基于微流控芯片的贴壁细胞划痕制作及迁移观测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于微流控芯片的贴壁细胞划痕制作及迀移观测方法，该贴壁细胞典型地是血管平滑肌细胞。
【背景技术】
[0002]在动脉粥样硬化以及医源性血管损伤(血管成形术、支架植入、器官移植等)并发症形成过程中，血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，简称VSMC)增殖并向内膜迀移是核心机制之一。影响VSMC迀移的因素很多，包括各种生长因子、趋化因子、流体应力等。为探索多因素介导VSMC迀移的机制，重复性好、可信度高的研宄方法是十分必要的。
[0003]传统研宄VSMC迀移主要依赖于细胞趋化小室(Boyden Chamber)和细胞划痕法等经典技术。
[0004]对于细胞趋化小室技术，是以8 μπι孔径滤膜为界，将VSMC接种至上层小室，下室加入不同诱导物，于不同时间点取出滤膜用棉拭子擦掉膜正面的细胞后，膜用甲醇固定，苏木精染色，在显微镜下计数膜背面视野中的细胞数。同时可以在电镜下观察VSMC跨过膜孔的过程。
[0005]对于细胞划痕技术，是在孔板上，当VSMC生长形成融合性的单层时用无菌移液枪头或刀片刮除一定范围的细胞，观察细胞向刮除细胞区的迀移运动。一般以某一细胞群的最大迀移距离为参数表征VSMC迀移能力，同时计数迀移的细胞数。
[0006]然而，在实现本发明的过程中，申请人发现上述VSMS迀移技术存在如下技术缺陷:
[0007](I)现有的VSMC迀移环境，细胞趋化小室技术中，趋化小室的孔径约为1_ ;细胞划痕技术中，实验在多孔板上操作，最小孔径也是毫米级。在这两种技术中，细胞所处的环境都是开放的，而且相对于体内血管壁的微小尺寸和营养物质的代谢形式，差异十分明显，客观上难以真实反映生理状态VSMC的生物学特征。因此需要能更好地模拟活体血管壁微环境的细胞迀移装置；
[0008](2)上述细胞趋化小室技术，不能直接观察细胞的形态及位移，丢失迀移机制的细节，同时不能区分不同干预之间细胞贴壁、铺展、迀移的差异；
[0009](3)上述细胞划痕技术，其划痕速度和尺寸一致性较差；其次在划痕过程中，细胞受到机械性损伤，并释放细胞内容物于周围环境，由于细胞损伤程度不可控，导致迀移结果呈现多样性。
【发明内容】
[0010](一)要解决的技术问题
[0011]鉴于上述技术问题，本发明提供了一种基于微流控芯片的贴壁细胞划痕制作及迀移观测方法，以更好的模拟活体血管壁微环境，更准确的观察细胞的迀移情况。
[0012](二)技术方案
[0013]根据本发明的一个方面，提供了一种基于微流控芯片的贴壁细胞划痕制作方法。该微流控芯片中具有“Y”型结构的微沟道，包括:一主沟道；以及位于该主沟道的一侧并与该主沟道连通的两从沟道，其中，主沟道一侧连接至细胞入口，两从沟道分别连接至第一液滴入口和第二液滴入口，且细胞入口、第一液滴入口和第二液滴入口均高于微沟道所在位置。该贴壁细胞划痕制作方法包括:步骤A:在微流控芯片的微沟道内采用该贴壁细胞对应的完全培养基进行片上贴壁细胞培养；步骤B:将微流控芯片的细胞入口、第一液滴入口和第二液滴入口的溶液全部吸净；步骤C:向微流控芯片的第一液滴入口和第二液滴入口同时、分别注入该贴壁细胞对应的完全培养基和胰蛋白酶溶液；步骤D:静置预设时间；以及步骤E:按顺序从细胞入口、第二液滴入口、第一液滴入口吸净溶液，从而在微流控芯片微沟道的底壁上形成划痕。
[0014]根据本发明的另一个方面，还提供了一种贴壁细胞划痕制作方法的贴壁细胞迀移观测方法。该贴壁细胞迀移观测方法包括:对微流控芯片的微沟道进行表面修饰，以使该微沟道适宜贴壁细胞生长；在微流控芯片的微沟道内进行片上贴壁细胞接种；在微流控芯片的微沟道内进行片上贴壁细胞培养及同步化处理；采用上述的贴壁细胞划痕制作方法制作划痕；在细胞入口和两液滴入口任意其中之一加入含有细胞迀移因子的DMEM，然后把微流控芯片放回培养箱；以及在预设时间之后，对微流控芯片的微沟道内的贴壁细胞进行片上染色，以表征迀移细胞和未迀移细胞。
[0015](三)有益效果
[0016]从上述技术方案可以看出，本发明基于微流控芯片的贴壁细胞划痕制作及迀移观测方法具有以下有益效果:
[0017](I)将微流控技术与传统VSMC迀移技术相结合，在微米级的沟道中实现衬底修饰、VSMC片上培养、VSMC划痕迀移和VSMC染色，为VSMC体外迀移提供更接近生理环境的方法，同时降低了实验成本；
[0018](2)与已经报道依赖于细胞趋化小室的方法相比，本发明可以通过显微镜直观细胞迀移，示踪单细胞，以及量化迀移参数后进行染色，获得的信息量更全面；
[0019](3)与已经报道的传统划痕方法相比，基于重力作用实现细胞划痕，规范了操作标准，减少人为误差，提高了划痕尺寸及细胞受损情况的可重复性、一致性，使结果可比拟。
【附图说明】
[0020]图1为本发明实施例中所设计的微流控芯片形成划痕的原理图；
[0021]图2A和图2B分别为根据本发明实施例贴壁细胞划痕制作方法所采用的微流控芯片的俯视图及侧视图；
[0022]图3为根据本发明实施例中所采用的微流控芯片的制作过程的示意图；
[0023]图4为根据本发明实施例贴壁细胞划痕制作方法的流程图；
[0024]图5为根据本发明实施例贴壁细胞迀移观测方法的流程图；
[0025]图6为培养至微沟道内充满单层VSMC后微沟道内细胞状态的示意图和真实显微图像；
[0026]图7为制作划痕和记录划痕状态后微沟道内细胞状态的示意图和真实显微图像；
[0027]图8为染色步骤后微沟道内细胞状态的示意图和真实显微图像。
【具体实施方式】
[0028]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。需要说明的是，在附图或说明书描述中，相似或相同的部分都使用相同的图号。附图中未绘示或描述的实现方式，为所属技术领域中普通技术人员所知的形式。另外，虽然本文可提供包含特定值的参数的示范，但应了解，参数无需确切等于相应的值，而是可在可接受的误差容限或设计约束内近似于相应的值。实施例中提到的方向用语，例如“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等，仅是参考附图的方向。因此，使用的方向用语是用来说明并非用来限制本发明的保护范围。
[0029]本发明将微流控技术与传统贴壁细胞迀移技术相结合，在微流控技术中实现基于重力作用的衬底修饰、贴壁细胞片上培养、染色，以及基于层流原理的划痕制作，并利用显微镜观察迀移。所谓的层流是指管道内流速较低时流体呈层状流动的一种流动状态。
[0030]图1为本发明实施例中所设计的微流控芯片形成划痕的原理图。如图1所示，在一个Y型沟道里，若在两个入口注入不同的溶液，只要液体流速够低，主沟道内的两种液体就不会发生混合，而是分层流动。利用这个原理，在两个入口分别通入Trypsin和含有血清的培养基，即可在主沟道内Trypsin流经的区域形成划痕。
[0031]在本发明的一个示例性实施例中，提供了一种基于微流控芯片的贴壁细胞划痕制作方法。首先，对本实施例所采用的微流控芯片进行详细说明。
[0032]图2A和图2B分别为根据本发明实施例贴壁细胞划痕制作方法所采用的微流控芯片的俯视图及主视图。请参照图2A和图2B，该微流控芯片中的微沟道呈Y型结构，包括一主沟道；以及位于该主沟道的一侧并与该主沟道连通的两从沟道。其中，主沟道的长度为3mm，宽度为800 μ m。两从沟道的长度为4mm，宽度为400 μ m。该主沟道和从沟道的横截面形状均为矩形，高度约为100 μ m。每个沟道端口各有一个开口，主沟道一侧连接至细胞入口，从沟道一侧连接至两液滴入口 -第一液滴入口和第二液滴入口，各个入口孔径为5mm。并且，该细胞入口、第一液滴入口和第二液滴入口均高出主沟道和两从沟道顶部约8_。
[0033]以下简单介绍该微流控芯片的制作过程。如图3所示，该微流控芯片的制作过程如下:
[0034]步骤S202:光刻胶SU8-5制作种子层:
[0035]载玻片在丙酮、乙醇和去离子水中依次清洗，烘干后表面均匀旋转涂敷一层SU
8-5，曝光形成种子层，见图3中子图A。
[0036]步骤S204:光刻胶SU8-2100制作阳模:
[0037]种子层上再均匀旋转涂敷一层SU 8-2100，放上掩模版曝光，见图3中子图B ;显影、坚膜得到细胞迀移微沟道阳模，见图3中子图C。
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