方法，
步骤(2-1)中：所述第一硅胶柱为粗孔zcx-Ⅱ型硅胶柱，外径为4.5厘米，洗脱剂流速为5-10mL/min；
步骤(2-2)中：所述第一硅胶柱为粗孔zcx-Ⅱ型硅胶柱，外径为4厘米，洗脱剂流速为1-2mL/min；
步骤(2-3)中：所述凝胶柱为Sephadex LH-20型凝胶柱，外径为2.5厘米，洗脱剂流速为0.5-1mL/min；
步骤(2-4)中：所述中压柱外径为4厘米，柱压为3-4MPa，洗脱剂流速为3-4mL/min；
步骤(2-5)中：
高效液相色谱柱为如下之一：a)色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD柱，2.1mm×100mm，1.7μm；或者b)色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱，2.1mm×50mm，1.7μm；
流动相为如下之一：a)由A相和B相组成，A相为水，B相为乙腈和甲醇的混合溶液；b)由A相和B相组成，A相为水和乙腈的混合溶液，B相为甲醇；c)由A相和B相组成，A相为水和乙腈的混合溶液，B相为乙腈和甲醇的混合溶液；乙腈和甲醇的混合溶液中乙腈的体积分数为5％，水和乙腈的混合溶液中乙腈的体积分数为10％；
梯度洗脱为如下之一：a)以流动相B的比例进行说明：初始体积5％保持5min后，3min增至50％保持3min，3min下降至5％并保持5min；b)以流动相B的比例进行说明：初始体积5％保持4min后，2min增至70％保持5min，3min下降至5％并保持5min；c)以流动相B的比例进行说明：初始体积5％保持4min后，6min增至90％保持1min，3min下降至5％并保持5min；
收集第14-15min的流出相，将得到的流出相蒸干浓缩的得浅黄色粉末，即为降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷。
本发明的有益效果如下：从南疆骏枣中提取了具有降血脂活性的物质，小鼠试验表明其具有一定的降血脂活性，并分离提纯出了具有降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
第一部分：从南疆骏枣中提取降血脂活性物质及降血脂活性试验
从南疆骏枣中提取降血脂活性物质
实施例1
(1-1)所用枣为鲜枣，采集于新疆阿拉尔市塔里木大学园艺实验站7年的枣树，为鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Ziziphus Mill.)植物的果实—骏枣，将枣肉和枣核分离；
(1-2)用醇的水溶液对枣肉进行提取，得醇提取物溶液和固体残渣，将醇提取物溶液浓缩得干浸膏；醇的水溶液为乙醇水溶液，料液比为1：3(g/mL)，乙醇水溶液中乙醇的体积分数为70％，回流提取。
(1-3)将干浸膏按照料液比为1:4(g/mL)溶于水中得干浸膏溶液，用醚对干浸膏溶液进行提取，得醚相和醚提取剩余水相。醚为石油醚，干浸膏与石油醚的料液比为4:1(g/mL)。
(1-4)用氯仿对醚提取剩余水相进行提取，得氯仿相和氯仿提取剩余水相。干浸膏与氯仿的料液比为4:1(g/mL)。
(1-5)用乙酸乙酯对氯仿提取剩余水相进行提取，得酯相和酯提取剩余水相；干浸膏与乙酸乙酯的料液比为4:1(g/mL)；将酯相浓缩得干浸膏，即为降血脂活性物质。
实施例2
(1-1)所用枣为鲜枣，采集于新疆阿拉尔市塔里木大学园艺实验站7年的枣树，为鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Ziziphus Mill.)植物的果实—骏枣，将枣肉和枣核分离；
(1-2)用醇的水溶液对枣肉进行提取，得醇提取物溶液和固体残渣，将醇提取物溶液浓缩得干浸膏；醇的水溶液为乙醇水溶液，料液比为1：2(g/mL)，乙醇水溶液中乙醇的体积分数为80％，回流提取。
(1-3)将干浸膏按照料液比为1:10(g/mL)溶于水中得干浸膏溶液，用醚对干浸膏溶液进行提取，得醚相和醚提取剩余水相。醚为石油醚，干浸膏与石油醚的料液比为8:1(g/mL)。
(1-4)用氯仿对醚提取剩余水相进行提取，得氯仿相和氯仿提取剩余水相。干浸膏与氯仿的料液比为8:1(g/mL)。
(1-5)用乙酸乙酯对氯仿提取剩余水相进行提取，得酯相和酯提取剩余水相，干浸膏与乙酸乙酯的料液比为8:1(g/mL)；将酯相浓缩得干浸膏，即为降血脂活性物质。
实施例3
(1-1)所用枣为鲜枣，采集于新疆阿拉尔市塔里木大学园艺实验站7年的枣树，为鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Ziziphus Mill.)植物的果实—骏枣，将枣肉和枣核分离；
(1-2)用醇的水溶液对枣肉进行提取，得醇提取物溶液和固体残渣，将醇提取物溶液浓缩得干浸膏；醇的水溶液为乙醇水溶液，料液比为1：4(g/mL)，乙醇水溶液中乙醇的体积分数为60％，回流提取。
(1-3)将干浸膏按照料液比为2:5(g/mL)溶于水中得干浸膏溶液，用醚对干浸膏溶液进行提取，得醚相和醚提取剩余水相。醚为石油醚，干浸膏与石油醚的料液比为2:1(g/mL)。
(1-4)用氯仿对醚提取剩余水相进行提取，得氯仿相和氯仿提取剩余水相。干浸膏与氯仿的料液比为2:1(g/mL)。
(1-5)用乙酸乙酯对氯仿提取剩余水相进行提取，得酯相和酯提取剩余水相，干浸膏与乙酸乙酯的料液比为2:1(g/mL)；将酯相浓缩得干浸膏，即为降血脂活性物质。
降血脂活性试验
1、材料
动物：昆明小白鼠，平均体重(20.0±2.0)g，SPF级，生产许可证：SCXK(新)2011-0001，与基础饲料均购于新疆疾控中心动物实验中心。自由饮水和摄食。
2、试剂
试剂盒：血清总胆固醇试剂盒、高密度脂蛋白试剂盒、甘油三酯试剂盒、低密度脂蛋白试剂盒、化学纯胆固醇(长春汇力生物技术有限公司)。
其他：辛伐他丁市售；高脂饲料(83.0％基础饲料，10％蛋黄粉，1.5％胆固醇，5％猪油，0.5％脱氧胆酸钠)。氯仿、无水乙醇等试剂为分析纯试剂，均购于天津市致远化学试剂有限公司。
3、方法
3.1、将降血脂活性物质配置成浓度为25mg/Kg的样品溶液，同时分为高、低剂量组(0.6mL，0.2mL)。
3.2、小鼠分组及饲喂
选取50只昆明小鼠，雌雄各半，按体重均衡平均分为5组(每组10只)：
空白对照组，饲以基础饲料。
阳性对照组，饲以高脂饲料。
高脂模型对照组，饲以高脂饲料。
低剂量试验组，饲以高脂饲料。
高剂量试验组，饲以高脂饲料。
每10天进行体重和血脂动态跟踪，直到造模成功。然后，高脂模型对照组停止喂食高脂饲料，改饲基础饲料；阳性对照组灌胃人体服用量的1/12辛伐他丁溶液；对低剂量试验组和高剂量试验组开始饲喂不同剂量样品溶液，低剂量试验组每日喂食0.2mL样品溶液、高剂量试验组每日喂食0.6mL样品溶液。
3.3、小鼠血清制备及指标测定
血清的制备：每10天取血，取血前小鼠禁食12h，取小鼠尾静脉血，静置30min后，10 000r/min离心15min，将血清移至干净的血试管。
指标测定：小鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)以及低密度脂蛋白(LDL-C)含量测定采用现有技术中已知的方法。
按下式计算动脉硬化指数：动脉硬化指数＝(TC-HDL-C)/(HDL-C)。
4、结果
经过30天对小鼠饲喂，小鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)以及低密度脂蛋白(LDL-C)如下表所示。
注：*表示与高脂模型组相比的显著性，*：p<0.05，**：p<0.01；#表示与空白组相比的显著性，#：p<0.05，##：p<0.01。
第二部分：分离及纯化山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷
分离及纯化山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷
实施例4
(2-1)将实施例1中提取得到的降血脂活性物质过第一硅胶柱，洗脱剂为石油醚和丙酮的混合物，石油醚和丙酮的体积比为5:1；所述第一硅胶柱为粗孔zcx-Ⅱ型硅胶柱，外径为4.5厘米，洗脱剂流速为5mL/min；
(2-2)将步骤(2-1)中得到的洗脱液过第二硅胶柱，洗脱剂为氯仿和甲醇的混合物，氯仿和甲醇的体积比为5:1；所述第二硅胶柱为粗孔zcx-Ⅱ型硅胶柱，外径为4厘米，洗脱剂流速为1mL/min；
(2-3)将步骤(2-2)中得到的洗脱液过凝胶柱，洗脱剂为氯仿和甲醇的混合物，氯仿和甲醇的体积比为1:1，每10mL收集一管，将第41管至第123管洗脱液收集合并；所述凝胶柱为Sephadex LH-20型凝胶柱，外径为2.5厘米，洗脱剂流速为0.5mL/min；
(2-4)将步骤(2-3)中得到的第41管至第123管洗脱液过中压柱，洗脱剂为甲醇水溶液，甲醇的体积分数为70％，每10mL收集一管，将第54管至第62管洗脱液收集合并；所述中压柱外径为4厘米，柱压为3MPa，洗脱剂流速为3mL/min；
(2-5)将步骤(2-4)中得到的第54管至第62管洗脱液过高效液相色谱柱，收集洗脱液，将洗脱液蒸干浓缩的得黄色粉末，即为降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷。
高效液相色谱柱为：a)色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18RRHD柱，2.1mm×100mm，1.7μm。
流动相为：a)由A相和B相组成，A相为水，B相为乙腈和甲醇的混合溶液，乙腈和甲醇的混合溶液中乙腈的体积分数为5％。
梯度洗脱：a)以流动相B的比例进行说明：初始体积5％保持5min后，3min增至50％保持3min，3min下降至5％并保持5min。
收集第14-15min的流出相，将得到的流出相蒸干浓缩的得浅黄色粉末，所得黄色粉末中降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的纯度为92wt％。
实施例5
本实施例与实施例4的区别在于：色谱柱不同，本实施例采用如下色谱柱：b)色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱，2.1mm×50mm，1.7μm。所得黄色粉末中降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的纯度为60wt％。
实施例4和实施例5中，优选采用实施例4中使用的色谱柱，山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷与其它成分之间的分离及色谱峰峰形都比较好。而实施例5中，山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷与其它成分之间的分离效果较差，并且色谱峰拖尾，产物纯度及得率均下降。
实施例6
本实施例与实施例4的区别在于：流动相不同，b)由A相和B相组成，A相为水和乙腈的混合溶液，B相为甲醇，水和乙腈的混合溶液中乙腈的体积分数为10％。所得黄色粉末中降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的纯度为78wt％。
实施例7
本实施例与实施例4的区别在于：流动相不同，c)由A相和B相组成，A相为水和乙腈的混合溶液，B相为乙腈和甲醇的混合溶液；乙腈和甲醇的混合溶液中乙腈的体积分数为5％，水和乙腈的混合溶液中乙腈的体积分数为10％。所得黄色粉末中降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的纯度为98wt％。
实施例4、实施例6和实施例7中，优选使用实施例7中的流动相：山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的色谱峰峰形良好，且对山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的响应较大，与其它成分的保留时间是这三种流动相中相差最大的，有利于分离出纯度较高的山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷。
实施例8
本实施例与实施例7的区别在于：洗脱梯度不同；b)以流动相B的比例进行说明：b)以流动相B的比例进行说明：初始体积5％保持4min后，2min增至70％保持5min，3min下降至5％并保持5min。所得黄色粉末中降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的纯度为89wt％。
实施例9
本实施例与实施例7的区别在于：洗脱梯度不同，c)以流动相B的比例进行说明：初始体积5％保持4min后，6min增至90％保持1min，3min下降至5％并保持5min。所得黄色粉末中降血脂活性化合物山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的纯度为88wt％。
实施例7、实施例8和实施例9中，优选采用实施例7中的洗脱梯度：能够确保山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷与其它成分分离良好，并且保留时间最稳定。
山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的化学结构式如下：
选择实施例7中得到的浅黄色粉末进行表征如下：浅黄色黄色粉末，易溶于甲醇，盐酸-镁粉反应显阳性，初步推断该化合物为黄酮苷类化合物。三氯化铁-铁氰化钾试剂显蓝色，说明该化合物为酚类化合物，1H-NMR(500MHz，DMSO-d6),7.8(2H,d,J＝8.7Hz,H-2′,6′),6.93(2H,d,J＝8.7Hz,H-3′,5′),6.79(1H,dd,J＝1.9Hz,H-8),6.46(1H,dd,J＝2.0Hz,H-6)为明显的黄酮信号,5.56(1H,d,J＝1.5Hz,H-1″′),5.31(1H,d,J＝1.4Hz,H-1″)分别为α-L-Rha端基氢两个鼠李糖信号；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：178.4(C-4),162.2(C-7),161.4(C-5),160.6(C-4′),158.3(C-2),156.6(C-9),136.03(C-3),131.2(C-4′,6′),120.8(C-1′),115.9(C-3′,5′),106.3(C-10),102.4(C-1″),99.9(C-1″′),98.9(C-6),95.1(C-8),与现有技术中山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的测试结果一致。
降血脂活性试验
降血脂试验方法与本发明实施例“第一部分”中的降血脂活性试验相同，结果表明：小鼠喂食山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷2天后，即可明显降低小鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平，且提高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。