基于金纳米颗粒探针检测DNA甲基化程度的试剂盒及其检测方法与应用与流程

本发明涉及生物检测和医学领域，具体涉及一种基于金纳米颗粒探针检测dna甲基化程度的试剂盒及其检测方法与应用。

背景技术：

dna甲基化作为表观遗传学的主要形式之一，癌症的发生发展与之密切相关。dna甲基化是在甲基转移酶的催化下，基因组中cpg二核苷酸中胞嘧啶的第五位c原子上被选择性添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶结构，常见于基因的5'-cg-3'序列。dna甲基化并不改变基因的碱基序列，但能影响基因的表达。研究表明，癌症的发生发展与抑癌基因dna甲基化异常密切相关。在正常细胞中抑癌基因可调节细胞生长，修复dna，并控制细胞凋亡。而抑癌基因启动子的过度甲基化能使抑癌基因表达下调或失活，癌细胞生长失控，并阻碍细胞凋亡，从而导致肿瘤的发生。近些年来，dna甲基化已成为肿瘤发生机制的研究热点之一。

目前，用于dna甲基化检测的方法主要有焦磷酸测序，bsp，甲基化特异性pcr，然而现有的dna甲基化检测方法需借助于复杂精密仪器，难以实时、快速地得到检测结果。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于金纳米颗粒探针检测dna甲基化程度的试剂盒及其检测方法与应用，以实时、快速、经济、实用地检测dna甲基化程度。

第一方面，本发明提供的检测dna甲基化程度的试剂盒包括金纳米颗粒探针，金纳米颗粒探针包括金纳米颗粒和进行甲基化特异性聚合酶链反应的上游引物，上游引物的5’端修饰有巯基，上游引物通过巯基与金纳米颗粒偶联，金纳米颗粒的粒径为10～15nm，平均粒径为13nm。

优选地，dna为pax1基因，上游引物对应于pax1基因启动子区；即所检测的dna甲基化为抑癌基因pax1的启动子区dna甲基化发生的程度。

优选地，上游引物为sh-5’cggttagacgaattttttttaatcggatga-3’(seqidno.1)。

优选地，试剂盒还包括下游引物，下游引物的序列为5’-cccgcgaccccaaac-3’(seqidno.2)。

优选地，金纳米颗粒探针的制备方法包括如下步骤：

1)将上游引物和金纳米颗粒在室温条件下孵育，得到第一混合物；

2)向第一混合物中加入tris-盐酸缓冲液和nacl溶液后在避光条件下孵育，得到第二混合物；

3)将第二混合物进行离心，取沉淀，得到金纳米颗粒探针。

优选地，步骤1)中，上游引物与金纳米颗粒的摩尔比为95～105:1，孵育时间为15～20h；步骤2)中，孵育时间为20～30h。具体为：步骤1)中，上游引物与金纳米颗粒的摩尔比为100:1，孵育时间为16h；步骤2)中，取10μl浓度为100mm、ph为8.2的tris-盐酸缓冲液和20μl1mnacl溶液逐滴加入第一混合物中，将得到的体系在避光条件下孵育24h。

可选地，试剂盒还包括金纳米颗粒或金纳米颗粒溶胶(胶体溶液)。

可选地，试剂盒还包括nacl粉末或水溶液。

可选地，试剂盒还包括聚合酶链反应(pcr)所需的其它试剂。

第二方面，本发明提供了上述试剂盒或试剂盒中的金纳米颗粒探针在制备检测dna甲基化程度的系统中的应用，所述系统还包括进行甲基化特异性聚合酶链反应所需的其它试剂。

第三方面，本发明提供的检测dna甲基化程度的方法，包括如下步骤：

a)将重亚硫酸盐处理后的待测dna在含有上述试剂盒中的金纳米颗粒探针的体系中进行甲基化特异性聚合酶链反应；具体为：配置25μlpcr扩增体系，包含：100ng重亚硫酸盐处理后的待测dna模板，0.8μm金纳米颗粒探针，0.4μm下游引物，5μl10×epitaqpcrbuffer，0.3mmdntps，1.25udna聚合酶；反应条件为在95℃反应4min，然后在95℃反应30s，55℃反应30s，72℃反应1min，进行16个循环，最后在72℃反应7min，降温至4℃结束反应；

b)将甲基化特异性聚合酶链反应后的产物加入到金纳米颗粒的胶体溶液中，静置孵育，得到第三混合物，金纳米颗粒的粒径为10～15nm，平均粒径为13nm；可选地，先将甲基化特异性聚合酶链反应后的产物用pcr纯化试剂盒纯化，然后再加入到金纳米颗粒的胶体溶液中；

c)向第三混合物中加入nacl溶液，反应至少4分钟，得到第四混合物，反应时间优选为6分钟；

d)对第四混合物的进行检测。

进一步地，检测dna甲基化程度的方法还包括：将第四混合物的颜色与标准比色卡进行比对，检测待测dna甲基化程度；标准比色卡的制备方法包括：

采用标准甲基化dna和标准非甲基化dna，配置一系列甲基化程度不同的标准dna；可选地，标准非甲基化dna为健康人类的外周血gdna，通过cpg甲基化转移酶处理标准非甲基化dna得到标准甲基化dna；

将一系列甲基化程度不同的标准dna分别进行步骤a)～c)中的操作，得到一系列颜色不同的第四混合物；

将一系列颜色不同的第四混合物按照对应的甲基化程度升序或降序排列。

进一步地，检测dna甲基化程度的方法还包括：将第四混合物采用紫外可见光分光光度法进行检测；

用紫外可见光分光光度法检测第四混合物的方法具体包括：

s1)建立标准曲线:

采用标准甲基化dna和标准非甲基化dna，配置一系列甲基化程度不同的标准dna；将所述一系列甲基化程度不同的标准dna分别进行所述步骤a)～c)中的操作，得到相应的第四混合物；可选地，标准非甲基化dna为健康人类的外周血gdna，通过cpg甲基化转移酶处理标准非甲基化dna得到标准甲基化dna；

测试采用甲基化程度为0％的标准dna得到的第四混合物的紫外可见光吸收光谱，记录最大吸收峰的波长x，x具体为650nm；

采用甲基化程度为100％的标准dna，进行步骤a)～b)中的操作，测试所得体系的紫外可见光吸收光谱，记录最大吸收峰的波长y，y具体为520nm；

测试相应的第四混合物的紫外可见光吸收光谱，记录波长x和y处的吸光度值ax和ay，得到ax/ay比值；

将ax/ay比值与对应的甲基化程度百分率进行拟合，制成标准曲线；

s2)测试采用待测dna得到的第四混合物的紫外可见光吸收光谱，记录波长x和y处的吸光度值ax和ay，得到ax/ay比值，带入上述标准曲线，得到待测dna的甲基化程度百分率。

本发明提供的检测dna甲基化程度的原理为：将待测dna经过重亚硫酸盐处理后，其中发生甲基化的c碱基保留，未发生甲基化的c碱基转化成u，设计甲基化特异性聚合酶链反应(msp)引物，进行msp扩增时，如检测位点发生甲基化，则能通过pcr扩增得到片段产物，若检测位点未发生甲基化则无扩增产物。本发明根据待检测基因dna的目标检测序列，如抑癌基因pax1的启动子区，设计并合成了金纳米颗粒探针，该金纳米颗粒探针为金纳米颗粒与5’端修饰有巯基的msp上游引物的偶联体，上游引物通过巯基与金纳米颗粒偶联。将金纳米颗粒探针作为msp扩增体系的上游引物，如有扩增片段，则扩增出的产物通过巯基连接在金纳米颗粒表面。发明人探究了巯基修饰的msp引物对msp扩增效率的影响，分两组样本，一组上游引物的5’端修饰有巯基，一组无巯基修饰，在同等实验条件下进行msp扩增实验，凝胶电泳实验显示结果一致，说明巯基修饰的引物并不影响msp扩增效率。在颗粒均匀分散的金纳米颗粒的胶体溶液中加入盐后，如加入nacl，金纳米颗粒会发生团聚现象，进而体系的颜色和紫外可见光吸收光谱会发生一定变化。而在金纳米颗粒表面有msp扩增产物的金纳米颗粒胶体溶液中，金纳米颗粒在盐离子的加入下仍能保持稳定，免于团聚作用的发生，相应体系的颜色和紫外可见光吸收光谱的变化非常小，基本保持不变；无扩增产物生成的体系，由于金纳米颗粒表面无大分子保护，则金纳米颗粒在盐离子的作用下会发生团聚现象，胶体溶液颜色由酒红色变成灰色，然后趋于稳定，且体系的颜色和紫外吸光度的变化与dna甲基化程度有关。如图4和图5所示，采用甲基化程度为100％的标准甲基化dna，按照本发明提供的检测方法，在体系中加入盐溶液(nacl溶液)后，由于有扩增产物修饰金纳米颗粒，体系的颜色没有明显变化，6分钟后仍然呈现如图5中的插图(右)所示的红色，在加入nacl后0～6min内每秒记录紫外可见光谱a650/a520比值，结果对应于图5的pax1^m+曲线，比值几乎没有变化，即阳性样本的体系维持不变，通过图4的透射电镜图可看到金纳米颗粒仍然分散均匀；采用甲基化程度为0％的标准非甲基化dna，按照本发明提供的检测方法，在体系中加入盐溶液(nacl溶液)后，体系的颜色在0～4min内逐渐从酒红色变成灰色，4分钟后趋于稳定，体系的紫外可见光吸收光谱在0～4min内的变化为：紫外可见光谱的最大吸收峰位置从520nm红移至650nm，且峰形逐渐变宽，由图4(右)可看到体系中的金纳米颗粒发生较严重的团聚现象，在加入nacl后0～6min内每秒记录体系的紫外可见光谱的a650/a520比值，对应于图5的pax1^m-曲线，阴性样本体系中a650/a520比值在0～4min内随时间而增大，从0.3增至1.4，4min后比值稳定维持不变。

本发明通过设计标准比色卡，可实时、快速、简便、经济地的根据体系的颜色来检测待测dna的甲基化程度，并且设计了紫外吸光度与dna甲基化百分率的标准曲线，通过测试体系的紫外可见光吸收光谱，将相关数据代入标准曲线即可得到准确的dna甲基化百分率，不需要使用贵重的仪器，检测方法更简便、经济、实用。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式的技术方案，下面将对具体实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示出了本发明实施例1的金纳米颗粒溶胶的透射电镜图(a)和紫外可见光吸收光谱(b)；

图2示出了本发明实施例1提供标准比色卡照片；

图3示出了本发明实施例1提供的标准曲线；

图4示出了透射电镜图：标准甲基化dna体系加入盐溶液反应4min后(左)和标准非甲基化dna体系加入盐溶液反应4min后(右)的金纳米颗粒；

图5示出了标准甲基化dna与标准非甲基化dna反应体系的紫外可见吸收光谱a650/a520值在加入盐溶液后0～6min内变化曲线，插图为6min时两种反应体系的颜色。

具体实施方式

下面将结合附图及实施例对本发明进行详细的描述。以下实施例是示例性的，旨在用于更加清楚的说明本发明的技术方案，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

本实施例提供的检测dna甲基化程度的试剂盒是针对pax1基因dna的甲基化程度的检测，pax1是一种抑癌基因，它的启动子区高甲基化经常用于一些癌症的诊断和筛查，尤其在宫颈癌中，研究表明临床上将pax1基因甲基化检测与hpv检测相结合，能降低子宫颈癌的误诊率，极大提高子宫颈癌的诊断水平，故选择pax1基因。该试剂盒包括金纳米颗粒探针、金纳米颗粒溶胶和下游引物。

金纳米颗粒溶胶的制备方法为：所用到的玻璃器皿经王水浸泡过夜；制备时，在250ml三口烧瓶中加入100ml去离子水和4.8ml质量分数为1.0％的氯金酸水溶液，烧瓶置于磁力搅拌器上，烧瓶上加冷凝回流管，加热至沸腾，在剧烈搅拌下快速加入10ml质量分数为1.0％新鲜配制的柠檬酸三钠水溶液，保持溶液沸腾反应5min，停止加热，溶液颜色变为酒红色，继续搅拌至溶液冷却至室温，制得金纳米颗粒溶胶，4℃保存。其中柠檬酸三钠购自国药集团，氯金酸购自上海西格玛奥德里奇公司。

图1为金纳米颗粒溶胶的透射电镜图(a)和紫外可见光吸收光谱(b)，如图1(a)所示，所制得的金纳米颗粒的粒径均匀，粒径为10～15nm，平均粒径为13nm，且分散性良好，金纳米颗粒溶胶的紫外可见光吸收光谱如图1(b)所示，最大吸收峰在520nm。

金纳米颗粒探针的制备方法为：设计并合成pax1基因msp引物，上游引物的5’端修饰有巯基，上游引物序列具体如下：

上游引物f：sh-5’cggttagacgaattttttttaatcggatga-3’(seqidno.1)；

取20μl100μm上游引物与200μl100nm上述金纳米颗粒溶胶置于室温(约20℃)轻摇孵育16h，得到第一混合物；取tris-盐酸缓冲液10μl(100mm,ph＝8.2)和20μl1mnacl溶液逐滴加入第一混合物中，将该体系避光孵育24h，得到第二混合物，将第二混合物置于低温离心机8000g离心15min，取沉淀，得到金纳米颗粒探针。

下游引物r：5’-cccgcgaccccaaac-3’(seqidno.2)，上游引物和下游引物合成自上海博尚生物技术有限公司。

利用实施例1提供的试剂盒检测pax1基因dna甲基化程度发方法为：

步骤1：提取待测dna、标准甲基化dna和标准非甲基化dna；待测dna提取自正常人的宫颈脱落细胞，标准非甲基化dna取自健康志愿者的外周血gdna，通过cpg甲基化转移酶处理前述标准非甲基化dna后得到标准甲基化dna。

步骤2：配置一系列不同甲基化程度的标准dna；采用标准甲基化dna和标准非甲基化dna，配置标准甲基化dna的质量浓度分别为0％，20％，40％，60％，80％，100％的标准dna，该质量浓度即为甲基化程度百分率，标准甲基化dna的质量浓度为0％的标准dna即为标准非甲基化dna。

步骤3：采用重亚硫酸盐对待测dna和一系列标准dna进行处理，用常规的处理方法即可。

步骤4：将重亚硫酸盐处理后的待测dna和一系列标准dna进行甲基化特异性聚合酶链反应，具体为：配置25μlpcr扩增体系，其中包含100ng重亚硫酸盐处理后的dna模板(待测dna或标准dna)，0.8μm金纳米颗粒探针，0.4μm下游引物，5μl10×epitaqpcrbuffer，0.3mmdntps，1.25udna聚合酶；反应条件为在95℃反应4min，然后在95℃反应30s，55℃反应30s，72℃反应1min，进行16个循环，最后在72℃反应7min，降温至4℃结束反应。将甲基化特异性聚合酶链反应(msp)产物用pcr纯化试剂盒纯化，按产品使用说明书步骤进行。其中，dntp购自上海生物工程有限公司，dna聚合酶(重亚硫酸盐转化后dna专用)和10×epitaqpcrbuffer购自宝生物工程(大连)有限公司，pcr纯化试剂盒购自凯杰生物技术(上海)有限公司。

步骤5：建立标准比色卡；分别从纯化后的一系列标准dna的msp产物中取5μl加入到20μl试剂盒中的金纳米颗粒溶胶中，孵育30min，然后加入2μl浓度为5mol/l的nacl溶液。开始计时，反应6分钟后，得到一系列不同颜色的体系，将不同颜色的体系按对应的甲基化程度(即标准甲基化dna的质量浓度)升序排序，如图2所示，从左至右，甲基化程度分别为0％、20％、40％、60％、80％、100％，对应的体系的颜色分别为灰色、紫灰色、蓝紫色、紫色、深红色、酒红色，得到标准比色卡。其中nacl购买自国药集团。

步骤6：通过比色法检测待测dna的甲基化程度；从纯化后的待测dna的msp产物中取5μl加入到20μl试剂盒中的金纳米颗粒溶胶中，孵育30min，然后加入2μl浓度为5mol/l的nacl溶液。开始计时，反应6分钟后，记录该反应体系的颜色，与标准比色卡进行比色，判读颜色所在区间，可估算甲基化程度大致范围。本实施例得到的体系在加入nacl溶液后的颜色由酒红变为紫灰色，6分钟后颜色稳定，与比色卡对比，体系的颜色与比色卡中甲基化程度为20％的颜色非常接近，判断待测dna的甲基化百分率为20％左右。

进一步地，步骤5中还包括建立标准曲线；将采用甲基化程度为100％的标准dna(即标准甲基化dna)得到的纯化后的msp扩增产物加入到金纳米颗粒溶胶中，孵育30min后，测试体系的紫外可见光吸收光谱，记录最大吸收峰的波长，为520nm；将采用甲基化程度为0％的标准dna(即标准非甲基化dna)得到的纯化后的msp扩增产物加入到金纳米颗粒溶胶中，孵育30min后，加入2μl浓度为5mol/l的nacl溶液，反应6分钟后测试所得体系的紫外可见光吸收光谱，记录最大吸收峰的波长，为650nm。测试得到的一系列不同颜色的体系的紫外可见光吸收光谱，记录波长为520nm和650nm处的吸光度值，得到一系列a650/a520比值，将一系列的a650/a520比值与对应的甲基化程度百分率进行拟合，制成标准曲线，如图3所示。a650/a520比值与pax1基因dna甲基化百分率的关系为

y＝1.45-0.03×x-1.22×x²(1)；

其中x代表dna甲基化百分率，y代表反应6分钟后的体系的a650/a520比值。建立的标准曲线，可以用于检测未知甲基化程度的待测dna样本中发生甲基化的比例，只需检测加入nacl6min后的体系的a650/a520比值，带入公式(1)的反函数

m＝0.82×(1.769-1.22×a)^1/2-0.0123(2)；

即可计算待测dna的甲基化百分率，其中m为待测样本的甲基化百分率，a为检测到的a650/a520比值。

进一步地，步骤6中还包括通过紫外可见光分光光度法检测待测dna的甲基化百分率，具体为：从纯化后的待测dna的msp产物中取5μl加入到20μl试剂盒中的金纳米颗粒溶胶中，孵育30min，然后加入2μl浓度为5mol/l的nacl溶液。开始计时，反应6分钟后，测试所得体系的紫外可见光吸收光谱，计算a650/a520值，计为a，带入标准曲线图，通过方程(2)计算得到待测dna的甲基化百分率为20.98％，与比色法检测的结果非常接近。

实施例2

本实施例提供的检测dna甲基化程度的试剂盒以及检测方法与实施例1相同，区别在于本实施例采用的待测dna取自宫颈癌患者的宫颈脱落细胞。通过比色法检测，得到的体系在加入nacl溶液后的颜色变化不明显，6分钟后仍为酒红色，与比色卡中甲基化百分率为100％的颜色非常接近，判断待测dna的甲基化程度接近100％。通过紫外可见光分光光度法检测待测dna的甲基化百分率，计算得到甲基化百分率为85.23％。

对比例

采用日祥生命科学股份有限公司pax1甲基化试剂盒，用qmsp方法检测实施例1和实施例2中的待测dna，分别测得实施例1中的待测dna的甲基化百分率为19.67％，实施例2中的待测dna的甲基化百分率为88.47％，采用现有的方法测试结果与本发明的检测结果一致性比较高，误差在可接受范围内，说明本发明提供的检测dna甲基化程度的方法的可行性与准确性，并且本发明可采用肉眼可见的比色法进行初步检测，不需要其他贵重仪器，可实时、快速、经济地检测dna甲基化程度，特别是检测pax1基因dna甲基化程度，具有非常高的实用价值。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。