一种检测多发性骨软骨瘤致病基因的DNA文库及其应用的制作方法

本发明涉及一种通过靶向高通量半导体测序技术检测诊断多发性骨软骨瘤致病基因的DNA文库及其应用。具体说是根据多发性骨软骨瘤致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻区域的超多重PCR引物，并对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，明确多发性骨软骨瘤的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据，属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术。
背景技术：
：多发性骨软骨瘤(Multipleosteochondromas，MO)又名多发性外生骨疣，是一种骨胳发育异常，其特征是在骨胳上可形成数目不一，大小不等的骨隆起。该病病变严重时亦称为骨干续连症，主要是指疾病导致整个患骨的塑型发生异常，甚至可以令所有软骨内化骨的骨胳均发生不同程度的异常。该病的发病通常呈双侧对称性，好发于股骨、胫骨、腓骨、肱骨、肩胛骨、髂骨及肋骨，通常在出生时即可发生，直到青春期之后才结束生长。该病的合并症包括：骨骼畸形、骨折、血管及神经损伤及恶变为骨肉瘤(发生率约为5％)，患者经常需要进行手术治疗。目前，国际上认为多发性骨软骨瘤为常染色体显性遗传性疾病，大多数病员有家族遗传史。患者有一半的概率将疾病遗传给下一代，给家庭和社会带来巨大的精神压力和经济负担。临床上除了手术缓解症状，尚没有有效的针对性治疗办法。然而，如果对患者进行基因诊断，查明致病突变，并在患者准备生育时进行产前咨询和产前诊断，则可以有效避免致病突变的传递，让患者得到正常的后代。因此，全面、快速、准确地筛查致病基因是多发性骨软骨瘤精确诊断和防治的重要前提条件。但是，传统的基于Sanger测序的基因检测方法存在通量低价格贵，操作复杂的弊端，一次反应只能检测一个扩增区域，无法满足多致病基因疾病和多样本同时检测的时效性的要求。因此，有必要寻求一种新的检测多发性骨软骨瘤致病基因突变的方法，提高诊断准确率，降低成本和劳动强度并提高时效性。技术实现要素：为实现上述目的，本发明提供一种多发性骨软骨瘤的致病基因的DNA文库，其中，所述文库包括序号为1-8的至少一个基因。表1：多发性骨软骨瘤致病基因1序号基因名OMIM编号1COL2A11201402CTTNBP2NL6151003EXTL16017384EXTL26024115IDH11477006IDH21476507PTPN111768768SDC2142460表2：多发性骨软骨瘤致病基因2序号基因名OMIM编号9EXT160817710EXT260821011EXTL360574412FGFR313493413GRPR30567014PTH1R16846815PTHLH168470优选的，所述DNA文库包括序号为1-8的基因优选的，所述DNA文库还包括序号为9-15的至少一个基因。更优选的，所述DNA文库包括序号为1-15的基因。本发明还提供一种上述DNA文库的检测试剂。优选的，所述检测试剂是能扩增上述DNA文库的引物更优选的，所述引物为，根据上述DNA文库，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻调控区域的适用于超多重PCR的引物池，从而能对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增。优选的，所述毗邻调控区域为每个外显子边缘至少5bp区域。优选的，所述引物池通过软件进行超多重PCR扩增设计，使得每一个反应管中一次扩增即可同步平行扩增数千个扩增子，从而对目标区域进行操作简便的高效率扩增。本发明还提供一种上述DNA文库或者上述DNA文库的检测试剂在制备诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒用于诊断多发性骨软骨瘤。本发明还提供一种上述DNA文库或者上述DNA文库的检测试剂在制备诊断装置中的应用，所述诊断装置用于诊断多发性骨软骨瘤。优选的，所述诊断装置是基因芯片。优选的，所述检测试剂是能扩增上述DNA文库的引物。更优选的，所述引物为，根据上述DNA文库，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻调控区域的适用于超多重PCR的引物池，从而能对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增。优选的，所述毗邻调控区域为每个外显子边缘至少5bp区域。优选的，所述引物池通过软件进行超多重PCR扩增设计，使得每一个反应管中一次扩增即可同步平行扩增数千个扩增子，从而对目标区域进行操作简便的高效率扩增。更优选的，所述应用包括下列步骤：(1)提供受试者样本的基因组DNA；(2)从IonTorrentTM高通量测序平台自动合成覆盖上述致病基因的扩增引物池，对目标区域进行超多重PCR扩增；(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；(4)对步骤(3)得到的酶切产物加Barcode接头,所述Barcode接头来自于高通量测序建库试剂盒；(5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；(6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增,该通用引物来自于高通量测序建库试剂盒；(7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区域扩增文库；(8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接于ISP珠子，得到反应液；(9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上IonTorrentTM高通量测序仪进行测序；(10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关的突变位点；(11)对步骤(10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。优选的，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。更优选的，所述应用进一步用于指导选择性生育，例如：通过该方法明确了多发性骨软骨瘤患者的致病突变，在患者孕早期知情同意前提下进行绒毛穿刺或羊水穿刺取得胎儿相关DNA样本，并进行检测，以确定胎儿是否携带该致病基因，继而决定是否继续妊娠，从而阻止致病突变传递给下一代。本发明还提供一种诊断试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述多发性骨软骨瘤的致病基因的DNA文库或者上述DNA文库的检测试剂。本发明还提供一种诊断装置，其中，所述装置包括上述多发性骨软骨瘤的致病基因的DNA文库或者上述DNA文库的检测试剂。优选的，所述装置为基因芯片。优选的，所述检测试剂是能扩增上述DNA文库的引物。更优选的，所述引物为，根据上述DNA文库，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻调控区域的适用于超多重PCR的引物池，从而能对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增。优选的，所述毗邻调控区域为每个外显子边缘至少5bp区域。优选的，所述引物池通过软件进行超多重PCR扩增设计，使得每一个反应管中一次扩增即可同步平行扩增数千个扩增子，从而对目标区域进行操作简便的高效率扩增。本发明提供一种使用上述DNA文库、DNA文库的检测试剂、诊断试剂盒或诊断装置对患者进行检测的方法，所述方法包括下列步骤：(1)提供受试者样本的基因组DNA；(2)从IonTorrentTM高通量测序平台自动合成上述致病基因的扩增引物池，对目标区域进行超多重PCR扩增；(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；(4)对步骤(3)得到的酶切产物加Barcode接头,所述Barcode接头来自于高通量测序建库试剂盒；(5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；(6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增,该通用引物来自于高通量测序建库试剂盒；(7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区域扩增文库；(8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接于ISP珠子，得到反应液；(9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上IonTorrentTM高通量测序仪进行测序；(10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关的突变位点；(11)对步骤(10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。(12)受试者样本中若存在上述致病基因的突变体，则受试者可以诊断为多发性骨软骨瘤。优选的，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。更优选的，所述方法进一步用于指导选择性生育，例如：通过该方法明确了多发性骨软骨瘤患者的致病突变，在患者孕早期知情同意前提下进行绒毛穿刺或羊水穿刺取得胎儿相关DNA样本，并进行检测，以确定胎儿是否携带该致病基因，继而决定是否继续妊娠，从而阻止致病突变传递给下一代。采用本发明的DNA文库对多发性骨软骨瘤患者进行基因诊断有着以下重要意义和效果：1.本申请的DNA文库是申请人从众多的多发性骨软骨瘤致病基因中选择的15个基因，这些基因尤其适合包括中国人在内的黄色人种患者的检测；目前国际上缺乏大规模的中国黄色人种多发性骨软骨瘤基因诊断相关信息，绝大多数已知多发性骨软骨瘤致病基因都主要来自欧美人群的报道，它们对中国人的致病性及特点目前没有详细报道。发明者进行了长期的临床观察和大规模中国黄色人种多发性骨软骨瘤的基因诊断研究，总结和发掘了一系列中国黄色人种多发性骨软骨瘤患者的致病基因，并对国际上已经报道的致病基因在中国患者中的发病频率以及致病性进行了观察和验证。本发明所选的15个基因中的绝大多数基因均为发明人在黄色人种人群中验证和发现的致病基因。2.本发明中采用基于IonTorrentTM高通量测序技术对目标区域的扩增产物进行检测，能够在一次测序反应中同时检测本发明中涉及的15个相关致病基因的全部外显子及毗邻区域，并且能根据不同芯片数据量的大小，调整检测样本数量，在保证平均测序深度500×的前提下，检测1到96人不等的样本数量，整个测序反应和数据分析判读能在两天之内完成，大大降低了扩增反应的成本和劳动强度，提高了时效性，同时，该检测区域具有覆盖度广，整体覆盖度达到99.5％；。通过对目标扩增区域的测序和数据判读，能够准确识别与疾病相关的突变，判断疾病种类和病因，为临床提供及时可靠的检测报告。本发明设计的检测方法经过Sanger测序法验证，对二代测序深度达到100×的点突变，本方法的准确度达到100％；3.基因诊断有助于产前诊断和新生儿筛查等。因多发性骨软骨瘤患者未来面临一系列严重并发症，并且尚无有效的根治方法，给患者家庭及社会带来沉重的医疗负担。患者家人非常关注患者后代的健康。多发性骨软骨瘤为常染色显性遗传病，患者后代有50％的发病可能性。患者致病基因突变的确诊，可以为孕育健康的下一代提供明确的遗传咨询服务。4.更优选的，本发明提供全面覆盖多发性骨软骨瘤已知病因，包含15个致病相关致病基因的DNA文库。这15个基因选择基于基于国际已报道和公认的临床致病基因数据库(OMIM数据库、HGMD数据库、ClinVar数据库)以及发明者自己的课题研究内容。这15个基因上的致病突变既可以单独致病，也可以相互联合致病导致更加严重和复杂的临床表型，本发明首次做到可以一次性全面的对它们进行测序,是目前已知针对多发性骨软骨瘤致病基因覆盖最全面的一种靶向测序检测。综合来看，本发明中涉及的DNA文库、DNA文库的检测试剂及其应用具有准确、灵活、快速、低成本的特点；经过临床评估，该发明对多发性骨软骨瘤具有很好的辅助诊断价值。附图说明图1一次IonTorrentTM高通量测序反应的数据采集概要图图2一次对15个基因的目标区域进行测序，不同标本得到的数据量信息图3经过原始数据分析后，得到的不同标本的突变碱基数量图4Sanger测序法对本发明检测方法得到的突变位点进行验证具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。实施例11.该方法中所用到的试剂：IonAmpliSeqTMLibraryKit2.0，IonPGMTMTemplateOT2200Kitv3，IonSequencing200Kitv2，IonXpressBarcodeAdaptors1-16Kit，Ion318TMChipKitv22.标本采集和保存(1)标本采集：标本为患者外周血。血液为常规取静脉血5ml，EDTA抗凝处理。(2)保存：可立即检测，4℃保存一周，超过一周-80℃保存。3.检测步骤和结果分析：(1)标本基因组DNA的提取：标本DNA的提取按照天根生化科技(北京)有限公司的血液DNA提取试剂盒操作说明进行。(2)目标检测区域的超多重PCR扩增及建库：以本发明中涉及的15个基因全外显子为检测区域，基于IonAmpliSeqTMDesigner自动合成超多重PCR引物，对标本DNA的目标区域进行扩增及建库，具体实施如下:a.目标区域的扩增：反应条件：b.扩增产物二合一，酶切：反应条件：c.连接接头：反应条件：22℃30min72℃10min10℃Upto1hd.纯化及纯化产物的二次扩增：纯化步骤按照IonAmpliseqLibraryPreparation操作手册进行，最终产物溶解于52μl反应体系，该反应体系组成为：反应条件：e.片段选择：片段选择步骤按照IonAmpliseqLibraryPreparation操作手册进行，得到的最终建库产物用Qubit2.0Fluorometer定量后即建库完成。(3)高通量测序：测序及前期准备步骤按照IonPGMTMTemplateOT2200Kitv3及IonSequencing200Kitv2操作手册进行：a.油包水PCR反应：将上述反应体系加入IonOneTouch2中进行油包水PCR反应。b.油包水PCR反应完成后，连接有测序模板的IonPGMTemplateOT2200IonSphereParticles经过IonOnetouchES纯化，加入测序引物及DNA聚合酶：室温5min后，将得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上IonTorrentTM高通量测序仪进行测序。(4)数据分析：测序数据经过coverageanalysis和variantcaller分析，得到碱基序列和突变位点，突变位点经过IonReporter在线注释后，得到对遗传性心肌病诊断有意义的突变位点。(5)Sange法验证：对于得到的突变位点，采用Sanger测序法进行验证。结果说明及分析通过本发明中涉及的高通量测序技术一次性对3个标本的目标区域进行检测(如图1)，得到的总数据量为797M(TotalBase)，能够总共得到5,214,030的片段读长数据(TotalReads)，每个片段的中位读长为140bp。3个标本平均能够被测到571,129(510,003-634,564)个片段读长Reads(如图2)，以上测序结果为下一步的序列分析提供了充足的数据量。测序结果经过variantCaller分析，每个标本平均有55个变异(Variants)被读出(如图3)。检测区域的变异通过IonReporter在线注释后，与疾病相关的突变位点经过Sanger测序法验证(如图4)，如图4所例举的那样，图4箭头所指处显示EXT1基因c.79C>T(p.Gln27Ter)杂合无义突变,最终明确患者的遗传缺陷类型，为临床提供诊断依据。同时该基因遗传模式是常染色体显性遗传，患者的同胞兄弟姐妹及其子女有50％的概率与患者一样携带了该致病突变，也面临发病风险，应进行该致病位点的筛查，为未来选择性生育及产前诊断提供依据。本发明的临床应用例证利用本发明所提供的方法，对50名患有多发性骨软骨瘤但病因不明确的患者进行了基因检测。共发现致病突变的患者48例。该方法对多发性骨软骨瘤检出的总阳性率达到96％，结合临床表现，影像学检查，及医生最终诊断结果，本方法的假阳性率为0，即所有经本方法确认的携带致病突变患者均符合相关遗传疾病的临床特征，并能够给予明确的临床诊断。本发明涉及的检测方法是利用高通量测序技术为突变快速筛选工具，以Sanger测序法为最终确定突变的金标准，因此具有快速，准确的特征。以高通量测序平均深度100×为例，所覆盖的94.99％的目标区域都能够被测序，且筛选得到的点突变能够被Sanger测序法验证，因此对以上区域检测的准确度为100％。根据50名受测患者的临床诊疗结果分析，受测患者未出现假阴性率。基于本发明涉及的检测方法给出的诊断报告得到临床医生的认可和采纳。本发明涉及的检测方法具有准确，快速，低成本的特点，对多发性骨软骨瘤的诊断有着重要意义和实用价值。50例患者中，在2例患者中发现了复合突变，该两例患者临床表型和发病年龄均有所加重。因此，我们需要对患者进行全面的致病基因扫描，以更精准地对其致病原因进行分析，从而为今后的临床治疗和遗传咨询打下基础。实施例2：本发明中引物池里包含发明者新发现的多发性骨软骨瘤致病基因8个。如上述表1所示。新发现的8个多发性骨软骨瘤致病基因来自于发明者多年来的研究积累和家系调查。发明者首先在已知的多发性骨软骨瘤致病基因中通过KEGG信号通路检索，同源基因库，寻找已知致病基因的同源基因及相同致病通路上的关键基因。然后在多年积累的中国黄色人种病人大样本量病例样本库中对候选的致病基因进行靶向高通量测序，并进行生物信息学分析，筛选和寻找致病突变。对筛选到致病突变的病例进行随访和进一步的家系分析，对患者的整个家族进行致病位点测序验证，计算致病突变的共分离系数。当发现候选基因的致病突变在两个及以上无关联的家系中完全共分离时，即可初步判断该候选致病基因为新的致病基因。本发明发现，上述8个基因的致病突变在两个及以上无关联的家系中均出现完全共分离。当前第1页1 2 3