一种检疫性实蝇多目标快速鉴定方法与流程

本发明涉及实蝇检疫技术，具体涉及一种检疫性实蝇多目标快速鉴定方法。

背景技术：

实蝇Fruit Flies，属双翅目Diptera实蝇科Tephritidae昆虫，全世界广泛分布，多发生在热带和亚热带地区。世界已知约有500属4500种，其中约1500种与各种果实有关，具有经济意义的实蝇达250余种。实蝇寄主范围广，以成虫在水果、蔬菜的果实表皮产卵形成孔洞，幼虫在果实内部取食为害，造成果实腐烂或落果，其为害可造成高达100％的经济损失，不仅对果蔬生产构成严重危害，而且给进出口贸易带来严重影响。

全世界倍受检疫关注的实蝇主要有5个属，即按实蝇属Anastrepha、果实蝇属Bactrocera、小条实蝇属Ceratitis、寡鬃实蝇属Dacus和绕实蝇属Rhagoletis。在我国，实蝇入侵防控工作受到高度重视。在2007年由农业部和国家质量监督检验检疫总局联合发布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中，检疫性实蝇包含按实蝇属、果实蝇属、小条实蝇属、寡鬃实蝇(非中国种)、绕实蝇(非中国种)等10个种属；2013年2月，农业部发布了《国家重点管理外来物种名录(第一批)》(第1897号公告)，该名录中包括3种实蝇类害虫，分别为橘小实蝇B.dorsalis、瓜实蝇B.cucurbitae和枣实蝇Carpomya vesuviana。同时，我国口岸近十年的截获信息显示，在旅客携带物及货物检疫中常有实蝇截获，且种类繁多。

口岸截获的实蝇多为非成虫态，需经1-2周饲养为成虫后才能被准确鉴定，极大降低了检疫工作的时效性。随着国际贸易、旅游和交通的迅速发展，实蝇入侵的危险性日益增加，入侵后极易爆发成灾并导致巨大的经济损失，其全球入侵已引起高度重视，其检疫鉴定特别是快速鉴定的需求愈发迫切。

近十年来，多种分子生物学技术已应用于实蝇的快速鉴定，例如：DNA条形码技术(DNA Barcoding)、PCR技术、限制性片段长度多态性技术(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA技术(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、扩增片段长度多态性技术(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)以及基因芯片技术等，但从目前已有报道来看，所有研究只针对个别实蝇物种建立了快速检测方法，仍未能完全满足我国进境植物检疫性有害生物名录中以实蝇高级分类阶元为单位的检测需求。

目前，需要建立实蝇科重要经济实蝇的多目标快速鉴定技术体系，从而提高我国国境检疫技术水平，更加全面有效地防范检疫性实蝇的入侵，抑制其定殖和扩散蔓延，保障我国农林生产和生态安全。

技术实现要素：

为了弥补现有的实蝇快速鉴定方法只能检测个别实蝇的局限性，本发明提供一种实蝇多目标快速鉴定方法及其特异性引物，具有广泛适用性，革新了检疫手段和措施，为有效防控检疫性实蝇的传入和扩散，跨越国外植物检疫技术壁垒，保护我国农业生产和生态安全提供了强有力的技术支撑。

本发明请求保护的技术方案如下：

用于检疫性实蝇多目标快速鉴定的特异性引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

所述检疫性实蝇指按实蝇属、果实蝇属、咔实蝇属、小条实蝇属、寡鬃实蝇属和/或绕实蝇属；

所述特异性引物能将所述检疫性实蝇与其它实蝇科以及双翅目近缘物种区分开。

一种检疫性实蝇多目标快速鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，利用上述特异性引物进行PCR，得到扩增产物；

(3)凝胶电泳检测扩增产物，若出现603bp的特异性条带，则该样品属于检疫性实蝇；反之，则该样品不属于检疫性实蝇。

优选地，所述PCR的反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，DNA模板1μl，10μM正向引物0.5μl，10μM反向引物0.5μl，ddH2O 10.5μl。

优选地，所述PCR的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火延伸1min，35个循环；60℃延伸1min。

一种检疫性实蝇多目标快速鉴定试剂盒，其特征在于，包括液态的或粉末状的上述特异性引物。

优选地，所述试剂盒还包括PCR反应所需的其它常规试剂。

本发明为满足我国进境植物检疫性有害生物名录中以实蝇高级分类阶元为单位的检测需求，从GenBank数据库中检索了所有双翅目昆虫物种的线粒体基因组序列并进行了多序列比对，筛选到了重要经济实蝇属(即检疫性实蝇)的保守位点。以保守位点的核苷酸序列为模板设计多对引物并对其进行评估，最后筛选得到能够区分检疫性实蝇和其他实蝇科及双翅目等近缘物种的特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

所述检疫性实蝇指按实蝇属、果实蝇属、咔实蝇属、小条实蝇属、寡鬃实蝇属和/或绕实蝇属。

本发明提供的检疫性实蝇多目标快速鉴定方法，步骤简便易行，只需提取待测样品的基因组DNA；利用本发明提供的特异性引物进行PCR；凝胶电泳检测PCR产物，若出现603bp的特异性条带，则该样品为检疫性实蝇；反之，则该样品不属于检疫性实蝇。所述方法能够快速检测非成虫态或成虫态的样品，整个鉴定过程只需数小时，无需经1-2周饲养为成虫后再鉴定，提高了检疫工作的效率，不用耗费人力物力对幼虫进行饲养，降低了检疫成本；能够在多个实蝇物种，包括按实蝇属、果实蝇属、咔实蝇属、小条实蝇属、寡鬃实蝇属和绕实蝇属中检测到特异性条带，将这些实蝇与非检疫性实蝇及其它双翅目物种区分开，兼具通用性和特异性；可检测浓度低至0.1ng/ul的基因组DNA，灵敏度高。

所述方法中，最佳的PCR反应体系和反应条件为：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，DNA模板1μl，10μM正向引物0.5μl，10μM反向引物0.5μl，ddH2O 10.5μl。

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火延伸1min，35个循环；60℃延伸1min。

综上，本发明提供的特异性引物及检疫性实蝇多目标快速鉴定方法，与现有的实蝇快速检测方法相比，具有以下优势：

(1)简便快速：只需提取样品DNA、PCR、凝胶电泳即可快速鉴定待测样品是否属于检疫性实蝇，不用将幼虫培养为成虫后再进行检测。

(2)特异性强：所述引物能够区分检疫性实蝇和其他实蝇科及双翅目等近缘物种，鉴定结果准确性高。

(3)灵敏度高：本发明方法能够检测到浓度低至0.1ng/ul的基因组DNA。

(4)通用性强：所述方法可检测多个实蝇物种，克服了现有方法只针对个别实蝇物种的局限性，不需要多重实验即可鉴定待测样品是否属于检疫性实蝇。

附图说明

图1.重要经济实蝇通用引物的特异性验证结果图，

其中，DNA Marker从上至下依次是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp和100bp；

泳道1～44分别表示重要经济实蝇物种、非经济实蝇物种、其他双翅目物种和阴性对照样品的扩增条带，依次为南美按实蝇A.fraterculus、瓜按实蝇A.grandis、墨西哥按实蝇A.ludens、西印度按实蝇A.obliqua、蒲桃果实蝇B.albistrigata、深黑颜果实蝇B.atrifacies、葫瓜实蝇B.bezziana、杨桃果实蝇B.carambolae、普通果实蝇B.caudata、两带果实蝇B.cilifera、番石榴果实蝇B.correcta、瓜实蝇B.cucurbitae、异颜果实蝇B.diversa、橘小实蝇B.dorsalis、何氏华实蝇B.hochii、斯里兰卡果实蝇B.kandiensis、辣椒果实蝇B.latifrons、橘大实蝇B.minax、油橄榄果实蝇B.oleae、锈红果实蝇B.rubigina、印度果实蝇B.scutellaris、宽带果实蝇B.scutellata、中达果实蝇B.synnephes、南亚果实蝇B.tau、泰国果实蝇B.thailandica、昆士兰果实蝇B.tryoni、蜜柑大实蝇B.tsuneonis、面包果实蝇B.umbrosa、五指山果实蝇B.wuzhishana、姚氏果实蝇B.yoshimotoi、桃果实蝇B.zonata、枣实蝇C.vesuviana、地中海实蝇C.capitata、芒果小条实蝇C.cosyra、纳塔耳小条实蝇C.rosa、葫芦寡鬃实蝇D.bivittatus、埃塞俄比亚寡鬃实蝇D.ciliatus、角丝瓜棍腹实蝇D.longicornis、樱桃绕实蝇R.cerasi、苹绕实蝇R.pomonella、泽兰实蝇Procecidochares utilis、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、条纹适蜣蝇Adapsilia striatis和ddH2O。

图2.重要经济实蝇快速鉴定体系的灵敏度检测结果图，

其中，图2A为按实蝇属灵敏度检测结果，图2B为果实蝇属灵敏度检测结果，图2C为咔实蝇属灵敏度检测结果，图2D为小条实蝇属灵敏度检测结果，图2E为寡鬃实蝇属灵敏度检测结果，图2F绕实蝇属灵敏度检测结果；

DNA Marker从上至下依次是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp和100bp；

泳道1～7分别表示样品浓度分别为100ng/ul、10ng/ul、1ng/ul、0.1ng/ul、0.01ng/ul、0.001ng/ul的基因组DNA和ddH2O。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进一步详细说明，需要声明的是，下述实施方式仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

生物材料

表1所列的重要经济实蝇属(即按实蝇属、果实蝇属、咔实蝇属、小条实蝇属、寡鬃实蝇属和绕实蝇属)物种和其他实蝇科及双翅目近缘物种为供试样品，均保存在中国检验检疫科学研究院。

将各个样品分别置于无水乙醇中，-20℃保存备用。

表1供试实蝇样品种类

主要试剂

2×Taq PCR MasterMix，购自天根生化科技(北京)有限公司；

血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司。

在本发明以下实施例中，未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可以按照本领域常规方法配制而得或商购获得，规格为实验室纯级即可。

实施例1.实蝇科重要经济实蝇通用引物的设计

在GenBank数据库中检索所有双翅目昆虫物种的线粒体基因组序列，共计146种。

对获得的所有146种双翅目昆虫物种的线粒体基因组序列用DNAMAN软件进行多序列比对。

从18种线粒体基因组序列已知的重要经济实蝇(分属按实蝇属、果实蝇属、咔实蝇属、小条实蝇属、寡鬃实蝇属和绕实蝇属)的实蝇物种中筛选到能够特异性地区分重要经济实蝇和其他实蝇科及双翅目等近缘物种的保守位点。

对筛选得到的保守位点(例如橘小实蝇B.dorsalis，其线粒体基因组序列的GenBank编号为DQ845759，保守位点的位置为3142bp-3744bp)人工设计引物，利用Oligo软件对引物进行评估，最后筛选获得的特异性引物如表2所示。

表2特异性鉴定实蝇科重要经济实蝇的通用引物

实施例2.重要经济实蝇多目标快速鉴定方法

1、DNA提取：

生物样品：

表1中的40个重要经济实蝇物种，包括15种线粒体基因组序列已知的实蝇物种和25种线粒体基因组序列未公布的实蝇物种，用于验证本发明特异性引物的通用性；

表1中的泽兰实蝇Procecidochares utilis、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、条纹适蜣蝇Adapsilia striatis为其他实蝇科及双翅目近缘物种，用于验证本发明特异性引物的特异性。

利用“血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒”分别对单头样品(非成虫态或者成虫态均可)进行基因组DNA提取，具体操作流程参照试剂盒说明书。

2、引物通用性和特异性验证：

以步骤1中提取的基因组DNA为模板，利用实施例1中设计的引物进行PCR扩增，通过不断优化PCR反应试剂用量以及退火温度、时间等参数，获得的最佳反应体系和反应条件如下。

扩增反应结束后，取5μl PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，EB染色15分钟，在紫外灯下观察结果。

结果如图1所示，从所有重要经济实蝇物种的样品中均扩增出特异性条带，而非经济实蝇和其他双翅目物种中没有出现扩增条带。

分别对特异性条带进行切胶回收，送生工生物工程(上海)股份有限公司公司测序，结果表明，从40个重要经济实蝇物种样品中扩增得到的特异性条带的大小均为603bp，序列比对结果表明，15种已知线粒体基因组序列的重要经济实蝇物种的扩增条带的核苷酸序列与实施例1筛选得到的线粒体基因组保守位点的核苷酸序列完全一致。

因此，本发明的TFdeg/TR引物对在上述PCR反应体系和反应条件下，对且仅对所有重要经济实蝇物种发生阳性反应，产生603bp的特异性目的条带，对其余非经济实蝇和其他双翅目物种均为阴性反应，无特异性条带产生。

3、灵敏度检测：

在步骤1中提取的基因组DNA中，从每个重要经济实蝇属中选择一个实蝇物种的基因组DNA，分别用TE缓冲液进行系列稀释，得到6个浓度梯度的稀释液，其中基因组DNA的浓度分别为：100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl、0.001ng/μl。分别以每个浓度梯度的基因组DNA稀释液为模板(蒸馏水为阴性对照)，用实施例1中设计和筛选得到的特异性引物分别对不同浓度的模板DNA进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件同步骤2。

扩增反应结束后，取5ul PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，EB染色15分钟，在紫外灯下观察结果。结果如图2所示，本发明的引物可检测的模板浓度均可达到0.1ng/ul。