一种携带两个G基因和VP2基因的重组狂犬病病毒及其应用的制作方法

本发明属于分子生物免疫学领域。更具体地，涉及一种携带两个G基因和VP2基因的重组狂犬病病毒及其应用。

背景技术：

由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)引起的狂犬病(Rabies)是以侵染中枢神经系统为特点的烈性人兽共患传染病，一旦发病致死率几乎高达100％。亚非地区属于狂犬病的高发地，猫、狗等家养动物是携带RV的主要宿主，约99％的患者是被这些动物咬伤或抓伤后而患病，狂犬病仍是严重威胁这些地区人们生命安全的重要传染病。我国是狂犬病的高发区，发病人数仅次于印度，高居世界第二位。随着家养宠物的增加，我国狂犬病的控制和防治依然任重道远。目前对于狂犬病，主要以有效的疫苗防治为主，人或者动物一旦发病，无特效药可治，所以，安全有效的疫苗是消除我国人间狂犬病的重要手段。

在我国，犬只成为狂犬病的主要带毒宿主和传播源，要想在我国消灭人狂犬病，就必须减少流浪狗的数量，普及家养犬只的免疫，使其免疫率达到70％以上，先在动物中消灭狂犬病。我国目前虽然刚批准几款具自主知识产权的兽用灭活狂犬疫苗，但因生产规模的限制、生产成本的偏高和长期使用进口灭活疫苗的惯性，国产兽用灭活疫苗尚未在国内大量施用。绝大部分经济发达的城市仍然首选进口灭活疫苗，这些灭活疫苗对于农村和经济落后地区来说价格太高，难以大规模推广使用，国产的灭活疫苗虽然价格便宜，但其免疫效果不佳。因此，有必要进一步降低研发成本，开发出价格低廉、安全、有效的人用及兽用狂犬病疫苗。

另外，犬的另一种高传染性和高致病性的疾病是犬细小病毒性肠炎，可引起成年犬严重胃肠炎和幼犬心肌炎。犬细小病毒(CPV)属于细小病毒科，细小病毒属。该病毒的形态结构特征为无囊膜，直径约18～26nm，二十面体对称。多数病毒粒子含有3种多肽：VP1(70～90KD)、VP2(62～76KD)和VP3(39～69KD)，VP2系构成衣壳蛋白的主要成分，具有血凝活性。空衣壳中只含有2种蛋白——VP1和VP2，研究表明，VP3是VP2的裂解物，只在衣壳装配和病毒基因组包装后才出现。VP2蛋白是CPV主要的抗原蛋白，能诱导犬产生抵抗致死性CPV攻击的中和抗体，研究表明，犬只血清中CPV的HI抗体≥1:80即可保护犬只不受CPV野毒感染。CPV目前只有一个抗原性，CPV-2,主要分为其三个亚型：CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c，我国流行的主要毒株为CPV-2a亚型。CPV的灭活疫苗能够有效的防御强毒的攻击，但是不能有效的阻止已感染犬通过粪便把毒排出体外，且分泌的胃肠道局部抗体有限，所以这种再次感染和传播是无法预防的。在免疫持续期上，CPV灭活疫苗所诱导的血清抗体持续时间不超半年，需要加强免疫才能再次产生保护力，因此，在保持抗体效价和免疫效果上都具有一定的缺陷。弱毒疫苗大多数是在CPV-2基础上改进的，在保持抗体效价和效果方面都比较理想，目前市场上的商品化弱毒疫苗有二联苗、四联苗、五联苗、六联苗、八联苗。虽然弱毒苗的效果比较理想，在一定程度上能抵抗CPV强毒的感染，但是弱毒株可能发生突变、毒力返强现象，对犬群和野生动物造成极大危害。传统疫苗容易受到母源抗体的影响而导致免疫失败，国内外均有犬群接种疫苗后仍暴发CPV的报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，利用分子生物学手段，以狂犬病疫苗候选株HEP-Flury为骨架，将国内目前流行的CPV-2a毒株的VP2基因以及额外一个狂犬病毒的G基因插入HEP-Flury；通过拯救获得携带两个G且表达VP2蛋白的重组狂犬病毒株，能够免疫诱导产生较高的抗狂犬病病毒抗体与抗犬细小病毒VP2抗体水平，还可以降低犬用疫苗的成本。

本发明的目的是提供一株CPV-2a亚型毒株的VP2基因。

本发明另一目的是提供一种携带两个G基因和VP2基因的重组狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)，将额外一个狂犬病毒的G基因及VP2基因同时克隆至HEP-Flury假基因区，并拯救出重组病毒。并进一步对重组病毒的鉴定以及作为二联疫苗的效果评估。

本发明的再一目的是提供所述重组狂犬病病毒在作为或制备疫苗方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一株CPV-2a亚型毒株的VP2基因，该基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

该基因是利用通过生物信息学，从当前我国流行的CPV毒株(CPV-2a亚型毒株)中分析筛选并扩增得到，其表达的VP2蛋白免疫动物后产生的中和抗体能够更加有效的中和当前流行的CPV，更好的保护动物抵抗变异CPV毒株感染。

一种携带两个G基因和VP2基因的重组狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)，是以狂犬病病毒HEP-Flury株为骨架，将SEQ ID NO.1所示的VP2基因插入HEP-Flury，再插入额外一个狂犬病毒的G基因，得到携带两个G基因和VP2基因的重组质粒pHEP-Flury(dG-VP2)，最后拯救筛选获得重组狂犬病病毒株rHEP-Flury(dG-VP2)。

具体地：是首先将VP2基因克隆到狂犬病病毒HEP-Flury株全长cDNA克隆中，构建了表达犬细小病毒VP2蛋白的重组cDNA克隆pHEP-Flury(VP2)；在获得pHEP-Flury(VP2)重组质粒的基础上，在其基因组G-VP2基因之间再插入一个拷贝的G基因，成功构建携带双G基因和VP2基因的全长感染性克隆pHEP-Flury(dG-VP2)；最后将cDNA克隆pHEP-Flury(dG-VP2)和表达狂犬病病毒N、P、G和L蛋白的辅助质粒共转染BHK-21细胞，拯救获得了携带双G基因和VP2基因的一株嵌合狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)。

该重组狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)携带两个G基因且表达VP2蛋白，能够免疫诱导产生较高的抗狂犬病病毒抗体与抗犬细小病毒VP2抗体水平，还可以降低犬用疫苗的成本。

具体地，所述重组狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)中，构建后的两个G基因相邻。而且所述VP2基因被克隆至携带两个G的狂犬病病毒株rHEP-dG假基因区的第二个G后面，即G基因和L基因中间，构建策略如附图1所示。

本发明拯救的HEP-Flury假基因区有多个酶切位点，易于克隆和表达多个外源基因，易于将VP2基因克隆至狂犬病病毒株HEP-Flury。本发明将VP2基因克隆至携带两个G的狂犬病病毒假基因区进行独立表达的策略，VP2蛋白被单独表达，而非融合表达。

另外，具体地，作为一种优选的可实施方案，本发明所述重组狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)的构建方法包括如下步骤：

S1.构建重组质粒pHEP-Flury(VP2)：将SEQ ID NO.1所示VP2基因克隆至狂犬病病毒HEP-Flury株全长cDNA中；

S2.构建重组质粒pHEP-Flury(dG-VP2)：在重组质粒pHEP-Flury(VP2)基因组的G基因和VP2基因之间再插入一个拷贝的G基因；

S3.利用重组质粒pHEP-Flury(dG-VP2)进行拯救获得重组病毒rHEP-Flury(dG-VP2)。

具体地，步骤S1构建重组质粒pHEP-Flury(VP2)的具体方法如下：

S11.利用引物VP2.F/VP2.R扩增VP2基因，并引入Bsi WI和Nhe I酶切位点

S12.利用核酸限制性内切酶Bsi WI和Nhe I，分别VP2基因和pHEP-3.0质粒对进行酶切处理，两者的酶切产物连接获得重组质粒pHEP-Flury(VP2)

其中，优选地，步骤S11所述引物VP2.F/VP2.R的序列分别如SEQ ID NO.2和3所示。

优选地，步骤S12所述pHEP-3.0质粒是携带HEP-Flury毒株全长cDNA的重组质粒。

优选地，步骤S11所述扩增的PCR体系为：10×KOD Buffer 5.0μL、dNTPs(2.0μM)5.0μL、20pmol的引物VP2.F 1.0μL、20pmol的引物VP2.R 1.0μL、CPV模板DNA、4.0μL、1U/μL的KOD-Plus DNA Polymerase 1.0μL、ddH₂O 33μL。

优选地，步骤S11所述扩增的PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，52℃30s，68℃2min，运行25个循环；最后68℃延伸10min。

优选地，步骤S12所述酶切处理的酶切体系为：VP2/pHEP-3.0 4μL、10×Tango buffer 2μL、Nhe I 1μL、Bsi WI 1μL、ddH₂O 13μL。

优选地，步骤S12所述连接的反应体系为：VP2基因酶切产物7μL、pHEP-3.0酶切产物1μL、T4DNA连接酶10×Buffer 1μL、T4DNA连接酶1μL。

优选地，步骤S2构建重组质粒pHEP-Flury(dG-VP2)的具体方法如下：

S21.利用引物pDV2.F和pDV2.R对重组质粒pHEP-Flury(VP2)进行PCR扩增，得到产物命名G-VP2S；

S22.将G-VP2S和重组质粒pHEP-Flury(VP2)分别利用Acc65I/Pst I和Bsi WI/Pst I进行双酶切；两者的酶切产物连接获得重组质粒pHEP-Flury(dG-VP2)。

其中，优选地，步骤S21所述引物pDV2.F和pDV2.R的序列分别如SEQ ID NO.4和5所示。

优选地，步骤S21所述PCR扩增的反应条件：94℃2min；94℃30s，53.6℃30s，68℃2min，运行25个循环；68℃延伸10min。

另外，所述重组狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)在作为或制备狂犬病疫苗方面的应用，也在本发明的保护范围之内。

本发明首先以狂犬病病毒疫苗株HEP-Flury为骨架，以我国流行的犬细小病毒CPV-2a型的VP2蛋白作为二联疫苗的抗原蛋白，通过酶切连接，构建含有两个G基因和VP2基因(见SEQ ID NO.1)的重组狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)，构建策略如附图1所示。然后对成功拯救的重组狂犬病病毒进行PCR、测序、免疫荧光鉴定正确。本发明还对重组病毒进行生长曲线、致病性、免疫原性和攻毒保护力等生物学特性研究，以评估其作为二联疫苗的效果。结果显示，重组狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)作为重组二联疫苗致病性较低，不会对成鼠致死，在BSR细胞上的滴度比亲本株HEP-Flury高，重组二联疫苗具有良好的免疫原性，能诱导机体产生具有保护效力的狂犬病中和抗体和CPV中和抗体。

具体研究方法方面，本发明利用分子生物学手段构建携带双G和VP2基因的具有感染性的全长狂犬病毒cDNA，通过细胞生物技术拯救出携带双G且表达犬细小病毒VP2蛋白的重组狂犬病毒，利用免疫学相关技术，研究重组二联疫苗的免疫原性。利用分子生物学手段，以狂犬病疫苗候选株HEP-Flury为骨架，将国内目前流行的CPV-2a毒株的VP2基因以及额外一个狂犬病毒的G基因插入HEP-Flury；通过拯救获得携带两个G且表达VP2蛋白的重组狂犬病毒株，并在体外培养细胞以及小鼠体内进行了重组狂犬病毒株作为二联基因工程疫苗的效果评估。

本发明对携带双G和VP2的重组狂犬病病毒进行鉴定和在BHK-21细胞上面传代及RT-PCR鉴定。经免疫荧光试验证实，重组病毒N蛋白和CPV VP2蛋白在嵌合病毒感染细胞中均成功表达。通过Western-blot鉴定重组病毒的G蛋白和VP2蛋白均得到表达。将rHEP-Flury(dG-VP2)在BHK-21细胞中连续传代20次，通过RT-PCR方法可检测到rHEP-Flury(dG-VP2)存在双G基因和VP2基因，进行序列测定，没有发现任何突变。

本发明对rHEP-Flury(dG-VP2)重组病毒在BSR上的体外生长曲线进行了研究。病毒的一步生长曲线表明rHEP-Flury(dG-VP2)与亲本株HEP-Flury相比较生长特性基本一致，并且rHEP-Flury(dG-VP2)在第4天的滴度均高于亲本株。

本发明对rHEP-Flury(dG-VP2)重组病毒免疫原性和攻毒保护进行了研究。将rHEP-Flury(dG-VP2)与亲本株HEP-Flury分别制备成弱毒疫苗和灭活+佐剂疫苗，肌肉注射免疫小鼠，21天后采血分离血清，检测抗狂犬病病毒抗体与抗犬细小病毒抗体。结果表明，重组狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)免疫小鼠后均能诱导产生较高的抗狂犬病病毒抗体与抗犬细小病毒VP2抗体水平，用狂犬病标准攻毒毒株CVS-11进行攻毒保护试验小鼠可获得80％以上的存活率。

本发明具有以下有益效果：

本发明科学构建了表达双G和犬细小病毒VP2蛋白的重组狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)。重组狂犬病病毒相比亲本株HEP-Flury具有较高的病毒滴度，可以降低犬用疫苗的成本。

本发明同时验证出重组病毒均能在小鼠体内产生狂犬病病毒和犬细小病毒达到保护水平的抗体，可以作为狂犬病和犬细小病的二联疫苗候选株。

本发明的疫苗效果研究显示，重组狂犬病毒作为弱毒疫苗和灭活疫苗均能产生具有保护水平的狂犬病病毒和犬细小病毒抗体。

附图说明

图1为构建重组狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)的基因重组策略。

图2为pHEP-Flury(VP2)质粒的构建示意图。

图3为VP2基因扩增电泳图；M：DNA MarkerⅢ，1～2：VP2基因PCR扩增产物，3：阴性对照。

图4为pHEP-Flury(VP2)质粒酶切鉴定电泳图；M:DL15000，1:pHEP-Flury(VP2)质粒，2:pHEP-3.0质粒。

图5为pHEP-Flury(dG-VP2)质粒的构建示意图。

图6为G-VP2S片段PCR扩增电泳图；M：500bp leader，1-2：G-VP2S PCR产物，3：阴性对照。

图7为携带双G和VP2基因的重组质粒pHEP-Flury(dG-VP2)双酶切鉴定图；M：DL15000，1：pHEP-Flury(dG-VP2)酶切，2：pHEP-Flury(VP2)酶切对照。

图8为携带双G和VP2基因的重组病毒rHEP-Flury(dG-VP2)拯救后免疫荧光鉴定结果；A：抗N蛋白的荧光抗体染色，B：细胞对照，C：抗CPV多抗的荧光抗体染色，D：细胞对照。

图9为RT-PCR检测重组病毒rHEP-Flury(dG-VP2)的N、双G和VP2基因电泳图；A：424bp的N基因片段，B：744bp的双G基因片段，C：822bp的G/VP2基因片段，D：794bp的G/VP2基因片段，M：Marker DL2000，1：HEP-Flury对照，2：pHEP-Flury(VP2)对照，3：rHEP-Flury(dG-VP2)对照，4：rHEP-dG。

图10为携带双G和VP2基因的重组病毒rHEP-Flury(dG-VP2)及亲本株HEP-Flury在BSR上的生长曲线。

图11为携带双G和VP2基因的重组病毒rHEP-Flury(dG-VP2)在KM小鼠体内的狂犬病抗体水平，同时设立亲本株HEP-Flury及Mock对照组。

图12为携带双G和VP2基因的重组病毒rHEP-Flury(dG-VP2)在KM小鼠体内的犬细小病毒抗体水平，同时设立亲本株HEP-Flury及Mock对照组。

图13为携带双G和VP2基因的重组病毒rHEP-Flury(dG-VP2)作为弱毒疫苗及灭活疫苗免疫小鼠21天后狂犬病毒攻毒保护率。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 CPV流行毒株筛选

1、对临床采集的疑似CPV的样品进行处理和核酸提取，进行PCR扩增。

(1)引物序列见表1

CPV的检测引物CPV1/CPV2参考刘忠华等(2003)的文献。通过比较GenBank中发表的登录号为M74849VP2基因序列，用Primer Premier 5.0(PREMIER Biosoft International)软件设计两对引物VP2.F/VP2-1.R，VP2-2.F/VP2.R。

表1

(2)利用引物CPV1/CPV2，按表2所示体系进行PCR扩增：

表2

(3)取利用引物CPV1/CPV2进行PCR检测阳性的样品，分别利用引物VP2.F/VP2-1.R，VP2-2.F/VP2.R进行PCR扩增，体系如表3所示。

表3

(4)参照Omega公司的凝胶回收试剂盒(E.Z.N.A.Gel Extraction KitI)使用说明书对PCR产物进行切胶回收、纯化，与克隆载体pTA2进行连接。

连接反应体系如表4所示：

表4

(5)连接产物转化DH5α感受态细胞，抽提重组质粒，酶切鉴定正确。将质粒送测序，结果得到VP2序列如SEQ ID NO.1。

从GenBank下载其他犬细小病毒VP2基因的序列，使用ClustalX软件和MEGA4.0软件对序列进行比对分析，选择当前流行的CPV毒株。

实施例2 CPV毒株VP2基因克隆至HEP-Flury

1、构建重组质粒pHEP-Flury(VP2)，策略见图2所示。

(1)利用引物VP2.F/VP2.R(见表1)扩增实施例1中选择的CPV毒株的VP2基因(序列如SEQ ID NO.1所示)，VP2.F和VP2.R引物预计扩增长度为1755bp(扩增反应体系如表5所示)，分别引入Bsi WI和Nhe I酶切位点。

表5

在PCR管中依次加入上述试剂。

PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，52℃30s，68℃2min，运行25个循环；最后于68℃延伸10min。

(2)反应结束后，取5μL PCR产物于1.0％琼脂糖凝胶进行电泳检测。获得一条特异的DNA电泳带，大小约为1755bp，与试验预期相符，见图3所示。

(3)将PCR扩增的VP2基因进行切胶回收、纯化，将纯化的VP2基因和pHEP-3.0质粒(携带HEP-Flury毒株全长cDNA的重组质粒)用Nhe I和Bsi WI核酸限制性内切酶进行处理，酶切体系如表6所示：

表6

上述体系混匀后，先37℃孵育3h，用凝胶回收试剂盒进行回收。将回收产物连接，连接体系如表7所示：

表7

上述体系混匀后，至于连接仪中，22℃连接24h，连接产物转化XL10-Gold感受态细胞，筛选阳性克隆，抽提重组质粒，用BsiWI/NheI进行酶切鉴定，酶切体系如表8所示：

表8

混匀，37℃水浴2h。

电泳检测酶切结果正确，见图4。

以pHEP-3.0质粒做为对照。经质粒抽提和酶切鉴定正确的质粒送上海英骏生物工程有限公司进行序列测定。以G-L1和G-L2为测序引物从正反两个方向测序，测序正确的质粒命名为pHEP-Flury(VP2)。将酶切鉴定和测序均正确的克隆参照Qiagen公司质粒中量提取试剂盒说明书进行去内毒素中提pHEP-Flury(VP2)重组质粒，4℃保存待用。

实施例3利用重组质粒pHEP-Flury(VP2)构建重组质粒pHEP-Flury(dG-VP2)

1、利用实施例2中构建的重组质粒pHEP-Flury(VP2)构建pHEP-Flury(dG-VP2)，构建方案见图5。

(1)以pHEP-Flury(VP2)质粒为模板，利用上游引物pDV2.F(序列为5’-CGGGGTACCATGGTTCCTCAGGTTCT-3’)和下游引物pDV2.R(序列为：5’-GCCTGCAGTTTTATCCATATTATTC-3’)进行PCR扩增。

在上游引物pDV2.F中，划线部分的序列是Acc65I的酶切位点，与BsiWI互为同尾酶。Acc65I下面的序列为G基因的ORF框的起始密码子ATG。

下游引物在VP2基因ORF框的位置是281～305位，而PstI在VP2基因ORF框的位置是269～274位。

这对引物以pHEP-Flury(VP2)质粒为模板，扩增长度为2025bp。

PCR反应条件：94℃2min；94℃30s，53.6℃30s，68℃2min，运行25个循环；68℃延伸10min。

反应结束后，-20℃保存或直接取5μL PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL EB)进行电泳检测，大小正确，见图6，产物命名为G-VP2S。

(2)产物G-VP2S和pHEP-Flury(VP2)质粒分别用Acc65I/Pst I和Bsi WI/Pst I进行双酶切，将酶切产物连接，转化XL10-gold感受态细胞，筛选阳性克隆。

以小量碱裂解法抽提质粒，然后以pHEP-Flury(VP2)作为对照，用AflⅡ/PstI进行双酶切，按理论值计算，pHEP-Flury(VP2)质粒酶切为16506bp和1935bp，pHEP-Flury(dG-VP2)质粒酶切为16506bp和3581bp，结果正确，见图7。

(3)将酶切正确的质粒送上海英骏生物工程有限公司进行序列测定，正确，质粒命名为pHEP-Flury(dG-VP2)。

将酶切鉴定和测序均正确的克隆参照Qiagen公司质粒中量提取试剂盒说明书进行去内毒素中提重组质粒pHEP-Flury(dG-VP2)。待拯救用。

实施例4利用重组质粒pHEP-Flury(dG-VP2)进行重组病毒rHEP-Flury(dG-VP2)的拯救及筛选

1、转染和病毒筛选方法参照Inoue(2003)和郭霄峰等(2006)的方法进行。

转染：

(1)准备BHK-21细胞：12孔细胞培养板细胞密度为1×105个/孔，培养液中含10％胎牛血清；37℃培养12～16h，至细胞50％-60％汇合。转染时用800μL 1×PBS洗涤细胞一次。

(2)取1.25μg重组质粒pHEP-Flury(dG-VP2)，0.625μg pH-N，0.3125μg pH-P，0.125μg pH-L和0.1875μg pH-G混匀在1.5mL离心管中，添加灭菌去离子水至75μL，瞬时离心，使得管顶部的液滴进入溶液中。

其中，pH-N、pH-P、pH-L和pH-G为辅助质粒，用以辅助拯救重组病毒。

(3)添加7.5μL转染试剂，漩涡震荡器上震荡10s。

(4)室温静置15min，添加400μL含10％胎牛血清和双抗(100IU/mL)的DMEM于离心管中，上下颠倒管几次，混匀。

(5)混匀的溶解液加入细胞(12孔培养板中的一孔)，37℃培养2.5～3h，靠板壁轻轻吸去DMEM，用1×PBS洗涤细胞一次，重新添加DMEM(含10％胎牛血清和双抗)。在37℃5％CO₂培养箱中培养48h，细胞95％长满后转入34℃培养96h。

病毒筛选：

(1)用锡箔纸包住上述细胞板，-70℃反复冻融细胞3次，冷冻时间1h，室温溶解。取60μL上清液和60μL新鲜的BHK-21细胞(细胞密度为4×10⁵个/mL)混合于96孔板，其后在37℃培养48h，34℃培养96h。

(2)倾去细胞培养液，每孔加满80％预冷的丙酮，快速倾去丙酮，再次加满丙酮，锡箔纸包住培养板，置-20℃1h。弃去丙酮，轻微空干，每孔添加25μL抗狂犬病病毒N蛋白荧光抗体以及抗CPV荧光抗体，37℃孵育1h，弃去溶解液，用1×PBS洗涤细胞两次，每次5min，再用去离子水快速洗涤细胞一次。

自然干燥，荧光显微镜下观察，均可见大量绿色荧光斑点，见图8。

拯救获得的病毒命名为rHEP-Flury(dG-VP2)。

实施例5重组病毒rHEP-Flury(dG-VP2)的传代和鉴定

1、将-80℃保存的狂犬病病毒与rHEP-Flury(dG-VP2)取出，检测病毒滴度，低于10⁵FFU/mL的病毒使用同单层细胞接种培养法进行传代。在六孔细胞培养皿中新鲜消化的BSR细胞约2×10⁵个/mL，按病毒液:培养液总体积＝1:10进行接毒。细胞在37℃CO₂培养箱中培养约48h，待细胞长满后再放入34℃CO₂培养箱中培养约96h。在-80℃/室温冻融细胞1次，收获病毒，分装-80℃保存备用。依次传代至第20次，检测病毒滴度并进行RT-PCR鉴定和VP2蛋白、G蛋白表达检测。

RT-PCR检测包括N基因检测、双G检测、VP2基因检测，检测引物见表9。检测设HEP-Flury、rHEP-dG(携带双G的重组狂犬病毒)和质粒pHEP-Flury(VP2)对照。

表9

2、检测结果均正确，如图9所示。表明本发明的重组病毒rHEP-Flury(dG-VP2)可以稳定传代。

实施例6重组病毒rHEP-Flury(dG-VP2)在BSR细胞上的体外生长曲线研究

1、用细胞营养液调整BSR细胞密度为2×10⁵/mL，将狂犬病毒HEP-Flury株和rHEP-Flury(dG-VP2)株病毒浓度调整为MOI(multiplicity of infection)0.1，于5％CO₂ 37℃培养箱中培养，当细胞完全汇合时转移至34℃，共培养96h；每隔24h收集100μL上清培养液并进行直接免疫荧光抗体检测，测定不同时间的病毒滴度，绘制成生长曲线。

2、结果显示，重组病毒滴度比亲本株滴度高，见图10。

实施例7重组病毒rHEP-Flury(dG-VP2)在KM小鼠体内的免疫原性及攻毒保护研究

1、狂犬病病毒的灭活和灭活疫苗的制备：

(1)将HEP-Flury和rHEP-Flury(dG-VP2)病毒滴度稀释为1×10⁷FFU/mL，按1:4000的比例加入β-丙内脂，4℃放置24h，再置于37℃水解2h。将灭活后的病毒液、未灭活的狂犬病毒液分别与BSR细胞共同培养在96孔细胞培养板上，37℃，5％CO₂培养箱内培养4d后，进行固定和荧光染色，在荧光显微镜下观察各组有无荧光点及细胞状态。结果灭活病毒无荧光斑点，未灭活病毒均有绿色荧光斑点。

(2)参照法国赛比克公司ESSAL GEL佐剂说明书推荐的方法进行灭活疫苗的制备：在超净工作台内将ESSAL GEL佐剂和已检测合格的灭活狂犬病毒液按照佐剂在总重量的比例(w/w)为10％混合。在磁力搅拌器上以300r/min的速度搅拌10min，然后将配好的疫苗分装于灭菌的玻璃瓶内，加盖密封，置于4℃保存备用。6～8周龄的清洁级昆明系雌性小鼠分为7组，即HEP-Flury弱毒组、rHEP-Flury(dG-VP2)弱毒组、HEP-Flury灭活+佐剂组、rHEP-Flury(dG-VP2)灭活+佐剂组和空白对照组，免疫组每组25只，空白对照组10只。免疫组每只小鼠肌注100μL疫苗(注射剂量约为10⁶FFU/只)，空白对照组肌注100μL DMEM。

于免疫后21d尾静脉采血制备血清，采用ELISA(法国SYNOBIOTICS公司)进行狂犬病病毒抗体检测和犬细小病毒HI抗体检测。

2、结果显示，重组病毒均能产生相当于亲本株的狂犬病抗体，且均大于0.6EU/mL，被认为是具有抗狂犬病病毒保护力的，见图11。

重组病毒能产生大于1:80的犬细小病毒HI抗体水平，见图12，根据中华人民共和国国家标准GB/T 14926.57-2001，HI检测抗体效价≥1:80判为合格。

3、为了验证小鼠获得高水平免疫力后是否具有对强毒攻击的保护，在免疫后第22d对小鼠颅内接种50LD₅₀的CVS-11 30μL，连续21d观察小鼠的发病及死亡情况。

结果显示，免疫HEP-Flury弱毒苗的小鼠全部存活，免疫rHEP-Flury(dG-VP2)灭活苗+佐剂的小鼠保护率为91.7％，rHEP-Flury(dG-VP2)弱毒苗的小鼠保护率为90.5％，免疫HEP-Flury灭活苗+佐剂的小鼠保护率88％，在攻毒后第17d至第21d，小鼠不再出现发病及死亡，即保护率呈现稳定。

上述结果表明，rHEP-Flury(dG-VP2)制成的弱毒疫苗和灭活+佐剂疫苗在攻毒试验中均符合国际要求的免疫犬攻毒保护率80％以上的标准，见图13。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种携带两个G基因和VP2基因的重组狂犬病病毒及其应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1755

<212> DNA

<213> CPV-2a亚型毒株的VP2基因序列

<400> 1

atgagtgatg gagcagttca accagacggt ggtcaacctg ctgtcagaaa tgaaagagct 60

acaggatctg ggaacgggtc tggaggcggg ggtggtggtg gttctggggg tgtggggatt 120

tctacgggta ctttcaataa tcagacggaa tttaaatttt tggaaaacgg atgggtggaa 180

atcacagcaa actcaagcag acttgtacat ttaaatatgc cagaaagtga aaattatagt 240

agagtggttg taaataattt ggataaaact gcagttaacg gaaacatggc tttagatgat 300

acccatgcac aaattgtaac accttggtca ttggttgatg caaatgcttg gggagtttgg 360

tttaatccag gagattggca actaattgtt aatactatga gtgagttgca tttagttagt 420

tttgaacaag aaatttttaa tgttgtttta aagactgttt cagaatctgc tactcagcca 480

ccaactaaag tttataataa tgatttaact gcatcattga tggttgcatt agatagtaat 540

aatactatgc catttactcc agcagctatg agatctgaga cattgggttt ttatccatgg 600

aaaccaacca taccaactcc atggagatat tattttcaat gggatagaac attaatacca 660

tctcatactg gaactagtgg cacaccaaca aatatatacc atggtacaga tccagatgat 720

gttcaatttt acactattga aaattctgtg ccagtacact tactaagaac aggtgatgaa 780

tttgctacag gaacatttta ttttgattgt aaaccatgta gactaacaca tacatggcaa 840

acaaatagag cattgggctt accaccattt ctaaattctt tgcctcaagc tgaaggaggt 900

actaactttg gttatatagg agttcaacaa gataaaagac gtggtgtaac tcaaatggga 960

aatacaaact atattactga agctactatt atgagaccag ctgaggttgg ttatagtgca 1020

ccatattatt cttttgaggc gtctacacaa gggccattta aaacacctat tgcagcagga 1080

cgggggggag cgcaaacaga tgaaaatcaa gcagcagatg gtgatccaag atatgcattt 1140

ggtagacaac atggtcaaaa aactaccaca acaggagaaa cacctgagag atttacatat 1200

atagcacatc aagatacagg aagatatcca gaaggagatt ggattcaaaa tattaacttt 1260

aaccttcctg taacagatga taatgtattg ctaccaacag atccaattgg aggtaaaaca 1320

ggaattaact atactaatat atttaatact tatggtcctt taactgcatt aaataatgta 1380

ccaccagttt atccaaatgg tcaaatttgg gataaagaat ttgatactga cttaaaacca 1440

agacttcatg taaatgcacc atttgtttgt caaaataatt gtcctggtca attatttgta 1500

aaagttgcac ctaatttaac aaatgaatat gatcctgatg catctgctaa tatgtcaaga 1560

attgtaactt actcagattt ttggtggaaa ggtaaattag tatttaaagc taaactaaga 1620

gcctctcata cttggaatcc aattcaacaa atgagtatca atgtagataa ccaatttaac 1680

tatgtaccaa gtaatattgg aggtatgaaa attgtatatg agaaatctca actagcacct 1740

agaaaattat attaa 1755

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物VP2.F

<400> 2

agtcgtacga tgagtgatgg agcagt 26

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物VP2.R

<400> 3

ccctgctagc ttaatataat tttct 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物pDV2.F

<400> 4

cggggtacca tggttcctca ggttct 26

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物pDV2.R

<400> 5

gcctgcagtt ttatccatat tattc 25