本发明涉及基因调控
技术领域：
：，尤其涉及一种光控基因表达装置和高效调控肿瘤细胞表型的方法。
背景技术：
：：化学小分子调控的基因表达系统，目前已被广泛用于生物医药和生物技术研究[1,2]。然而化学分子由于易于自由扩散、不易去除等原因限制了其进一步应用，尤其是需要进行高精度时空调控的时候。光可以进行时空分辨率的高精度调控，因此是理想的基因表达诱导物[3-6]。因此，开发光诱导的基因表达装置是非常有必要的，并引起了广泛的关注[7]。毋庸置疑，用光来调控生物生产过程和生物医疗干预将是一件非常激动人心的进展。目前，光控基因表达装置主要有两大类：一类利用光诱导光敏蛋白二聚化从而将转录激活域招募到靶基因附近，从而激活基因表达[8,9]；另一类光诱导双杂交原理(如隐花色素cry-2及其培基cib1相互作用)将转录激活域招募到结合特定基因序列的蛋白(如zfn，tale等)附近从而激活特定基因的表达[10-13]。通常第一类装置的基因转录激活效率较高(>100倍)，因此目前已有首批相关生物医疗应用研究的报告，例如用来治疗糖尿病小鼠模型[9]。第二类装置目前研究较多，这是因为其可以靶向任何感兴趣的基因位点。最近已有基于crispr-cas9的光诱导基因转录系统的报道，极大便利了对任意基因的转录调控[11,13]。然而其基因转录激活效率仍然不高，限制其在生物医疗领域的应用。技术实现要素：为了克服低的转录调控效率的问题，本发明描述了一种高效的基于dcas9和光敏cry2-cib1相互作用的光控基因表达装置，并将之用于抑制膀胱癌细胞的增殖。因此，本发明提供一种光控基因表达装置以及高效调控肿瘤细胞表型的方法。根据本发明的第一方面，本发明提供一种光控基因表达装置，包括一基因锚定组件、一转录激活组件和一sgrna载体以及一报告/效应基因载体，其中上述基因锚定组件包括seqidno：4所示的cibn-dcas9-cibn表达序列，上述转录激活组件包括seqidno：7所示的cry2phr-p65表达序列，上述基因锚定组件的蛋白在上述sgrna的引导下与靶序列相结合，在蓝光照射下，cibn-dcas9-cibn与cry2phr-p65结合激活上述报告/效应基因表达。进一步地，上述光控基因表达装置在肿瘤细胞中工作。进一步地，上述肿瘤细胞是膀胱癌细胞。进一步地，上述靶序列如seqidno：1所示。进一步地，上述报告基因是mcherry基因，其序列如seqidno：8所示。进一步地，上述效应基因是效应基因p53。根据本发明的第二方面，本发明提供一种高效调控肿瘤细胞表型的方法，其特征在于，上述方法包括将一基因锚定组件和一转录激活组件导入一包含sgrna载体和一报告/效应基因载体的肿瘤细胞中，其中上述基因锚定组件包括seqidno：4所示的cibn-dcas9-cibn表达序列，上述转录激活组件包括seqidno：7所示的cry2phr-p65表达序列，上述基因锚定组件的蛋白在上述sgrna的引导下与靶序列相结合，在蓝光照射下，cibn-dcas9-cibn与cry2phr-p65结合激活上述报告/效应基因表达。进一步地，上述肿瘤细胞是膀胱癌细胞。本发明的光控基因表达装置，组合了cibn-dcas9-cibn和cry2phr-p65，该组合能够有效地驱动报告基因在膀胱癌细胞中表达，是文献报道的3倍。此外，进一步研究表明，随着光照时间的延长，报告基因的表达逐步提高。附图说明图1显示膀胱癌细胞中光控基因表达装置的优化。a)光控基因表达装置工作原理；b)不同组件组合下报告基因mrna的表达水平；每一个横坐标点的两个柱状图中左侧表示黑暗，右侧表示光照；c)最优组合下膀胱癌细胞报告基因的表达水平；每个坐标图的两条曲线中峰值位于左侧的表示黑暗，右侧的表示光照；d)最优组合下报告基因表达的时间曲线。图2显示光照调控报告基因和效应基因在膀胱癌细胞中表达。a)不同光照剂量下mcherry和p53mrna的表达；1s：30-120s代表每间隔30-120s光照1s；b)光诱导mcherry，p53蛋白的表达及下游p21mrna的变化。*，p<0.05；**，p<0.01。图3显示光控p53表达装置抑制膀胱癌细胞的增殖。cck-8实验检测光照下转染光控p53表达装置的5637(a)和umuc-3细胞(d)生长曲线；edu实验检测光照下转染光控p53表达装置的5637(b)和umuc-3细胞(e)的细胞增殖；不同处理下5637(c)和umuc-3细胞(f)相对edu阳性细胞水平。*，p<0.05。具体实施方式下面通过具体实施例结合附图对本发明作进一步详细说明。应当理解，实施例仅是示例性的，并不构成对本发明保护范围的限制。i.技术与方法1.质粒构建基因锚定组件(cibn-dcas9,dcas9-cibn,cibn-dcas9-cibn以及dcas9-trcib1)，转录激活组件(cry2-vp64fl和cry2phr-p65)，tet启动子靶向的sgrna(靶序列：ctccctatcagtgatagaga，seqidno：1)以及mcherry报告基因载体(tet-cherry)购自于addgene(http://www.addgene.org/)，见表1。将合成的野生型p53基因(genbankno:dq263704.1)，通过ecori和bglii双酶切替换tet-mcherry载体中的mcherry基因，构建tet-p53效应基因载体。表1addgene质粒2.细胞培养膀胱癌细胞系(5637和umuc-3)购自上海中科院生命科学院。5637细胞培养于rpmi-1640完全培养基(含10％fbs和1％双抗)；umuc-3细胞培养于dmem完全培养基(含10％fbs和1％双抗)中。培养箱的温度为37℃，二氧化碳含量为5％。3.细胞转染和光照转染前一天铺2-3×105细胞于12孔板中，生长24小时(细胞汇合度约60％-80％)根据lipo2000转染试剂说明书，每孔转染1μg质粒(包括基因锚定组件、转录激活组件、sgrna载体、报告/效应基因组件，比列为1:1:1:1，即每种组件0.25μg)。在50μl无血清培养基中加入1.5μllipofectamin2000(invitrogen,ca)试剂轻轻混匀，同时将上述混合质粒加入另一管50μl无血清培养基中。室温放置5min后，将质粒和lipo2000混匀，室温20分钟，将质粒/lipofectamin混合物加入12孔板内，轻柔摇晃24孔板。在黑暗中转染12h后，将细胞置于蓝光led灯下进行照射(波长460nm，平均光照强度0.84w/m2)0-72小时。led灯由计时器控制光照和黑暗间隔时间。4.荧光定量pcr分析收集不同光照条件下的细胞，用trizol(invitrogen)提取总rna，并用superscriptii反转录试剂盒(invitrogen)合成cdna。根据sybrgreenpremix(takara)试剂盒说明书，配置pcr反应体系，在abiprism7000fluorescentquantitativepcr(荧光定量pcr仪)上进行pcr扩增。反应条件为：变性95℃3分钟，40个循环(95℃30秒,60℃2分钟)后加溶解曲线，4℃保存。所用到的引物序列如下：gapdhf:tcatccctgcctctactg(seqidno：9)；gapdhr:tgcttcaccaccttcttg(seqidno：10)；mcherryf:ctgaagggcgagatcaagca(seqidno：11)；mcherryr:tagtcctcgttgtgggaggt(seqidno：12)；p53f:gaggttggctctgactgtacc(seqidno：13)；p53r:tccgtcccagtagattaccac(seqidno：14)；p21f:cgatggaacttcgactttgtca(seqidno：15)；p21r:gcacaagggtacaagacagtg(seqidno：16)。5.流式细胞分析将转染12小时后的细胞进行光照/黑暗24小时，0.25％胰酶消化并收集细胞，pbs洗涤2次后用200目尼龙膜过滤。利用facscantosorpdevice(bdbiosciences,usa)流式细胞仪分析报告基因的表达情况。6.westernblotting蛋白印记收集光照/黑暗处理48小时的细胞，用ripa缓冲液(碧云天)裂解细胞提取细胞总蛋白，并利用考马斯亮蓝法对蛋白进行定量。将等量蛋白进行sds-page电泳，电泳结束后进行转膜。用5％脱脂奶粉对转好的pvdf膜进行封闭，室温1小时。pbst洗涤三次后用一抗(p53抗体,cellsignalingtechnology,usa；mcherry抗体,abcam,uk；actin抗体,transgene,中国)4℃孵育过夜。pbst洗涤三次后用二抗(transgene,中国)室温孵育1小时后进行pierceeclwesterningblottingsubstrates(thermofisher,usa)底物显色并拍照chemidocxrssoftware(biorad,usa)。7.细胞生长分析利用cck-8实验研究光控p53表达装置对膀胱癌细胞生长的影响。将5×103细胞/孔铺入96孔板中，培养12h后按照上述方法等比例(100ng混合质粒/孔)转染12h。光照0，24，48，72小时后，用100μl含10％cck-8试剂(transgene，中国)的新鲜培养基继续培养1小时。用酶标仪(bio-rad，usa)读取450nm处的吸光值。利用cell-lighttmeduinvitroimagingkit(ribobio,中国)试剂盒研究光控p53表达装置对膀胱癌细胞增殖的影响。光照24小时后，每孔细胞加入含50μmedu的新鲜培养基，继续培养2小时后用4％多聚甲醛溶液室温固定20分钟；pbst洗涤3次后，加入1xapollo溶液，室温避光孵育30分钟；pbst洗涤3次后，加入1xdapi室温30分钟孵育染核，pbst洗涤3次后荧光显微镜下拍照。8.统计分析用spss19.0软件进行统计分析，单因素方差分析用于比较不同组平均值的显著差异情况(p<0.05表示具有统计学意义)。ii.实验结果1.光控基因表达装置的组件优化本发明的光控基因表达装置主要包括基因锚定组件(cibn-dcas9、dcas9-cibn、cibn-dcas9-cibn以及dcas9-trcib1融合蛋白)，转录激活组件(cry2-ad融合蛋白)，sgrna载体和报告/效应基因载体(图1a)。在黑暗的情况下，基因锚定组件在sgrna的引导下与靶序列相结合(基因启动子序列)，同时转录激活组件自由分散在细胞核中；当蓝光照射的时候，cry2和cibn相互结合，将转录激活域招募到靶序列(启动子)附近进而激活下游基因的表达。为了筛选最优的转录组件，我们比较了不同转录激活组件组合对报告基因表达的影响。研究结果表明增加dcas9融合cibn的数量(n-和c-端)比仅有一个融合cibn(n-或c-端)转录激活效果要好(图1b)；同时在5637中p65转录激活效率要显著高于vp64(～10倍)；因此我们筛选出优化后的组合即cibn-dcas9-cibn和cry2phr-p65。该组合能够有效的驱动报告基因在膀胱癌细胞5637和umuc-3的表达(图1c)，是文献报道的3倍[11]。此外我们进一步研究表明，随着光照时间的延长，报告基因的表达逐步提高(图1d)。2.光照诱导报告基因和效应基因在膀胱癌细胞中的表达对该装置进一步特征研究表明，该装置不仅能驱动报告基因在膀胱癌细胞中表达，而且能驱动效应基因p53在膀胱癌细胞中表达，同时随着光照剂量的增多，报告基因和效应基因的表达显著提高(图2a)。我们不仅能检测到mrna表达，通过westernblotting我们也检测到相应蛋白的变化；光照能够明显增加p53蛋白在膀胱癌细胞中的表达(图2b)，同时能上调其下游p21基因的，这意味着光诱导的p53能够发挥相应的功能。3.光控p53表达装置抑制膀胱癌细胞增殖我们利用cck-8实验研究光控p53表达对膀胱癌细胞生长的影响，结果表明72小时的光照过程中，光诱导p53表达能够显著抑制膀胱癌细胞5637和umuc-3的生长(图3a，3d)；进一步通过edu实验(图3b，3e)发现，光诱导p53表达能够显著抑制5637和umuc-3的增殖(图3c，3f；抑制率分别为～22％和～29％)。这些结果表明我们的光控基因表达装置能够抑制膀胱癌细胞的增殖，有望成为一种新的治疗方法。以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
：的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。参考文献1.gossenm,freundliebs,benderg,mullerg,hillenw,bujardh.transcriptionalactivationbytetracyclinesinmammaliancells.science.1995；268:1766-9.2.tiggesm,fusseneggerm.recentadvancesinmammaliansyntheticbiology-designofsynthetictransgenecontrolnetworks.currentopinioninbiotechnology.2009；20:449-60.3.yeh,daoud-elbabam,pengrw,fusseneggerm.asyntheticoptogenetictranscriptiondeviceenhancesblood-glucosehomeostasisinmice.science.2011；332:1565-8.4.moglicha,hegemannp.biotechnology:programminggenomeswithlight.nature.2013；500:406-8.5.levskayaa,chevalieraa,taborjj,simpsonzb,laveryla,levym,etal.syntheticbiology:engineeringescherichiacolitoseelight.nature.2005；438:441-2.6.toettcherje,voigtca,weinerod,limwa.thepromiseofoptogeneticsincellbiology:interrogatingmolecularcircuitsinspaceandtime.naturemethods.2011；8:35-8.7.mullerk,naumanns,weberw,zurbriggenmd.optogeneticsforgeneexpressioninmammaliancells.biologicalchemistry.2015；396:145-52.8.motta-menalb,readea,mallorymj,glantzs,weinerod,lynchkw,etal.anoptogeneticgeneexpressionsystemwithrapidactivationanddeactivationkinetics.naturechemicalbiology.2014；10:196-202.9.wangx,chenx,yangy.spatiotemporalcontrolofgeneexpressionbyalight-switchabletransgenesystem.naturemethods.2012；9:266-9.10.konermanns,brighammd,trevinoae,hsupd,heidenreichm,congl,etal.opticalcontrolofmammalianendogenoustranscriptionandepigeneticstates.nature.2013；500:472-6.11.nihongakiy,yamamotos,kawanof,suzukih,satom.crispr-cas9-basedphotoactivatabletranscriptionsystem.chemistry&biology.2015；22:169-74.12.polsteinlr,gersbachca.light-induciblespatiotemporalcontrolofgeneactivationbycustomizablezincfingertranscriptionfactors.journaloftheamericanchemicalsociety.2012；134:16480-3.13.polsteinlr,gersbachca.alight-induciblecrispr-cas9systemforcontrolofendogenousgeneactivation.naturechemicalbiology.2015；11:198-200.当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3