二维细胞划痕芯片及其制备方法、应用与流程

本发明涉及生物技术领域，进一步涉及一种二维细胞划痕芯片，以及该芯片的制备方法，还涉及使用该芯片进行细胞迁移实验。

背景技术：

细胞迁移参与了组织器官形成、组织损伤修复等重要生理过程；细胞迁移功能失调，则会导致肿瘤细胞侵袭及转移。通过促进或抑制细胞迁移可影响某些疾病(缺血性心血管疾病、肿瘤)的发生发展与转归，因此研究细胞迁移具有重要的理论意义与实用价值。

目前，传统的测定细胞迁移方法以细胞划痕小室法(Boyden Chamber)和划痕法最为常用。前者由上、下两室组成，中间以微孔滤膜隔开；趋化因子加入下室，形成浓度梯度，细胞接种在上室，受趋化因子浓度梯度的影响，穿过膜上的微孔移动到另一侧；之后，细胞固定、染色和计数，以此确定其迁移能力。后者是用移液枪头在融合细胞上划出一道划痕，观察细胞向划痕区域的迁移情况，来判断细胞的迁移能力。由于划痕法不仅具有简单的优点，还能够可视化细胞迁移过程，使得划痕方法成为了细胞迁移研究中较为常用的方法。

虽然划痕法已经被广泛应用于迁移研究，但传统划痕法很难控制划痕速度以及伤口区域的形状和边界，使得不同实验之间很难做比较，导致实验的重复性差。由于微加工技术能够被用于制作可以模仿细胞微环境的各种仿生结构，近年来这种技术已经被广泛用于研究细胞迁移。一种现有技术利用微加工技术制作细胞划痕芯片，并利用层流实现细胞迁移。另一种现有技术为一种直流电结合化学表面修饰实现细胞迁移的方法。与传统划痕法比较，基于微加工技术的二维划痕法具有可控性好、精度高以及可以用于模仿细胞微环境等优点，从而说明了通过加工技术研究细胞迁移的可行性。

然而现有技术存在如下技术缺陷：

(1)现有的细胞划痕法依赖于手动划痕操作，致使该方法中各个实验组间划痕质量不统一，且细胞和细胞外基质在此过程中会受损，可能导致迁移结果并不精准可信。

(2)现有的基于微加工技术的二维划痕研究，通量普遍较低，而且针对一个划痕实验的成本较高，难以大范围应用。

技术实现要素：

(一)要解决的技术问题

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种二维细胞划痕芯片及其制备方法、应用，以克服以上所述的现有技术的至少一项技术问题。

(二)技术方案

根据本发明的一方面，提供一种二维细胞划痕芯片，包括基底和上下两侧开口的小室阵列，其中：所述小室阵列固定于所述基底上使基底封闭小室阵列的其中一侧开口，形成多个单侧开口的小室；每个所述小室在基底一侧的部分区域上形成有金属层，所述金属层上进一步形成有自组装分子层，所述自组装分子层中的分子其一端具有与所述金属反应吸附的第一官能团，另一端具有抑制细胞吸附的第二官能团。

优选的，所述部分区域的边界呈圆形、三角形、矩形或者菱形。

优选的，所述小室在基底上的边界呈圆形或者方形。

优选的，所述第一官能团为氢硫键。

优选的，所述第二官能团为聚乙二醇长链。

优选的，所述小室阵列为N行M列的阵列，N为介于1-20之间的自然数，M为介于1-30之间的自然数。

根据本发明的另一方面，还提供一种二维细胞划痕芯片的制备方法，包括步骤：

S1：制备上下两侧开口的小室阵列；

S2：在一基底上沉积金属层阵列；

S3：采用键合方式将所述基底和小室阵列固定，使所述基底封闭小室阵列的其中一侧开口，形成多个单侧开口的三维小室，并且所述金属层阵列一一对应的位于每个小室之内；

S4：在所述金属层上形成自组装分子层，所述自组装分子层中的分子其一端具有与所述金属反应吸附的第一官能团，另一端具有抑制细胞吸附的第二官能团。

优选的，步骤S4包括子步骤：将基底进行清洗，以去除金属表面杂质；在每个小室内滴加稀释的硫醇溶液，密封浸泡后，在表面形成自组装分子层。

根据本发明的另一方面，提供一种应用以上任一所述芯片进行二维细胞迁移实验，包括：

在小室的不含金属层区域的表面进行细胞外基质修饰，使细胞接种后容易在基底表面贴壁生长；

消化细胞至悬浮状态，并将细胞悬浮液接种于各个小室，然后培养细胞，直至细胞在小室的不含金属层区域贴壁生长；

细胞贴壁生长以后，在自组装分子层的作用下，细胞被限制在不含金属层区域；

当细胞融合生长为单层时，将小室内的培养基吸出，并加入胶原溶液，待胶原溶液自然铺开以后，将芯片置于培养箱，使胶原完全固化；

胶原固化后，在每个小室内加入含不同种类或浓度趋化因子的细胞培养基，之后二维的细胞单层会依附胶原进行迁移，再拍照记录细胞二维迁移的情况。

(三)有益效果

从上述技术方案可以看出，本发明二维细胞划痕芯片及其制备方法、应用具有以下有益效果：

(1)与现有的细胞划痕法相比，本发明用结构控制划痕边界，用加胶原的方法覆盖硫醇，可以保证各个孔间划痕一致，且细胞和细胞外基质在此过程中不会受损，因此本方法的迁移结果精准可信；

(2)本发明与现有的基于微加工技术的划痕研究相比，一块芯片上可以实现多组(例如384组)平行实验，通量高。在降低成本方面，一方 面因为通量高；另一方面，理论上芯片可以重复利用。使用过的芯片经过清洗和无菌处理后，可以再次进行硫醇修饰，投入到划痕实验中，这又再次大大降低了本技术方法的成本；

(3)沉积金属层的边界与所述小室在基底一侧的边界不接触，可以控制细胞实现二维迁移。

附图说明

图1是本发明实施例二维细胞划痕芯片技术方法总流程图；

图2是本发明实施例二维细胞划痕芯片的设计原理图；

图3是本发明实施例二维细胞划痕芯片结构示意图；

图4是本发明实施例二维细胞划痕芯片制作流程图；

图5是本发明实施例二维细胞划痕芯片制作过程示意图；

图6是本发明实施例二维细胞划痕芯片的片上实验流程图；

图7是本发明实施例二维细胞划痕芯片的片上实验示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

本发明将微加工技术与划痕实验相结合，设计了一种能够高通量的，可以实时观察细胞迁移的划痕芯片。本芯片在结构上，与传统多孔板技术兼容，可以完全应用于现有的多孔板平台。以下将以96孔板为例，介绍本发明的技术方法，当然本发明并不仅限于此，也可以是N行M列的任意阵列，其中N为介于1-20之间的自然数，M为介于1-30之间的自然数。本技术方法具体实施情况如下：

本技术方法总流程包括芯片的设计(即二维细胞划痕芯片的设计)、芯片制作(即二维细胞划痕芯片的制备方法)、片上实验以及数据处理(即二维细胞划痕芯片的应用)，其示意图如图1：

图1是本发明实施例二维细胞划痕芯片技术方法总流程图，流程包括：步骤1，芯片设计：

芯片设计的原理可参照图2所示。图2是本发明实施例二维细胞划痕芯片的设计原理图。本实施例采用含第一官能团和第二官能团的自组装分子层，例如聚乙二醇长链(PEG)的硫醇分子(EG-terminated thiols，简称EG6，分子式为HS(CH₂)₁₁(OCH₂CH₂)₆OH)。这种硫醇分子可以与金属金(Au)发生反应，在硫原子(S)的一侧形成金硫键。而硫醇的另一端因为有PEG的存在，可以起到抗蛋白吸附的作用，进而阻止细胞吸附在Au表面。

本领域技术人员应当知晓，硫醇分子中抑制细胞和蛋白吸附的聚乙二醇长链并不限于某一种化学分子式，还可以是[-CH₂CH₂O-]₄OH、[-CH₂CH₂O-]₄CH₃以及其他化学式。硫醇分子不局限于某一种聚合物分子，只要是一端具有可以吸附于金表面的氢硫键，另一端具有可以阻止细胞粘附的聚乙二醇长链(PEG)都可应用于此。

图3是本发明实施例二维细胞划痕芯片结构示意图。图3中子图A为本发明设计的二维细胞划痕芯片的侧视图，芯片分为三层，由上至下依次为聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)制作的划痕小室层，金结构层，以及最下面的玻璃基底层。

本领域技术人员应当知晓，划痕小室的材料可以是实现细胞实验的任意材料并不仅限于聚二甲基硅氧烷，金属阵列的金属也不仅限于金，以及基底材料并不仅限于玻璃材料，本实施列举上述材料仅为进行详细叙述而不是为了限制本发明。

图3中子图B为本发明设计的二维细胞划痕芯片的俯视图。PDMS厚度为8毫米，其形成的划痕小室层上有8行12列共96个圆形的划痕小室，其直径为6厘米，相邻小室的中心间距为9厘米，与标准96孔板尺寸一致。每个小室内对应一个圆形的金结构，直径为1毫米。最下层的玻璃基底厚度为1毫米。上述尺寸设置仅为例示性的，本领域技术人员可以设计任意能够实现细胞三维迁移的小室和Au圆尺寸。

图3中子图C给出了每个划痕小室的放大图，可以看到每个划痕小室孔内包括金表面和玻璃表面。其中金结构为直径1毫米的圆形，其余为玻璃表面。

步骤2，芯片制作：

制作流程包括PDMS划痕小室阵列的制作和玻璃基底表面Au结构的制作，并将两者键合后进行Au结构的硫醇化，使Au结构表面形成PEG。PDMS划痕小室阵列的制作步骤包括：3D打印PDMS阳模、浇注PDMS、翻模得到划痕小室。玻璃基底表面Au结构的制作步骤包括：光刻胶阳模(例如AZ1500)制作、铬和金的溅射、剥离得到金结构。而后，需要经过PDMS与玻璃键合、硫醇修饰金结构和金表面形成PEG几个步骤，以完成芯片制作。整体芯片制作流程如图4：流程包括：

S1：制备上下两侧开口的小室阵列，该步骤包含子步骤A2-C2：

子步骤A2，3D打印PDMS阳模：

用三维绘图软件画出PDMS阳模的三维图，输入3D打印机软件，打印机就会自动打出图5中子图A所示的阳模。

子步骤B2，浇注PDMS：

PDMS与固化剂按一定比例混合后，搅拌均匀，浇在3D打印的阳模上，一定温度上烘烤过夜使其固化。见图5中子图B。

子步骤C2，翻模得到划痕小室：

固化后的PDMS翻模，得到96孔阵列，即为划痕小室阵列。见图5中子图C。

步骤S2：在一基底上沉积金属层阵列，该步骤包含子步骤D2-F2

子步骤D2，AZ1500阳模制作：

玻璃片在丙酮、乙醇和去离子水中依次清洗，烘干后表面均匀旋转涂敷一层AZ1500，放上掩模板曝光。在显影液中显影后，在需要溅射结构的位置暴露出玻璃表面，而不需要溅射结构的位置留下AZ1500形成的牺牲层。见图5中子图D。当然，上述AZ1500仅为例示性材料，本领域技术人员可以替代的选取任意的可以制作模型的材料。

子步骤E2，铬、金的溅射：

上一步骤得到的玻璃片上先溅射一层铬，增强Au结构的吸附性，然后溅射一层Au。见图5中子图E。

子步骤F2，剥离得到金结构：

将玻璃片置于丙酮中浸泡并超声，直至金属层完全剥离，完成Au结构的制作。见图5中子图F。

子步骤G2，PDMS与玻璃键合(也即步骤S3)：

见图5中子图G，将PDMS制作的划痕小室层和制作好Au结构的玻璃基底层二者键合，得到完整芯片。

步骤S4：在所述金属层上形成自组装分子层，所述自组装分子层中的分子其一端具有与所述金属反应吸附的第一官能团，另一端具有抑制细胞吸附的第二官能团。该步骤包括子步骤H2和I2。

子步骤H2，硫醇修饰金结构：

修饰硫醇之前，先将完整芯片进行清洗，以去除掉Au表面的杂质，增强硫醇修饰的效果。而后，见图5中子图H，在每个划痕小室内滴加稀释的硫醇溶液，浸泡一段时间，一般为24h，使Au结构与硫醇发生反应。

子步骤I2，金表面形成PEG：

见图5中子图I，Au结构在硫醇溶液中浸泡一段时间之后，在其表面形成一层PEG。至此，芯片的制作已全部完成。

步骤3，片上实验：

上述制作完成的二维细胞划痕芯片，在此步骤将详细介绍使用的方法和操作的步骤。主要分为修饰细胞外基质、细胞接种及贴壁、加胶原覆盖硫醇及胶原固化和细胞迁移几个步骤，流程图见图6，流程包括：

子步骤A3，修饰细胞外基质：

细胞接种之前，需要在划痕小室的玻璃表面进行细胞外基质修饰，其中细胞外基质一般为纤连蛋白，增强细胞在玻璃表面的粘附性，使细胞接种后更加容易在玻璃表面贴壁生长，见图7中子图A

子步骤B3，细胞接种及贴壁：

消化细胞至悬浮状态，并用移液枪接种在各个划痕小室。培养细胞，直至细胞在Au表面以外的地方贴壁生长，见图7中子图B。通常情况下，细胞贴壁后要更换一次培养基，去掉未贴壁的细胞，具体换液时间视细胞的具体情况而定。培养的注意事项与普通96孔板无异。

子步骤C3，加胶原覆盖硫醇及胶原固化：

一般进行划痕实验前，都要待细胞长满整个玻璃表面，形成单层细胞后再进行。首先吸出划痕小室内的培养基，露出有硫醇修饰的金结构。再 加入一定浓度的胶原溶液(这个浓度可以是1-10mg/ml)，溶液体积能够覆盖整个划痕小室的底面，并不会溢出即可(通常加入30-150μl)。

将加入了胶原的芯片放入一个大的培养皿中，并在培养皿里加入无菌纯水或PBS，保证培养皿中的空气湿度，注意液面不能超过芯片的高度。装有芯片的培养皿整个放入37℃培养箱中，静置一段时间(一般为1h)使胶原完全固化，见图7中子图C。Au结构表面的PEG被完全覆盖，细胞又可以贴壁生长或者迁移至Au表面。

子步骤D3，细胞迁移：

加胶原覆盖硫醇步骤完成之后，再按照具体实验需求，在不同划痕小室内加入有不同种类或浓度趋化因子的培养基。拍照记录一定时间后细胞向Au表面迁移的情况，见图7中子图D。

步骤4，数据处理：

将细胞向Au表面迁移的情况的显微照片进行数据处理，以得到细胞迁移的具体参数。分析的方法可以使用图像识别软件，识别Au表面未被细胞占据的面积，再通过不同种类或浓度趋化因子的迁移结果之间的对比，得到实验结论。

值得提出的是，在上述片上实验的过程中，可以根据实际需要在相应数量的孔内接种细胞，而无需一次实验中完全使用96个孔。而且，在加胶原覆盖硫醇的步骤里，还可以根据实验需要不覆盖部分孔内的硫醇，使这些孔内的硫醇依然起作用，划痕依然存在，灵活可控。

此外，上述对各元件和方法的定义并不仅限于实施例中提到的各种具体结构、形状或方式，本领域普通技术人员可对其进行简单地更改或替换，例如：

(1)划痕小室的形状不局限于圆形，也可以是正方形、三角形等其他规则或不规则图形；

(2)划痕小室的数量也不局限于96，也可以是384、24、12或6等其他标准规格多孔板的孔的数量；

(3)每个划痕小室内，金结构的图案不局限于图3中子图B所示的形状，可以根据所需划痕的形状为长条、方形、三角形等其他规则或不规则图形；

(4)浇注PDMS用的阳模，不只有3D打印一种方法，所使用的材料也不局限于某一种材料，任何能形成柱状阵列的方法和材料都可以用来制作PDMS阳模；

(5)硫醇分子中抑制细胞和蛋白吸附的聚乙二醇长链并不局限于某一种化学分子式，包括[-CH₂CH₂O-]₄OH、[-CH₂CH₂O-]₆OH、[-CH₂CH₂O-]₄CH₃、[-CH₂CH₂O-]₆CH₃以及其他类似的化学式；

(6)用于增强细胞贴壁效果的细胞外基质不局限于纤连蛋白，也可以是多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)等其他细胞外基质；

(7)用于构建细胞三维迁移环境的试剂不局限于胶原，也可以是海藻酸钠和水凝胶等其他试剂；

(8)本发明中提到的方向用语，例如“上”、“下”、“前”、“后”、“左”和“右”等，仅仅表示参考方向，并非用于限制本发明。

至此，已经结合附图对本实施例进行了详细描述。依据以上描述，本领域技术人员应当对本发明二维细胞划痕芯片及其制备方法、应用有了清楚的认识。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。