mir‑3620的新用途的制作方法

本发明涉及肿瘤分子诊断领域，具体的涉及mir-3620及其成熟miRNA的新用途，更具体的涉及mir-3620及其成熟miRNA在诊治结肠腺癌中的新应用。

背景技术：

miRNA是一种内源性非编码小分子，通过特异性结合靶基因来调控基因的表达。单条miRNA可以靶向上百条靶基因，而大量的miRNA和靶基因间的相互作用对癌症相关的信号通路起到了至关重要的调控作用。miRNA在正常细胞生理中起调节反馈和缓冲的作用，作为精调靶基因蛋白水平，防止其超出正常生理范畴的关键因子。此外，miRNA也是调节不同分子信号通路间的开关。miRNA表达量和活性的异常极有可能影响细胞的正常生理功能从而导致疾病的发生。通过大量的肿瘤组织和细胞株miRNA芯片检测实验，越来越多的miRNA被发现在癌症中发挥着超出人们预期的重要作用。在转基因小鼠的体内实验中研究人员发现miRNA的异常表达通常会引起癌症的发生。而一些miRNA甚至在不同肿瘤细胞中发挥着不同甚至截然相反的作用。所以，miRNA与癌症的关系是我们在战胜这种疾病的过程中必须搞清的问题。

本发明基于高通量测序方法，对6例结肠腺癌患者的癌组织及癌旁组织进行二代测序，获得其miRNA的表达数据，同时，结合TCGA数据库中337例结肠腺癌患者miRNA数据，进行整合生物信息学分析，从候选的miRNA中挑选出几个进行分子生物学验证，结果显示，本发明提供的mir-3620与结肠腺癌密切相关，可用于结肠腺癌的临床诊断及预防检测，为临床上相关诊断试剂或芯片等的开发奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供检测mir-3620及其成熟miRNA的制剂在制备诊断结肠癌试剂中的应用。mir-3620的序列见序列表SEQ ID NO 1，miR-3620-5p序列见序列表SEQ ID NO 2；miR-3620-3p序列见序列表SEQ ID NO 3。

优选的结肠癌为结肠腺癌。

进一步，诊断结肠腺癌试剂包括基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测结肠腺癌样本中mir-3620及其成熟miRNA的转录或基于免疫检测方法检测结肠腺癌样本中mir-3620及其成熟miRNA调控的靶基因的表达情况，优选采用northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测结肠腺癌样本中mir-3620及其成熟miRNA的转录；采用ELISA和/或胶体金试纸条检测结肠腺癌样本中mir-3620及其成熟miRNA调控的靶基因的表达情况。

优选的，基于定量PCR方法包括特异性扩增mir-3620及其成熟miRNA的引物，进一步优选，特异性扩增miR-3620的引物序列为SEQ ID NO 4；基于探针杂交方法包括与mir-3620及其成熟miRNA的核酸序列杂交的探针。

本发明的目的在于提供上调mir-3620及其成熟miRNA的转录和/或促进mir-3620及其成熟miRNA的活性的试剂在制备防治结肠癌制剂中的应用。

进一步，结肠癌为结肠腺癌。

进一步，防治结肠癌制剂防治结肠癌细胞增殖。

优选的，采用基于RNA的microRNA功能获得性技术和/或基因特异性miR Mimics技术上调mir-3620及其成熟miRNA的转录和/或促进mir-3620及其成熟miRNA的活性。优选人工合成短发夹RNA或通过调控启动子上调mir-3620及其成熟miRNA。

本发明的目的在于提供mir-3620及其成熟miRNA的靶基因在制备诊断和/或防治结肠腺癌制剂中的应用。

本发明的目的在于提供上述结肠腺癌诊断制剂在制备结肠腺癌诊断工具中的应用。

本发明的目的在于提供一种防治结肠癌试剂，所述试剂包含：

(a)上调mir-3620及其成熟miRNA的转录和/或促进mir-3620及其成熟miRNA的活性的试剂；

(b)药剂学上能接受的载体。

优选的，采用基于RNA的microRNA功能获得性技术和/或基因特异性miR Mimics技术上调mir-3620及其成熟miRNA的转录和/或促进mir-3620及其成熟miRNA的活性。优选人工合成短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)或通过调控启动子上调mir-3620及其成熟miRNA的表达。

进一步的，所述结肠癌为结肠腺癌。

本发明的目的在于提供一种结肠腺癌诊断试剂，结肠腺癌诊断试剂能够检测结肠腺癌样本中mir-3620及其成熟miRNA的转录或免疫检测方法检测结肠腺癌样本中mir-3620及其成熟miRNA调控的靶基因的表达情况。

进一步，结肠腺癌诊断试剂基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测结肠腺癌样本中mir-3620及其成熟miRNA的转录或基于免疫方法检测结肠腺癌样本中mir-3620及其成熟miRNA调控的靶基因的表达情况，优选采用northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测结肠腺癌样本中mir-3620及其成熟miRNA的转录。

本发明的目的在于提供上述防治结肠腺癌的制剂在制备结肠腺癌治疗药物或试剂中的应用。

定义：

现阶段检测miRNA的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、基于核苷酸杂交和基于PCR的miRNA检测方法。基于探针杂交技术的miRNA检测方法是一种直接检测法，不需要对样本RNA进行预扩增，包括northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术。

(1)Northern杂交

又称RNA印迹技术为最经典的检测真核生物RNA大小，估计其丰度的实验方法。基本原理如下：首先在载体(如硅片、微球或膜等)上固定miRNA样本，再与经过标记的探针杂交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测；也可以在载体上先固定与靶miRNA序列互补的DNA探针，然后与经过标记的样本miRNA杂交，再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素标记、荧光标记和纳米金标记等。

(2)miRNA表达谱芯片

原理同样是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上miRNA基因及内参序列，可精确分析出样品中相应miRNA的表达水平。基因芯片具有高通量的优点，可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。Luminex公司研制的液相芯片(Liquid chip)又称多功能悬浮点阵(Multi analyte suspension array，MASA)，是出的新一代生物芯片技术。液相芯片体系由许多小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片系统。该系统可以对同一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析，这种检测技术被称为FMAP(Flexible multianalyte profiling)技术。分子杂交在悬浮溶液中进行，检测速度极快。

(3)核酶保护分析技术(RPA)

miRNA的检测还可以采用核酶保护分析技术，将标记好的探针和待测RNA样本混合，热变性后杂交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，热失活核酸酶后纯化受保护的RNA分子，最后通过变性PAGE电泳分离探针，显色。这种基于液相杂交的新方法简单快速，灵敏度高，但也只能用于分析已知miRNA。

(4)RAKE法

RAKE法(RNA primed array based Klenow emzyme)是在miRNA microarray的基础上利用DNA聚合酶I的Klenow片段，使miRNA与固定的DNA探针杂交的方法。RAKE可以敏感特异地检测miRNA，适用于大量快速的筛选所有己知的miRNA。能够在特定的细胞和肿瘤中检测miRNA表达谱情况。不仅如此，RAKE法还可以从由福尔马林固定了的石蜡包埋的组织中分离出miRNA并对其进行分析，为从存档标本中分析miRNA开启了希望之门。

(5)原位杂交(in situ hybridization)

原位杂交技术可直观了解miRNA表达方式，是观测miRNA时空表达的一种较简便的方法，常标记方式包括地高辛、生物素、荧光标记等。锁定核酸基础上的原位杂交(Locked Nucleic Acid(LNA)based in situ hybridization(LNA-ISH))是当前应用较多的探针方式。

(6)基于微球的流式细胞术(bead-based flow cytometry)

是一种液相芯片技术，该方法将流式细胞检测与芯片技术有机地结合起来，兼有通量大、检测速度快、灵敏度高和特异性好等特点。

(7)实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR，RT-PCR)

荧光检测PCR仪可对整个PCR过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在反应混合体系中靶序列的起始浓度越大，要求获得扩增产物某特定产量的PCR循环数(一般用特定阈值循环数Ct来表达)越少。由于miRNA长度仅为22nt，传统的qRT-PCR不适合扩增如此短的片段。现今有几种用于miRNA的实时定量PCR方法，如加尾法、颈环法等。颈环法是一种理想的miRNA检测qRT-PCR方法：首先设计特殊的茎环结构引物，以待测miRNA为模板逆转录合成cDNA第一链，该cDNA一端为茎环状引物，茎环状结构被打开便增加了cDNA的长度，随后以合成的cDNA为模板设计引物进行实时定量PCR扩增。qRT-PCR具有特异性高、灵敏度好、快速简单等多种优点。

(8)测序法

大部分已知的miRNA都是通过cDNA克隆测序发现和鉴定的。该法需要先构建miRNA的cDNA文库，再进行PCR扩增，扩增产物随后克隆到表达载体上测序。Takada开发了一种改进的扩增克隆法(miRNA amplification profiling，mRAP)，mRAP法先在miRNA的3’端连上接头，然后用与接头互补的反转录引物反转录。因为特定的反转录酶具有末端脱氧核苷酸转移酶活性，一些核苷酸(主要是脱氧胞苷酸)会连接到反转录出的cDNA链的3’末端。当5’端接头与cDNA链的poly(C)粘性末端退火后，加入一对共用引物即可实现对cDNA的PCR扩增。由于mRAP高度灵敏，可以直接用克隆和测序技术检测少量组织中miRNA的表达量。标签序列克隆法是一种在在基因表达系列分析(SAGE)技术的基础上发展了检测效率更高的miRAGE(miRNA SAGE)克隆法，该法通过生成大的串联子，通过单个测序反应可检测多个miRNA，明显提高了检测效率。

高通量测序(High-throughput sequencing)又称下一代测序技术(next generation sequencing)是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，极大提高了测序效率。这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗传信息的解读速度，为获取所有miRNA的序列信息，解密miRNA图谱提供了保证。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。高通量测序平台的代表是罗氏公司(Roche)的454测序仪(Roch GSFLX sequencer)，Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer)。

基于RNA的microRNA功能获得性技术即通过外源性补充miRNAs合成的前体物质来升高miRNAs的水平。例如，可以人工合成与内源性miRNA序列一致的短发夹样RNA(short hairpin RNA，shRNA)，由聚合酶II或III做启动子，以病毒为载体转染细胞，被Dicer酶修饰后载入RISC发挥作用，相当于升高pre-miRNA的水平，作用效果稳定而持久。

基因特异性miR Mimics技术该技术避免了miRNA与基因的非特异性作用。这种人工合成的与靶基因3’UTR互补结合的特异性寡核苷酸链，能够起到与miRNA相同的转录后调节作用。

miRNA调控的主要方式有两种：一种是与靶基因mRNA的3’UTR不完全互补配对，阻断靶基因的翻译，从而调节基因表达；另一种是与siRNA类似，当miRNA与mRNA完全互补配对时，Ago2蛋白通过切割mRNA直接导致其降解，实现基因沉默。总之，当前认为miRNA以何种方式与目的基因作用和miRNA与目的基因的配对程度有关。miRNA与目的基因配对不完全时，miRNA就以抑制目的基因的表达发挥作用；miRNA与目的基因某段序列配对完全时，就可能引起目的基因在互补区断裂而导致基因沉默。

包含在本发明的药剂学组合物的药剂学上许可的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐(alginate)、凝胶(gelatin)、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素(cellulose)、水、糖浆、甲基纤维素(methyl cellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸丙酯(propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁(stearic acid magnesium)及矿物油(mineral oil)等，但并非局限于此。

本发明的药剂学组合物除了上述成分以外还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。药剂学上许可的适合的载体和制剂详细记载于雷明登氏药学全书。

本发明的药剂学组合物能通过口服或非口服进行给药，作为非口服给药时，能通过静脉内注射，鼻腔内注射，局部注射，脑室内注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，经皮给药等方式进行给药。

本发明的药剂学组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、食物、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，通常，熟练的医生能够容易地决定及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。

本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易实施的方法，利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位用量形态制备或者内装在多容量容器内来制备。此时，剂型是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形态，还可以包括分散剂或者稳定剂。

附图说明

图1是转染miR-3620-3p mimics后细胞生长曲线图

图2是转染miR-3620-3p inhibitor后细胞生长曲线图

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1样品的收集及总RNA提取

收集医院2014年1月到2015年8月结肠腺癌患者癌组织及对应癌旁组织各6例。患者术前未经放疗和化疗，术中取材，立即放入液氮中保存，随后转入-80℃长期保存，以用于RNA提取。标本经病理诊断确诊为结肠癌。

RNA提取标准：RNA纯度：OD260/280≧1.8，28S/18S≧1；RNA完整性：RIN值≧7.0。RNA完整性检测方法：Agilent 2100(RNA 6000Nano kit)、琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖凝胶浓度：1％琼脂糖胶；电压：5V/cm；时间：20min)。

实施例2测序及数据整合分析

测序：运用llumina Hiseq2500/Miseq第二代高通量测序技术对miRNA进行测序，通过去接头、去低质量、去污染等过程完成数据的处理，得到最终数据。

整合分析：TCGA数据库的nationwidechildrens.org_clinical_patient_coad文件中共记录459例结肠腺癌患者的临床信息。本项目排除history_other_malignancy或history_neoadjuvant_treatment为Yes的患者62例，将histologic_diagnosis为Colon Adenocarcinoma的337例患者纳入研究(histologic_diagnosis为Colon Mucinous Adenocarcinoma、[Not Available]、[Discrepancy]的60例患者未纳入研究)。采用337例结肠腺癌(COAD)患者TCGA数据库中miRNA数据，进行分析。这些数据均来自结肠腺癌病例组Primary solid Tumor和对照组的Solid Tissue Normal。

通过转录组数据分析软件对miRNA测序原始数据及整合分析数据进行背景校正后进行t-test得到P值，然后利用Fisher检验合并P值，筛选差异表达miRNA。从候选的差异表达miRNA中挑选到mir-3620进行后期验证。

实施例3 Real-time PCR检测结肠腺癌组织中miR-3620-3p的表达

1样品采集：

36例结肠腺癌肿瘤患者癌组织及癌旁组织(采集时间2014年1月-2015年8月)。

2总RNA提取：

相关实验物品的去Rnase的处理：

①将所有玻璃器皿应用前均用DEPC冲洗侵泡，120℃高压20min，180℃高温烤干2小时以上。

②将塑料器皿(如：EP管/枪头)使用前需用0.1％DEPC水侵泡过夜，后控干液体，120℃高压20min，烤箱烤干备用。

白细胞分离

(1)取2m1抗凝外周血(采血时间不超过3h)；

(2)加入等体积无菌PB S于外周血中充分混合，形成细胞悬液；

(3)加入4m1淋巴细胞分离液于另一离心管；

(4)吸取4m1细胞悬液沿管壁轻轻加入到淋巴细胞分离液表面(注意勿与淋巴细胞分离液混合)。离心1500rpm 20min；

(5)用吸管轻轻吸出界面层(白膜)入另一离心管中。无菌冷PBS洗2次，最后1次洗涤可以将细胞悬液移入EP管中，离心去上清，用于提取RNA。

RNA提取

(1)从-80℃冰箱里取出样本，切碎，按1ml/50-100mg的比例加入Trizol于EP管中，进行匀浆处理，室温静置5-l0min；

(2)每毫升Trizol加入0.2m1氯仿，剧烈震荡15s，室温静置2-3min，在4℃下1 2000转离心15min；

(3)小心吸出上清水相约600ul移入另一离心管(注意不要抽到蛋白层)，加入等量异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min；

(4)4℃1 2000g离心l 0min，弃上清液，底部可见白色物质；

(5)加入lml 75％冷乙醇旋转洗涤，清洗异丙醇；

(6)4℃12000g离心5min，去除乙醇后晾5-l0min，半透明即可，以20u1DEPC水溶解RNA。取3u1RNA样本，于1.5％琼脂糖凝胶中电泳；lu1RNA样品于紫外分光光度计检测浓度，以A260/280在1.8-2.0视为RNA样本合格。

3逆转录

RT体系的配制：1μg总RNA作为模板RNA；5×miScript HiSpec Buffer 4μl；10×Nucleics Mix 2μl；miScript Reverse Transcriptase Mix 2μl；灭菌水补平至20μl。ABI 9700型PCR仪上37℃保温60min使逆转录反应完全后，95℃5min终止反应。加入80μl Nuclease-free H₂O稀释至100μl储存在-20℃冰箱备用。

4荧光定量PCR

miRNA的RT-PCR体系的配制：

miRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应，以snRNA U6作为内参。

扩增程序：95℃10min；40个循环(95℃10s，60℃30s)。

5统计学分析

实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：ΔΔCt＝Ct(miR-3620-3p)-Ct(U6)，fold＝2^-ΔΔCt表示实验组与对照组目的基因表达的倍数关系，比较miR-3620-3p在结肠腺癌组织和癌旁组织中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，目的基因在癌旁组织的表达量为癌组织的约4倍，以上结果验证了高通量测序数据和整合分析数据分析的结果。

实施例4人结肠癌细胞株的培养及瞬时转染

一、材料准备：

人结肠癌细胞系HCT116购自ATCC细胞库。

Lipofectamine^TM2000Transfection Reagent(Invitrogen)。

RPMI 1640和DMEM培养基购自GIBCO公司，新生牛血清和胎牛而清购自PAA公司。

miR-3620-3p序列发给合成公司，请其化学合成miR-3620-3p mimics、miR3620-3p inhibitor及其非特异性对照。

二、实验方法

1、细胞培养

结肠癌细胞株HCT116采用含10％新生牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃、5％CO₂、饱和湿度的条件下传代培养，细胞生长状态良好时用于实验。

2、miRNA瞬时转染

操作按Lipofectamine^TM2000试剂说明书进行。转染前24h将生长状态良好的HCT116细胞接种到6孔板中，细胞计数约为4×10⁵/L，常规培养至转染当天，细胞融合度为70-80％时进行实验。将100nM miR-3620-3p mimics/miR3620-3p inhibitor加入到250μl opti-MEM培养基中，轻柔混匀；另用250μl opti-MEM培养基稀释5μl Lipofectamine^TM 2000脂质体，轻柔混匀，室温孵育5min；混合Opti-MEM-脂质体与Opti-MEM-miRNAs，室温孵育20min，以形成转染复合物：然后将上述混合物加到细胞培养基中，轻轻混匀，培养6h后更换完全培养基。其中，非特异性的mimics Negative Control(mimics NC)和inhibitor Negative Control(inhibitor NC)序列作为对照。培养24-48h后抽提细胞总RNA，逆转录成cDNA，实时定量PCR检测瞬时转染后miR-3620-3p表达的改变。

3.实验结果：

采用阳离子脂质体法进行瞬时转染，分别将miR-3620-3p mimics或miR-3620-3pinhibitor及相应对照序列Negative Control(NC)转染结肠癌细胞株HCT116。转染48h后，抽提细胞总RNA。以U6为内对照，实时定量PCR检测miR-3620-3p的表达。结果显示：与对照组相比，HCT116转染miR-3620-3p mimics后，miR-3620-3p的表达增高了约4.5倍(P＝0.001)；转染miR-3620-3p inhibitor后，表达下降了近76％(P＝0.001)。以上结果表明，通过瞬时转染miR-3620-3p mimics和miR-3620-3p inhibitor可有效上调或下调miR-3620-3p的表达，结果可靠可进行后续实验。

实施例5转染miR-3620-3p对人结肠癌细胞增殖的影响

1×10³个细胞接种于96孔板，分别培养1,2,3,4,5d，每孔加入无血清的RPMI-1640培养液200μl及5mg/ml的四氮唑蓝盐(MTT)20μl，继续培养4h，吸弃液体，每孔加入DMSO150μl，室温孵育10min，置摇床上轻轻摇动15min，用Bio-Rad酶联免疫检测仪在490nm测定每孔的吸光度值(OD值)，以空白对照孔调零，以相对应的OD值表示细胞增殖能力的大小。每组设3个重复孔，取平均值，绘制体外生长曲线。

将瞬时转染后的HCT116细胞接种到96孔板中，采用MTT法检测miR-3620-3p过表达对结肠癌细胞增殖能力的影响。结果如图1所示，转染miR-3620-3p mimics 5天后，与对照组(转染mimics NC)相比，HCT116细胞的生长速度减慢约35.7％，差异有统计学意义，提示miR-3620-3p过表达可抑制结肠癌细胞的体外增殖能力。

将瞬时转染后的HCT116细胞接种到96孔板中，采用MTT法检测沉默miR-3620-3p对结肠癌细胞增殖能力的影响。结果如图2所示，结肠癌细胞瞬时转染miR-3620-3p inhibitor 5天后，细胞的生长速度提高了34.5％，差异有统计学意义，提示沉默rniR-3620-3p表达能增强结肠癌细胞的体外增殖能力。

虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员理解，可进行各种变化，并且可用等同物替代其组件而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改动来使特定情况或材料适合于本发明的教导而不背离其基本范围。