马蔺耐盐相关液泡膜H+‑PPsae基因及其编码蛋白与应用的制作方法

本发明涉及基因工程及遗传育种领域，具体地说，涉及马蔺耐盐相关液泡膜H⁺-PPsae基因及其编码蛋白与应用。

背景技术：

目前我国土壤盐渍化日益严重，已经严重影响到农作物的生产，导致农业生产力下降，增强植物耐盐性或改良土壤盐碱化已成为现阶段面临的主要问题。马蔺(Iris lactea Pall.var.chinensis(Fisch.)Koidz.)是鸢尾科鸢尾属多年草本植物，主要分布于我国东北、西北、华北等地区的低地盐碱化草甸、荒漠草原草地、山坡荒野等，具有极强的抗旱耐盐性，并已成为退化盐化低地草甸的指示植物之一，因其叶色青绿，绿期长，花色淡雅美丽，管理粗放，已经成为城市园林景观配置和郊野公园绿地建设的优良地被植物。

大量研究表明，造成植物的生理干旱的原因是土壤中钠离子浓度过高，破坏了细胞的离子平衡，细胞膜的功能和代谢活动都将受到抑制，严重的可导致细胞死亡，而Na⁺外排和区域化是植物细胞抵御Na⁺毒害的主要策略。细胞质中过多Na⁺将区域化到液泡中，H⁺-ATPase和H⁺-PPase共同构成的液泡膜质子泵能形成H⁺跨膜电化学梯度，为液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的功能的实现提供驱动力，降低Na⁺对细胞质中代谢酶的损害，维持细胞膨压，最终提高植物的抗旱耐盐能力。与液泡膜H⁺-ATPase相比，H⁺-PPase仅由单基因编码，且在建立跨膜电化学势梯度上的作用与H⁺-ATPase相当，甚至贡献更大，因此对H⁺-PPase的研究更具现实意义。据报道，已从拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大麦(Hordeum vulgare)、甜菜(Beta valgaris)、水稻(Oryza sativa)、梭梭(Haloxylon ammodendron)等诸多植物中克隆得到H⁺-PPsae基因。H⁺-PPase的活性通常被高浓度的Na⁺抑制，而低浓度的Na⁺反而会提高其转录水平。植物种类、器官类型、发育状态以及盐溶液中的Na⁺浓度影响着植物液泡膜H⁺-PPase活性或转录水平的变化。在对胡萝卜(Daucus carota)、向日葵(Helianthus annuus)、大麦等植物H⁺-PPase对盐胁迫响应的研究表明，在不同NaCl处理条件下，H⁺-PPase活性均比对照高，表明NaCl可诱导H⁺-PPase活性上升。而大麦经200mM NaCl处理后，根部H⁺-PPase活性比对照降低一倍。此外，NaCl对H⁺-PPase的抑制作用可被外源Ca²⁺缓解，降低细胞内Na⁺、Cl^-含量和K⁺外渗，抑制Na⁺吸收是Ca²⁺缓解盐害的作用机理之一。

技术实现要素：

本发明的目的是提供马蔺耐盐相关液泡膜H⁺-PPsae基因及其编码蛋白。

本发明的另一目的是提供马蔺耐盐相关液泡膜H⁺-PPsae基因的应用，该基因可用于农作物和优良牧草的耐盐抗旱遗传改良。

为了实现本发明目的，本发明提供的马蔺耐盐相关液泡膜H⁺-PPsae基因IlVP，所述基因IlVP的cDNA序列为：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

所述马蔺耐盐相关液泡膜H⁺-PPsae基因IlVP编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供含有所述基因IlVP的表达盒。

本发明还提供含有所述基因IlVP或所述表达盒的载体。

本发明还提供含有所述基因IlVP、所述表达盒或所述载体的工程菌、转基因细胞系。

携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，2^nd Edition)。

本发明还提供所述基因IlVP在提高植物(例如烟草、拟南芥等)耐盐性中的应用。

在本发明的一个具体实施方式中，采用农杆菌介导的方法，将含有所述基因IlVP的载体转入烟草中，转化后的材料经过共培养-筛选-分化-转基因苗的锻炼和移栽，筛选过表达基因IlVP的转基因烟草。优选地，所用出发载体为植物表达载体pBI121。

本发明还提供所述基因IlVP在制备转基因植物中的应用。

本发明进一步提供所述基因IlVP在植物抗逆遗传改良中的应用。

本发明首次从耐盐性较强的马蔺中克隆获得耐盐相关液泡膜H⁺-PPsae基因IlVP，并将该基因导入烟草，使烟草的耐盐性得到明显提高。本发明的耐盐基因IlVP为农作物和优良牧草的耐盐遗传改良和新品种选育提供重要的科学理论依据。

附图说明

图1为本发明实施例1中马蔺耐盐相关基因IlVP的cDNA克隆结果。以马蔺cDNA为模板，PCR扩增核心区、3’端、5’端、ORF片段。M1：DL2000；1：核心片段；2:3’端片段；3:5’端片段；4-5：ORF片段。

图2为本发明实施例1中马蔺IlVP基因cDNA核酸序列及其推测的氨基酸序列。左侧的数字分别代表核苷酸和氨基酸的位点，阴影处为起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)以及三个保守片段。

图3为本发明实施例1中马蔺基因IlVP编码蛋白的跨膜区结构。

图4为本发明实施例1中马蔺基因IlVP与海枣PdVP、水稻OsVP及拟南芥AtVP氨基酸的多重比对结果。

图5为本发明实施例2中盐胁迫下马蔺基因IlVP表达模式的分析结果。(a)：Real time PCR分析200mM NaCl处理马蔺幼苗24h基因IlVP在地上部和根中的表达模式；(b):在0，25，50，100，200mM NaCl分别处理0、6、12、24和48h后对幼苗地上部IlVP基因表达水平的影响。图中每个点均代表平均值±标准误(n＝3)，Actin为内参。

图6为本发明实施例3中植物表达载体pBI121-IlVP的质粒图谱。

图7为本发明实施例3中转IlVP基因烟草的制备及鉴定。a：叶盘预培养；b：叶片边缘膨大；c：愈伤组织分化；d：抗性芽培养；e：抗性苗生长；f：抗性植株。

图8为本发明实施例3中转IlVP基因阳性烟草植株的鉴定结果。A：转基因烟草基因组DNA PCR检测；B：转基因烟草植株Southern Blot杂交鉴定；C：转基因烟草植株Northern Blot杂交鉴定。

图9为本发明实施例3中转IlVP基因烟草耐盐性鉴定结果。A：盐胁迫7d后对野生型与转基因烟草生长情况的影响(WT：野生型烟草，T：转基因烟草)；B：盐胁迫7d后对野生型与转基因烟草生长状况及根、茎、叶中Na⁺(a)、K⁺(b)、Ca²⁺(c)变化的影响；C：NaCl胁迫处理7d对野生型和转基因烟草植株根、茎、叶的鲜重(a)和干重(b)的影响；D：NaCl胁迫处理7d对野生型和转基因烟草叶片相对含水量的影响；E：NaCl胁迫处理7d对野生型和转基因烟草相对质膜透性的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 马蔺耐盐相关液泡膜H⁺-PPsae基因IlVP克隆与鉴定

根据已知植物的液泡膜H+-PPsae基因VP的高度保守区设计一对简并引物，用Takara RNA提取试剂盒(Takara MiniBEST Plant RNA Extraction Kit)提取马蔺根总RNA，以总RNA为模板用PrimeScript TM RT reagent kit with gDNA Eraser反转录试剂盒合成cDNA第一链，采用RT-PCR方法扩增得到马蔺VP基因核心片段为893bp；再以马蔺VP基因核心序列为基础，分别设计5’和3’EACE引物，利用5’RACE试剂盒(SMARTer RACE 5’/3’Kit User Manual)和3’RACE试剂盒(TAKARA3’-Full RACE Core Set with PrimeScript^TMRTase)获得5’和3’片段长度分别为881bp和1117bp。最后将以上3个片段拼接得到SEQ ID NO:1所示的IlVP基因的全长cDNA序列，大小为2738bp，包含2316bp的开放阅读框(ORF)，103bp的5’非翻译区(UTR)和319bp的3’-UTR(图1)，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列中含有GGG、DVGADLVGK和KAADVGADLVGKVE三个高度保守片段，是液泡膜H⁺-PPase的PPI结合位点(图2)。

马蔺基因IlVP编码蛋白的跨膜区结构见图3。马蔺基因IlVP与海枣PdVP、水稻OsVP及拟南芥AtVP氨基酸的多重比对结果见图4。

引物序列如下：

①扩增基因IlVP cDNA序列核心片段的简并引物：

P1：5’-TATGGTGATGAYTGGGAAGG-3’

P2：5’-GCAATRCCWCCAGCATTRTCA-3’

②用于5’RACE试剂盒的，扩增基因IlVP cDNA序列5’端的引物：

UPM：

Long(0.4μM)：

5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'

Short(2μM)：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'

P3：5′-GTCAGCAATCACAGCTGGGTTTCTA-3′

NUP：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’

P4：5′-CAACATCAGCAGCTTTAGTGTAGATA-3′

③用于RACE试剂盒的，扩增基因IlVP cDNA序列3’端的引物：

P5：5′-GCTGATGTTGGTGCTGATCTTGT-3′

3’O：5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’

P6：5′-TATGGCCCCATCAGTGACAATGCT-3′

3’I：5’-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3’

④用于扩增基因IlVP cDNA全长的引物：

P7:5′-TCCCCCGGGATGGTGGCGGCGATGCT-3′(下划线为Sma I酶切位点)

P8:5′-CGAGCTCTTAGAAGATCTTGAAGAGGATGCC-3′(下划线为Sac I酶切位点)

实施例2 马蔺耐盐相关液泡膜H⁺-PPsae基因IlVP在盐胁迫下的表达分析

6周龄的马蔺幼苗用200mM NaCl处理24h，分别取根和叶各200mg提取RNA，分析IlVP在组织中特异性的表达，并进一步分析不同浓度(0、25、50、100及200mM)NaCl处理0、6、12、24和48h后对其IlVP基因表达模式的影响。以马蔺IlActin为内参，设计两对基因表达引物：

Actin-F：5′-TATTGTGCTGGATTCTGGTGATG-3′

Actin-R：5′-GGAGGATAGCATGGGGAAGAG-3′

VP-F：5′-CGAACTGACTGCTATGATGTACCC-3′

VP-R：5′-CCAACTAACAACCGCAATACCA-3′

利用 Premix Eix Taq^TM(Tli RNaseH Plus)试剂盒进行Real Time PCR，其反应体系：cDNA 1,Primers 1.6μL,ROX Reference Dye 0.4μL, PremixEix Taq 10μL,dH₂O 7μL。结果显示，马蔺地上部IlVP表达受NaCl盐处理的诱导，且随着NaCl盐浓度及处理的时间增加地上部IlVP转录丰度显著上调，这有利于将其地上部细胞质中的Na⁺及时有效地区域化在液泡中，从而减轻盐对植物的伤害(图5)。

实施例3 马蔺耐盐相关液泡膜H⁺-PPsae基因IlVP增强烟草的耐盐性

1、重组表达载体的构建

将含有马蔺IlVP基因ORF框的质粒经Sma I与Sca I双酶切后，用1.2％凝胶电泳检测酶切产物，胶回收载体小片段，命名为IlVP-A。用Sma I与Sca I对植物真核表达载体pBI121进行双酶切，凝胶电泳检测酶切产物，得到pBI121线性载体，将pBI121线性载体进行胶回收大片段，命名为pBI121-B。将片段pBI121-B与IlVP-A参照DNA Ligation试剂盒说明书(Takara)进行连接，构建得到植物表达载体pBI121-IlVP(图6)。将pBI121-IlVP转化到大肠杆菌E.coli DH5α中，筛选阳性克隆，进行PCR检测，PCR产物使用Sac I和Sma I进行双酶切检测，结果得到2316bp大小的特异条带，说明成功构建马蔺IlVP基因植物表达载体。

2、转基因烟草的获得及阳性鉴定

1)转基因烟草的获得

用冻融法将构建的植物表达载体pBI121-IlVP导入根癌农杆菌EHA105中，挑取阳性菌落摇菌后提取质粒DNA，经双酶切鉴定得到与预期一致的两条带，说明植物表达载体已成功转入农杆菌中。将烟草W38叶盘接种于MS分化培养基中预培养至边缘膨大，置于农杆菌液中侵染后共培养2～3d，接种于MS筛选分化培养基(MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+50mg/L Kan+500mg/L Carb)中培养。待分化出的抗性苗长至1～3cm时，即可移入MS培养基(MS+50mg/L Kan+500mg/L Carb)中培养。当生长空间不足时，并将阳性植株移入装有珍珠岩和蛭石(1:3)的花盆中继续培养(图7)。

2)转基因烟草阳性植株的鉴定

以野生型烟草为阴性对照，YCF1/YCR1为引物，以转基因植株的DNA为模板，按照Tks Gflex^TM DNA Polymerase试剂盒说明进行PCR检测，鉴定转基因烟草阳性植株(图8A)。

引物序列如下：

YCF1:5′-CATTGCTGGGATGGGTTC-3′

YCR1:5′-TCGTGGCTGCTCCTGTTC-3′

进一步通过Southern Blot(图8B)和Northern Blot(图8C)检测鉴定转基因烟草阳性植株。随机选择4株转基因烟草植株，以叶片为材料提取DNA，根据PCR法DIG标记试剂盒制备Southern Blot探针，用Dra I酶切30μg DNA样品，纯化后加样至1％琼脂糖凝胶中，于20V电压电泳过夜。利用向上毛细管法进行转膜，预杂交2h后加入变性探针杂交过夜，洗膜显色后的结果显示马蔺IlVP基因已成功整合到烟草植株中。

随机选择8株转基因烟草植株，以叶片为材料提取RNA，根据Northern Blot DIG-PCR扩增标记探针，在1.1％的琼脂糖甲醛变性胶上以50V电泳3h。利用向上毛细管法进行转膜，预杂交2h后加入变性探针杂交过夜。使用DIGD-210地高辛杂交检测试剂盒II进行洗膜及信号检测，显色后的结果说明IlVP基因在烟草18号材料中表达丰度最高，在3号材料中表达丰度最低。

3、转IlVP基因烟草耐盐性鉴定

1)盐胁迫下转基因烟草形态变化

分别用0mM和200mM的NaCl对转基因烟草植株和野生型植株处理7d后，观察其生长状况。正常条件下(0mM NaCl)野生型和转基因植株在生长形态上没有明显差异，但在200mM NaCl胁迫下，转基因植株生长基本正常，只有靠近根部的老叶片有发黄的现象，而野生型植株生长则受到抑制，长势变缓，叶片枯黄萎蔫严重。说明转基因型烟草具有较强的耐盐性(图9A)。

2)盐胁迫下转基因烟草生理指标测定

将长势一致的野生型烟草、转基因烟草株系3和株系18分别使用含0、50、100、200mM NaCl的Hoagland营养液浇灌，6次重复，每重复3株，7天后分别测定根、茎、叶的鲜重和干重，叶片相对含水量、相对电导率、Na⁺、K⁺、Ca²⁺含量。每个处理称取烟草植株根、茎、叶鲜重，80℃下烘干，每12h称重一次，直到重量恒定，称其干重。按照高俊凤的方法测定叶片的相对含水量及质膜透性(相对电导率)。使用火焰分光光度计分别测定其根、茎、叶中的Na⁺、K⁺、Ca²⁺含量。测定结果表明，转基因烟草植株对NaCl胁迫具有较强的耐受性，说明过量表达马蔺IlVP提高了转基因烟草的耐盐性(图9B-图9E)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

SPAC水分热力学函数及幼苗各叶位水分状况,高俊凤等，《西北农林科技大学学报(自然科学版)》，1989(01):34-38