病毒介导的Cpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及病毒介导的Cpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用。

背景技术：

基因编辑是在基因组水平上进行精确修饰的一种技术，可完成基因定点删除(InDel)突变、基因定点插入突变、多位点同时突变和小片段的删失等。基因编辑技术可用于基因功能及疾病发病机理研究、构建疾病动物模型、生物治疗、遗传和肿瘤相关疾病研究、整合病毒疾病研究和改良农畜牧物种。基因编辑技术是从根本上改变物种遗传物质DNA的工具，具有极其广泛的应用价值和发展前景。

锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9系统是三大基因编辑技术，本质上均是利用非同源末端链接途径(NHEJ)修复和同源重组(HR)修复，联合特异性DNA的靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变。NHEJ修复使基因产生插入或删除突变，从而造成基因移码突变，以实现编码基因敲除，如果是基因组邻近位置两处双链断裂，NHEJ修复后则可造成基因组片段缺失。锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9系统三种编辑技术的共同点是含有靶点DNA序列的识别区域及DNA剪切功能区域。其中ZFN通过锌指结构域识别靶点DNA序列，TALEN识别靶点DNA序列的区域是重复可变双残基的重复，ZFN和TALEN的DNA剪切功能区域均为一种名为Fokl的核酸内切酶结构域，FokI结构需要形成二聚体才能发挥DSB剪切功能，所以ZFNs和TALEN均需要表达两个DNA靶向-FokI核酸内切酶结构融合蛋白。而CRISPR/Cas9系统是存在于大多数细菌(约40％)和古细菌(约90％)中的一种后天免疫系统，可用来消灭或对抗外来的质体或者噬菌体，并在自身基因组中留下外来基因片段作为“记忆”，在下一次外源DNA入侵时，表达的Cas9核酸酶在含有记忆片段的crRNA及tracrRNA的指导下切割与记忆片段一样且含有PAM的外源基因，发挥抵抗外源DNA片段入侵的免疫作用。利用CRISPR/Cas9系统编辑生物基因组，可在靶标片段处造成不同形式的缺失或插入，现已成功应用于人类细胞系、斑马鱼、大鼠、小鼠、果蝇等生物中。与ZFN和TALEN相比，CRISPR/Cas9系统中蛋白质对DNA序列的识别要更加精确得多，降低了脱靶切割的几率，减低了细胞毒性，而且CRISPR/Cas9系统的构建仅仅需要设计与靶序列互补的gRNA即可，更为简单和廉价，大大提高了基因操作的效率及简便性。但是，CRISPR/Cas9系统也存在着一些不足，如Cas9蛋白不能对任意序列进行切割，其靶点3’端要求必须含有PAM序列(如SpCas9蛋白要求PAM序列为NGG)。

最新发现的CRISPR/Cpf1系统(Zetsche B,Gootenberg JS et al.Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2CRISPR-Cas system.Cell.2015Oct22；

163(3):759-71.)和CRISPR/Cas9系统同属CRISPR-Cas Class2系统，但前者仅需要一条更短的crRNA即可实现基因编辑，更有潜力实现更简单、更精确的基因组工程操作。但对于一些较难转染的细胞(如来源于小鼠的ATDC5细胞和来源于大鼠的C6细胞)，Cpf1蛋白的转导效率较低，从而较难实现基因编辑。因此，寻找一种提高Cpf1蛋白的转导效率的方法势在必行。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何对受体中的目的基因进行基因编辑。

为解决上述技术技术问题，本发明首先提供了一种重组病毒。

本发明所提供的重组病毒可为表达Cpf1基因的重组病毒；所述Cpf1基因为编码Cpf1蛋白的基因。

上述重组病毒中，所述病毒可为慢病毒或腺病毒。

所述Cpf1蛋白可为AsCpf1蛋白或FnCpf1蛋白。

所述AsCpf1蛋白可为h1)或h2)或h3)：

h1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

h2)在h1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

h3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

所述FnCpf1蛋白可为i1)或i2)或i3)：

i1)氨基酸序列是序列表中序列5所示的蛋白质；

i2)在i1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

i3)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

所述编码AsCpf1蛋白的基因可为AsCpf1基因。所述AsCpf1基因的核苷酸序列可如序列表中序列1所示。

所述编码FnCpf1蛋白的基因可为FnCpf1基因。所述FnCpf1基因的核苷酸序列可如序列表中序列4所示。

所述重组病毒的制备方法具体如下：

(1)构建含有所述Cpf1基因的重组质粒；

(2)制备受体的单细胞悬液；

(3)取培养皿，加入所述单细胞悬液，培养；

(4)完成步骤(3)后，取所述培养皿，弃液相，加入DMEM培养基，然后逐滴加入混合物，培养，得到重组病毒；所述混合物含有步骤(1)构建的含有所述Cpf1基因的重组质粒、质粒pGag/Pol、质粒pRev和质粒Pvsv-G。

上述制备方法中，所述受体可为293T细胞。

上述制备方法中，每2mL单细胞悬液(浓度为10⁷个/mL)可加入60μg步骤(1)构建的含有所述Cpf1基因的重组质粒、20μg质粒pGag/Pol、20μg质粒pRev和20μg质粒Pvsv-G。上述制备方法中，含有所述Cpf1基因的重组质粒具体可为含有AsCpf1基因的质粒Y1867、含有AsCpf1基因的质粒Y1861、含有AsCpf1基因的质粒Y1862、含有AsCpf1基因的质粒Y1863、含有AsCpf1基因的质粒Y1864、含有AsCpf1基因的质粒Y1865、含有FnCpf1基因的质粒Y1868、含有FnCpf1基因的质粒Y1871、含有FnCpf1基因的质粒Y1872、含有FnCpf1基因的质粒Y1873、含有FnCpf1基因的质粒Y1874或含有FnCpf1基因的质粒Y1875。所述质粒Y1867具体可为将慢病毒穿梭载体LV6的限制性内切酶NotI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子得到。所述质粒Y1861具体可为将慢病毒穿梭载体LV5的限制性内切酶NotI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子得到。所述质粒Y1862具体可为将慢病毒穿梭载体LV8的限制性内切酶NotI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子得到。所述质粒Y1863具体可为将慢病毒穿梭载体LV11的限制性内切酶NotI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子得到。所述质粒Y1864具体可为将腺病毒载体ADV11的限制性内切酶EcoRI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子得到。所述质粒Y1865具体可为将腺病毒载体ADV4的限制性内切酶EcoRI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子得到。所述质粒Y1868具体可为将慢病毒穿梭载体LV6的限制性内切酶NotI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子得到。所述质粒Y1871具体可为将慢病毒穿梭载体LV5的限制性内切酶NotI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子得到。所述质粒Y1872具体可为将慢病毒穿梭载体LV8的限制性内切酶NotI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子得到。所述质粒Y1873具体可为将慢病毒穿梭载体LV11的限制性内切酶NotI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子得到。所述质粒Y1874具体可为将腺病毒载体ADV11的限制性内切酶EcoRI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子得到。所述质粒Y1875具体可为将腺病毒载体ADV4的限制性内切酶EcoRI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子得到。所述慢病毒穿梭载体LV6、所述腺病毒载体ADV11、所述慢病毒穿梭载体LV5、所述慢病毒穿梭载体LV8、所述慢病毒穿梭载体LV11或腺病毒载体ADV4均为上海吉玛制药技术有限公司的产品。

上述制备方法中，所述质粒pGag/Pol、所述质粒pRev和所述质粒Pvsv-G均为上海吉玛制药技术有限公司的产品。

上述制备方法中，所述步骤(3)中的培养可为37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。

上述制备方法中，所述步骤(4)中的培养可为37℃、5％CO₂培养箱中培养4h。

为解决上述技术技术问题，本发明还提供了一种重组载体。

本发明所提供的重组载体可为具有病毒基因组和所述Cpf1基因的重组载体；所述Cpf1基因为编码所述Cpf1蛋白的基因。

上述重组载体中，所述病毒可为慢病毒或腺病毒。

所述重组载体具体可为将所述Cpf1基因插入病毒载体得到的重组载体；所述病毒载体为具有病毒基因组的载体。

所述病毒载体具体可为所述慢病毒穿梭载体LV6、所述腺病毒载体ADV11、所述慢病毒穿梭载体LV5、所述慢病毒穿梭载体LV8、所述慢病毒穿梭载体LV11或所述腺病毒载体ADV4。

所述重组载体具体可为所述质粒Y1867、所述质粒Y1861、所述质粒Y1862、所述质粒Y1863、所述质粒Y1864、所述质粒Y1865、所述质粒Y1868、所述质粒Y1871、所述质粒Y1872、所述质粒Y1873、所述质粒Y1874或所述质粒Y1875。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种CRISPR/Cpf1系统。

本发明所提供的CRISPR/Cpf1系统，包括上述任一所述重组病毒，或，上述任一所述重组载体。

所述CRISPR/Cpf1系统中还可包括crRNA。所述crRNA可根据目的靶标设计。

所述crRNA具体可为hRb1 AscrRNA、mRb1 AscrRNA、rRb1 AscrRNA、hP53 AscrRNA、mP53 AscrRNA、rP53 AscrRNA、h/m/rDicer1 AscrRNA、hRb1 FncrRNA、mRb1 FncrRNA、rRb1 FncrRNA、hP53 FncrRNA、mP53 FncrRNA、rP53 FncrRNA或h/m/rDicer1 FncrRNA，序列分别如下：

hRb1 AscrRNA：5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUUcccaagUUaaccaagcUcU-3’；

mRb1 AscrRNA：5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUUcccaagUUagccaagcUcU-3’；

rRb1 AscrRNA：5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUUcccacgUUagccaagcUcU-3’；

hP53 AscrRNA：5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUaUgcUgUccccggacgaUaU-3’；

mP53 AscrRNA：5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUaaggcccaagUgaagcccUc-3’；

rP53 AscrRNA：5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUcaUaagcaUgaaaaUgUcUc-3’；

h/m/rDicer1 AscrRNA：5’-AAUUUCUACUCUUGUAGAUgacUgccaUggcaacaagaa-3’；

hRb1 FncrRNA：5’-TAATTTCTACTGTTGTAGAT UcccaagUUaaccaagcUcU-3’；

mRb1 FncrRNA：5’-TAATTTCTACTGTTGTAGATUcccaagUUagccaagcUcU-3’；

rRb1 FncrRNA：5’-TAATTTCTACTGTTGTAGATUcccacgUUagccaagcUcU-3’；

hP53 FncrRNA：5’-TAATTTCTACTGTTGTAGATaUgcUgUccccggacgaUaU-3’；

mP53 FncrRNA：5’-TAATTTCTACTGTTGTAGATaaggcccaagUgaagcccUc-3’；

rP53 FncrRNA：5’-TAATTTCTACTGTTGTAGATcaUaagcaUgaaaaUgUcUc-3’；

h/m/rDicer1 FncrRNA：5’-TAATTTCTACTGTTGTAGATgacUgccaUggcaacaagaa-3’。

上述任一所述重组病毒在对受体中的目的基因进行基因编辑中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述重组载体在对受体中的目的基因进行基因编辑中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述受体可为293T细胞、ATDC5细胞或C6细胞。

为解决上述技术问题，本发明还提供了对受体中的目的基因进行基因编辑的方法。

本发明所提供的对受体中的目的基因进行基因编辑的方法，具体可为方法一，包括如下步骤：借助CRISPR/Cpf1系统对受体中的目的基因进行基因编辑；所述CRISPR/Cpf1系统中的Cpf1蛋白是通过将上述任一所述重组病毒导入所述受体提供的。

本发明所提供的对受体中的目的基因进行基因编辑的方法，具体可为方法二，包括如下步骤：借助CRISPR/Cpf1系统对受体中的目的基因进行基因编辑；所述CRISPR/Cpf1系统中的Cpf1蛋白是通过将上述任一所述重组载体导入所述受体提供的。

上述方法中，所述受体可为293T细胞、ATDC5细胞或C6细胞。

上述方法中，所述Cpf1蛋白可为AsCpf1蛋白或FnCpf1蛋白。

所述AsCpf1蛋白可为h1)或h2)或h3)：

h1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

h2)在h1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

h3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

所述FnCpf1蛋白可为i1)或i2)或i3)：

i1)氨基酸序列是序列表中序列5所示的蛋白质；

i2)在i1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

i3)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

实验证明，病毒介导的AsCpf1蛋白FnCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中均造成了hRb1基因、hP53基因、hDicer1基因、mRb1基因、mP53基因、mDicer1基因、rRb1基因、rP53基因和rDicer1基因的突变。因此，病毒介导的AsCpf1蛋白或FnCpf1蛋白可运用于CRISPR/Cpf1基因编辑系统进行基因编辑，可见，利用本发明所提供的重组病毒或重组载体可对受体中的目的基因进行基因编辑，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例1步骤三中5的实验结果。

图2为实施例1步骤三中7的实验结果。

图3为实施例2步骤三中7的实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

293T细胞为中国科学院细胞库的产品，目录号为GNHu17。ATDC5细胞为Riken细胞库的产品，产品目录号为RCB0565。C6大鼠胶质瘤细胞为中国科学院细胞库的产品，产品目录号为TCR1；C6大鼠胶质瘤细胞在下文中简称C6细胞。DMEM培养基为Gibco公司的产品。PBS缓冲液是用超纯水稀释PBS(10×)至10倍体积得到的；PBS(10×)为生工生物工程(上海)股份有限公司产品，货号为E607016。T7E1为T7E1突变检测试剂盒中的组件；T7E1突变检测试剂盒为苏州吉玛基因股份有限公司的产品。DNA Marker为Thermo Fisher公司产品，产品名称为GeneRuler DNA Ladder Mix，货号为SM0331。10×退火buffer：含10mM EDTA·2Na、1000mM NaCl的pH8.0、100mM Tris-HCl缓冲液。Trypsin-EDTA Solution为Gibco公司的产品。FBS为Biological Industries公司的产品。Polybrene为Sigma公司的产品，产品目录号为H9268。6孔板为Corning公司的产品，产品目录号为3516。荧光显微镜为Motic公司的产品，产品型号为AE31-252B。lipofectamine 2000为invitrogen公司产品。Genomic DNA Extraction kit为Takara公司产品，产品目录号为#9765。慢病毒穿梭载体LV6、腺病毒载体ADV11、慢病毒穿梭载体LV5、慢病毒穿梭载体LV8、慢病毒穿梭载体LV11和腺病毒载体ADV4均为上海吉玛制药技术有限公司产品；慢病毒穿梭载体LV6在下文中简称载体LV6；腺病毒载体ADV11在下文中简称载体ADV11；慢病毒穿梭载体LV5在下文中简称载体LV5；慢病毒穿梭载体LV8在下文中简称载体LV8；慢病毒穿梭载体LV11在下文中简称载体LV11；腺病毒载体ADV4在下文中简称载体ADV4。嘌呤霉素为SIGMA公司的产品，产品目录号为58-58-2。D-Hanks solution为Sigma公司的产品，产品目录号为H1387。RNAi-mate为上海吉玛制药技术有限公司的产品，产品目录号为G04001。质粒pGag/Pol、质粒pRev和质粒Pvsv-G均为上海吉玛制药技术有限公司的产品。

实施例1、病毒介导的AsCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用

一、靶基因和靶序列的选择

选择hRb1基因(Gene ID：5925)、mRb1基因(Gene ID：19645)、rRb1基因(Gene ID：24708)、hP53基因(Gene ID：7157)、mP53基因(Gene ID：22059)、rP53基因(Gene ID：24842)、hDicer1基因(Gene ID：23405)、mDicer1基因(Gene ID：192119)和rDicer1基因(Gene ID：299284)作为检测CRISPR/Cpf1系统的基因编辑能力的靶基因。

根据hRb1基因的核苷酸序列选择靶序列1，根据mRb1基因的核苷酸序列选择靶序列2，根据rRb1基因的核苷酸序列选择靶序列3，根据hP53基因的核苷酸序列选择靶序列4，根据mP53基因的核苷酸序列选择靶序列5，根据rP53基因的核苷酸序列选择靶序列6，根据hDicer1基因的核苷酸序列选择靶序列7，根据mDicer1基因的核苷酸序列选择靶序列7，根据rDicer1基因的核苷酸序列选择靶序列7。上述靶序列的核苷酸序列如下：

靶序列1：5’-tcccaagttaaccaagctctctc-3’；

靶序列2：5’-tcccaagttagccaagctctttc-3’；

靶序列3：5’-tcccacgttagccaagctctctc-3’；

靶序列4：5’-atgctgtccccggacgatattga-3’；

靶序列5：5’-aaggcccaagtgaagccctccga-3’；

靶序列6：5’-cataagcatgaaaatgtctcctg-3’；

靶序列7：5’-gactgccatggcaacaagaagca-3’。

二、化学合成的crRNA的制备

合成表1中所示的crRNA。表1中，单下划线为As crRNA骨架序列，双下划线为靶序列1自5’末端起第1至20位，粗下划线为靶序列2自5’末端起第1至20位，点式下划线为靶序列3自5’末端起第1至20位，虚下划线为靶序列4自5’末端起第1至20位，点－短线下划线为靶序列5自5’末端起第1至20位，波浪线为靶序列6自5’末端起第1至20位，点－点－短线下划线为靶序列7自5’末端起第1至20位。表1中所示的所有crRNA为均1OD(33μg)一管，每管中加入66μL DEPC水，得到RNA浓度均为0.5μg/μL的crRNA溶液。

表1.化学合成的crRNA的基本信息

三、检测病毒介导的AsCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1系统中的基因编辑能力

1、质粒Y1867的构建

AsCpf1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。编码AsCpf1蛋白的基因命名为AsCpf1基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，

(1)人工合成序列表中序列1所示的双链DNA分子。

(2)以步骤(1)合成的双链DNA分子为模板，以上海吉玛制药技术有限公司合成的F：5’-AGGGTTCCAAGCTTAAGCGGCCGCGCCACCATGACACAGTTCGAGGGCTTTACCAACCTGTATCAGGTG-3’(下划线为限制性内切酶NotI的酶切识别序列)和R：5’-ATCAGTAGAGAGTGTCGGATCCTTAGGCATAGTCGGGGACATCATATGGGTATGCATAATC-3’(下划线为限制性内切酶BamHI的酶切识别序列)为引物，进行PCR扩增，得到约4100bp的PCR扩增产物。

(3)用限制性内切酶NotI和BamHI双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。

(4)用限制性内切酶NotI和BamHI双酶切载体LV6，回收约2600bp的载体骨架。

(5)将酶切产物和载体骨架连接，得到重组质粒LV6－Y1867。

根据测序结果，对重组质粒LV6－Y1867进行结构描述如下：将载体LV6的限制性内切酶NotI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子。重组质粒LV6－Y1867含有AsCpf1基因的核苷酸序列，表达AsCpf1蛋白。在下文中，重组质粒LV6－Y1867简称为质粒Y1867。

2、Y1867病毒液和Y1867病毒稀释液的获得

(1)Y1867病毒液的获得

a、将293T细胞置于装有含10％(体积比)FBS的DMEM培养基的培养皿，37℃、5％CO₂培养箱中培养，待293T细胞培养至80～90％融合时，接种至新的培养皿，然后弃液相，用1mL D-Hanks solution洗涤两次。

b、完成步骤a后，向所述培养皿中加入1mL Trypsin-EDTA Solution，混匀，弃液相，然后37℃静置3min。

c、完成步骤b后，向所述培养皿中加入2mL含10％(体积比)FBS的DMEM培养基，反复吹打，形成单细胞悬液。

d、完成步骤c后，将所述单细胞悬液接种于直径为15cm的培养皿，加入18mL含10％(体积比)FBS的DMEM培养基，37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。

e、完成步骤d后，取所述培养皿，弃液相，先加入8mLDMEM培养基，然后逐滴加入混合物，轻轻混匀，然后37℃、5％CO₂培养箱中培养4h。

所述混合物为将溶液甲(将1.5mLDMEM培养基、60μg质粒Y1867和1.5mL包装质粒溶液(含20μg质粒pGag/Pol、20μg质粒pRev和20μg质粒Pvsv-G)混匀，然后室温静置5min)和溶液乙(将1.5mLDMEM培养基和300μLRNAi-mate混匀，然后室温静置5min)混匀，然后室温静置20min得到的。

f、完成步骤e后，取所述培养皿，弃液相，加入18mL含10％(体积比)FBS的DMEM培养基，37℃、5％CO₂培养箱中培养72h。

g、完成步骤f后，取所述培养皿，取上清，然后4℃、4000rpm离心4min，得到上清液；将所述上清液用0.45μm过滤器过滤，得到滤液；将所述滤液4℃、20000rpm离心2h，得到Y1867病毒液。

(2)Y1867病毒稀释液的获得

取Y1867病毒液，用含10％(体积比)FBS的DMEM培养基稀释至5倍体积，获得Y1867病毒稀释液。

3、ATDC5－Y1867稳定株、C6－Y1867稳定株和293T－Y1867稳定株的构建

(1)将ATDC5细胞置于装有含10％(体积比)FBS的DMEM培养基的培养皿(直径为6cm)，37℃、5％CO₂培养箱中培养，待ATDC5细胞培养至80～90％融合时，弃液相，ATDC5细胞用3mL PBS缓冲液洗涤两次。

(2)完成步骤(1)后，向所述培养皿中加入1mLTrypsin-EDTA Solution，混匀，弃液相，然后37℃静置3min。

(3)完成步骤(2)后，向所述培养皿中加入2mLDMEM培养基，反复吹打，形成单细胞悬液。

(4)完成步骤(3)后，将所述单细胞悬液接种于6孔板(每孔约接种1×10⁶个ATDC5细胞)，37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。

(5)完成步骤(4)后，取所述6孔板，每孔加入Polybrene和1mL的Y1867病毒稀释液，得到混合液；该混合液中，Polybrene的浓度为5μg/mL。

(6)完成步骤(5)后，将6孔板随机分为实验组(由3个实验孔组成)和对照组(由3个对照孔组成)，然后进行如下操作：

A、实验孔

①取所述6孔板，弃液相，每个实验孔加入2mL含10％(体积比)FBS的DMEM培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待细胞培养至80～90％融合时，加入嘌呤霉素，得到混合液(该混合液中，嘌呤霉素的浓度为1.5μg/mL)，然后置于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养24h。

②完成步骤①后，弃液相，每个实验孔加入2mL含10％(体积比)FBS和1.5μg/mL嘌呤霉素的DMEM培养基，然后置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。

③同步骤②。

④同步骤③。

B、对照孔

①取所述6孔板，弃液相，每个对照孔加入2mL含10％(体积比)FBS的DMEM培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待细胞培养至80～90％融合时，再置于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养24h。

②完成步骤①后，弃液相，每个对照孔加入2mL含10％(体积比)FBS的DMEM培养基，然后置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。

③同步骤②。

④同步骤③。

结果判断：待对照孔中的ATDC5细胞全部死亡后，实验孔中的ATDC5细胞即为ATDC5－Y1867稳定株。

按照上述方法，将ATDC5细胞替换为C6细胞，其它步骤均不变，得到C6－Y1867稳定株。

按照上述方法，将ATDC5细胞替换为293T细胞，其它步骤均不变，得到293T－Y1867稳定株。

4、转染

获得hRb1－Y1867－293T细胞组的方法如下：

①取EP管，加入250μL DMEM培养基和含3μghRb1AscrRNA的crRNA溶液，混匀，室温静置5min，得到混合液甲；另取一EP管，加入250μL DMEM培养基和8μLlipofectamin2000，混匀，室温静置5min，得到混合液乙；将混合液甲和混合液乙混合，室温静置20min，得到转染混合物。

②将293T－Y1867稳定株置于装有10％(体积比)FBS的DMEM培养基的培养皿，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待细胞培养至80～90％融合时，接种于6孔板(每孔约接种1×10⁶个细胞)，37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。

③完成步骤②后，取所述6孔板，弃液相，然后逐滴加入转染混合物，混匀，然后置于37℃、5％CO₂培养箱中温育5h。

④完成步骤③后，取所述6孔板，弃液相，然后加入含10％(体积比)FBS的DMEM培养基，37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。

⑤重复步骤③一次。

⑥重复步骤④一次。

⑦完成步骤⑥后，取所述6孔板，弃液相，加入2mL含10％(体积比)FBS的DMEM培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h。

⑧完成步骤⑦后，1000rpm离心3min，得到沉淀。沉淀即为hRb1AscrRNA转染后的293T细胞组，简称hRb1－Y1867－293T细胞组。

按照上述的方法，将①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液分别替换为含3μg hP53 AscrRNA的crRNA溶液和含3μg h/m/rDicer1 AscrRNA的crRNA溶液，其它步骤均不变，得到hP53 －Y1867－293T细胞组和hDicer1－Y1867－293T细胞组。

按照上述的方法，将①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液分别替换为含3μg mRb1 AscrRNA的crRNA溶液、含3μg mP53 AscrRNA的crRNA溶液和含3μg h/m/rDicer1 AscrRNA的crRNA溶液，将②中293T－Y1867稳定株替换为ATDC5－Y1867稳定株，其它步骤均不变，得到mRb1－Y1867－ATDC5细胞组、mP53－Y1867－ATDC5细胞组和mDicer1－Y1867－ATDC5细胞组。

按照上述的方法，将①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液分别替换为含3μg rRb1 AscrRNA的crRNA溶液、含3μg rP53 AscrRNA的crRNA溶液和含3μg h/m/rDicer1 AscrRNA的crRNA溶液，将②中293T－Y1867稳定株替换为C6－Y1867稳定株，其它步骤均不变，得到rRb1－Y1867－C6细胞组、rP53－Y1867－C6细胞组和rDicer1－Y1867－C6细胞组。

按照上述的方法，将①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液替换为水，其它步骤均不变，得到Y1867－293T细胞组，作为空白对照。

按照上述的方法，将①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液替换为水，将②中293T－Y1867稳定株替换为C6－Y1867稳定株，其它步骤均不变，得到Y1867－C6细胞组，作为空白对照。

按照上述的方法，将①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液替换为水，将②中293T－Y1867稳定株替换为ATDC5－Y1867稳定株，其它步骤均不变，得到Y1867－ATDC5细胞组，作为空白对照。

5、荧光检测

将上述步骤4获得的各个细胞组在荧光显微镜下进行观察。

部分结果见图1(图1中A、C和E为在荧光视野下的观察结果，B、D和F为在白光视野下的观察结果，A和B为mP53－Y1867－ATDC5细胞组，C和D为rP53－Y1867－C6细胞组，E和F为hP53－Y1867－293T细胞组)。结果表明，慢病毒介导的AsCpf1基因能够有效包装慢病毒并侵染ATDC5细胞、C6细胞或293T细胞。

6、各细胞组的基因组DNA的提取和PCR扩增产物的获得

(1)用Genomic DNA Extraction kit分别提取步骤4获得的各个细胞组的基因组DNA。

(2)PCR扩增产物的获得

以hRb1－Y1867－293T细胞组的基因组DNA为模板，以5’-AGAAGTGTTTTGCTGCTTTGAAG-3’和5’-GATTACAGGCATGAACCACCGTG-3’为引物进行PCR扩增，得到约408bp的PCR扩增产物1。

以hP53－Y1867－293T细胞组的基因组DNA为模板，以5’-TTCCATGGGACTGACTTTCTGCT-3’和5’-GGCATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3’为引物进行PCR扩增，得到约694bp的PCR扩增产物2。

以hDicer1－Y1867－293T细胞组的基因组DNA为模板，以5’-AAGGTACAGAATGCTTGACTCCT-3’和5’-ATTAATCAGAAGTGGGAGGCCTG-3’为引物进行PCR扩增，得到约515bp的PCR扩增产物3。

以mRb1－Y1867－ATDC5细胞组的基因组DNA为模板，以5’-TTCCGTCTTCCCAGTGTGCTTTA-3’和5’-TCAGAATCATCACCACAGCCACT-3’为引物进行PCR扩增，得到约655bp的PCR扩增产物6。

以mP53－Y1867－ATDC5细胞组的基因组DNA为模板，以5’-TCCCCTTGCCTGAGAGAAACAAA-3’和5’-ACTCACCGTGCACATAACAGACT-3’为引物进行PCR扩增，得到约612bp的PCR扩增产物7。

以mDicer1－Y1867－ATDC5细胞组的基因组DNA为模板，以5’-TTTAATGCCTGCCTGTACGTTGG-3’和5’-TTAATCAGAAGAGGCGGGCTTGA-3’为引物进行PCR扩增，得到约719bp的PCR扩增产物8。

以rRb1－Y1867－C6细胞组的基因组DNA为模板，以5’-TGCTGCTCTGGATGTATGTGGTT-3’和5’-AAAGTTGGAAGGCGGAGATGAGA-3’为引物进行PCR扩增，得到约610bp的PCR扩增产物9。

以rP53－Y1867－C6细胞组的基因组DNA为模板，以5’-CCTGCGCATAAGTTCCCCAAAAT-3’和5’-ACAGAATCTCACTTACCCCAGGC-3’为引物进行PCR扩增，得到约502bp的PCR扩增产物10。

以rDicer1－Y1867－C6细胞组的基因组DNA为模板，以5’-TCCTTTGTTTTAACCCCGCATGG-3’和5’-ATGACATGCGTGACTGAACCCTA-3’为引物进行PCR扩增，得到约506bp的PCR扩增产物11。

以Y1867－ATDC5细胞组的基因组DNA为模板，以5’-TTTAATGCCTGCCTGTACGTTGG-3’和5’-TTAATCAGAAGAGGCGGGCTTGA-3’为引物进行PCR扩增，得到约719bp的PCR扩增产物12，作为空白对照。

以Y1867－C6细胞组的基因组DNA为模板，以5’-TCCTTTGTTTTAACCCCGCATGG-3’和5’-ATGACATGCGTGACTGAACCCTA-3’为引物进行PCR扩增，得到约506bp的PCR扩增产物13，作为空白对照。

以Y1867－293T细胞组的基因组DNA为模板，以5’-TTCCATGGGACTGACTTTCTGCT-3’和5’-GGCATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3’为引物进行PCR扩增，得到约694bp的PCR扩增产物14，作为空白对照。

7、T7E1突变检测

(1)退火样品的制备

①将PCR扩增产物1进行胶回收，得到回收产物1。

②完成步骤①后，将回收产物1和野生型DNA等摩尔混合，得到样品1。野生型DNA的核苷酸序列如序列表中的序列3所示。

③完成步骤②后，配制退火反应体系，然后进行退火反应，得到退火样品1。

退火反应体系包括退火样品1 1～3μg、突变检测buffer 3μL，用ddH₂O补至30μL。

退火反应条件为：首先98℃10min，然后缓慢降温(降温速度<1℃/10s)至25℃，最后25℃5min。

按照上述方法，将步骤①中的PCR扩增产物1分别替换为PCR扩增产物2、PCR扩增产物3、PCR扩增产物6、PCR扩增产物7、PCR扩增产物8、PCR扩增产物9、PCR扩增产物10、PCR扩增产物11、PCR扩增产物12、PCR扩增产物13和PCR扩增产物14，其它步骤均不变，得到退火样品2、退火样品3、退火样品6、退火样品7、退火样品8、退火样品9、退火样品10、退火样品11、退火样品12、退火样品13和退火样品14。

(2)T7E1处理

取步骤(1)制备的退火样品(退火样品1、退火样品2、退火样品3、退火样品6、退火样品7、退火样品8、退火样品9、退火样品10、退火样品11、退火样品12、退火样品13或退火样品14)20μL，加入0.5μL T7E1，得到处理体系；然后37℃条件下反应30min。

(3)电泳分析和结果判断

将完成步骤(2)的处理体系用浓度为1.8％的琼脂糖凝胶电泳分析，然后进行如下结果判断：

如果PCR扩增产物1可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为56bp和352bp、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成hRb1基因的突变；如果PCR扩增产物1被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成hRb1基因的突变；

如果PCR扩增产物2可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为269bp和425bp、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成hP53基因的突变；如果PCR扩增产物2被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成hP53基因的突变；

如果PCR扩增产物3可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为192bp和323p、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成hDicer1基因的突变；如果PCR扩增产物3被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成hDicer1基因的突变；

如果PCR扩增产物6可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为258bp和399bp、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成mRb1基因的突变；如果PCR扩增产物6被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成mRb1基因的突变；

如果PCR扩增产物7可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为189bp和423bp、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成mP53基因的突变；如果PCR扩增产物7被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成mP53基因的突变；

如果PCR扩增产物8可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为154bp和565p、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成mDicer1基因的突变；如果PCR扩增产物8被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成mDicer1基因的突变；

如果PCR扩增产物9可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为270bp和340bp、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成rRb1基因的突变；如果PCR扩增产物9被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成rRb1基因的突变；

如果PCR扩增产物10可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为270bp和232bp、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成rP53基因的突变；如果PCR扩增产物10被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成rP53基因的突变；

如果PCR扩增产物11可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为229bp和277p、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成rDicer1基因的突变；如果PCR扩增产物11被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成rDicer1基因的突变。

T7E1突变检测实验结果见图2(图2中A从左至右依次为：hRb1为hRb1－Y1867－293T细胞组，hP53为hP53－Y1867－293T细胞组，hDicer1为hDicer1－Y1867－293T细胞组，M为DNA Marker，rRb1为rRb1－Y1867－C6细胞组，rP53为rP53－Y1867－C6细胞组，rDicer1为rDicer1－Y1867－C6细胞组，blank为Y1867－293T细胞组；图2中B：M为DNA Marker，mRb1为mRb1－Y1867－ATDC5细胞组，mP53为mP53－Y1867－ATDC5细胞组，mDicer1为mDicer1－Y1867－ATDC5细胞组，ATDC5为Y1867－ATDC5细胞组)。结果表明，慢病毒介导的AsCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中均造成了hP53基因、mRb1基因、mP53基因、rRb1基因、rP53基因和rDicer1基因的突变。因此，慢病毒介导的AsCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中有一定的基因编辑能力。

8、PCR扩增产物的测序

将PCR扩增产物1进行测序，测序引物为5’-TTGACTTACCATGCAAGCAAATA-3’。将PCR扩增产物2进行测序，测序引物为5’-GATCCCCACTTTTCCTCTTGCAG-3’。将PCR扩增产物3进行测序，测序引物为5’-TACCCAGCTCACTAGGACAGACA-3’。将PCR扩增产物6进行测序，测序引物为5’-TTCAAAACTGTGCTGGTGTGTGC-3’。将PCR扩增产物7进行测序，测序引物为5’-GTTGGGTGTCTGTAAATCCTGCG-3’。将PCR扩增产物8进行测序，测序引物为5’-CCCTGCATGGTTGTGTAATGGTA-3’。将PCR扩增产物9进行测序，测序引物为5’-GCTTTGTCTCAACGCTGTCTCGC-3’。将PCR扩增产物10进行测序，测序引物为5’-CATCTCCCTGCCAGATAGTCCAC-3’。将PCR扩增产物11进行测序，测序引物为5’-CCAAACCGACCATGGGAAGAATC-3’。将PCR扩增产物12进行测序，测序引物为5’-CCCTGCATGGTTGTGTAATGGTA-3’。将PCR扩增产物13进行测序，测序引物为5’-CCAAACCGACCATGGGAAGAATC-3’。

上述测序均由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

部分测序结果如下：

(1)PCR扩增产物9的测序结果为：

(2)PCR扩增产物10的测序结果为：

(3)PCR扩增产物11的测序结果为：

测序结果表明，慢病毒介导的AsCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中均造成了hRb1基因、hP53基因、hDicer1基因、mRb1基因、mP53基因、mDicer1基因、rRb1基因、rP53基因和rDicer1基因的突变，尤其对rRb1基因和rP53基因的突变效果最为明显。因此，慢病毒介导的AsCpf1蛋白可运用于CRISPR/Cpf1基因编辑系统进行基因编辑。

按照上述步骤三的方法，将质粒Y1867替换为质粒Y1861、质粒Y1862或质粒Y1863，其它步骤均不变，结果表明，慢病毒介导的AsCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中均造成了hRb1基因、hP53基因、hDicer1基因、mRb1基因、mP53基因、mDicer1基因、rRb1基因、rP53基因和rDicer1基因的突变。质粒Y1861为将载体LV5的限制性内切酶NotI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子，得到的重组质粒。质粒Y1862为将载体LV8的限制性内切酶NotI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子，得到的重组质粒。质粒Y1863为将载体LV11的限制性内切酶NotI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子，得到的重组质粒。因此，慢病毒介导的AsCpf1蛋白可运用于CRISPR/Cpf1基因编辑系统进行基因编辑。

按照上述步骤三的方法，将质粒Y1867替换为质粒Y1864或质粒Y1865，其它步骤均不变，结果表明，腺病毒介导的AsCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中均造成了hRb1基因、hP53基因、hDicer1基因、mRb1基因、mP53基因、mDicer1基因、rRb1基因、rP53基因和rDicer1基因的突变。质粒Y1864为将载体ADV11的限制性内切酶EcoRI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子，得到的重组质粒。质粒Y1865为将载体ADV4的限制性内切酶EcoRI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子，得到的重组质粒。因此，腺病毒介导的AsCpf1蛋白可运用于CRISPR/Cpf1基因编辑系统进行基因编辑。

上述结果表明，慢病毒或腺病毒介导的AsCpf1蛋白可运用于CRISPR/Cpf1基因编辑系统进行基因编辑。

实施例2、病毒介导的FnCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用

一、靶基因和靶序列的选择

同实施例1步骤一。

二、化学合成的crRNA的制备

合成表2中所示的crRNA。表2中，单下划线为Fn crRNA骨架序列双下划线为靶序列1自5’末端起第1至20位，粗下划线为靶序列2自5’末端起第1至20位，点式下划线为靶序列3自5’末端起第1至20位，虚下划线为靶序列4自5’末端起第1至20位，点－短线下划线为靶序列5自5’末端起第1至20位，波浪线为靶序列6自5’末端起第1至20位，点－点－短线下划线为靶序列7自5’末端起第1至20位。

表2中所示的所有crRNA为均1OD(33μg)一管，每管中加入66μL DEPC水，得到RNA浓度均为0.5μg/μL的crRNA溶液。

表2.化学合成的crRNA的基本信息

三、检测病毒介导的FnCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1系统中的基因编辑能力

1、质粒Y1868的构建

FnCpf1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示。编码FnCpf1蛋白的基因命名为FnCpf1基因，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，

(1)人工合成序列表中序列4所示的双链DNA分子。

(2)以步骤(1)合成的双链DNA分子为模板，以上海吉玛制药技术有限公司合成的F：5’-AGGGTTCCAAGCTTAAGCGGCCGCGCCACCATGAGCATCTACCAGGAGTTCGTCAACAAGTATTCACTG-3’(下划线为限制性内切酶NotI的酶切识别序列)和R：5’-ATCAGTAGAGAGTGTCGGATCCTTAGGCATAGTCGGGGACATCATATGGGTATGCATAATC-3’(下划线为限制性内切酶BamHI的酶切识别序列)为引物，进行PCR扩增，得到约4100bp的PCR扩增产物。

(3)用限制性内切酶NotI和BamHI双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。

(4)用限制性内切酶NotI和BamHI双酶切载体LV6，回收约2600bp的载体骨架。

(5)将酶切产物和载体骨架连接，得到重组质粒LV6－Y1868。

根据测序结果，对重组质粒LV6－Y1868进行结构描述如下：将载体LV6的限制性内切酶NotI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子。重组质粒LV6－Y1868含有FnCpf1基因的核苷酸序列，表达FnCpf1蛋白。在下文中，重组质粒LV6－Y1868简称为质粒Y1868。

2、Y1868病毒液和Y1868病毒稀释液的获得

(1)Y1868病毒液的获得

a、将293T细胞置于装有含10％(体积比)FBS的DMEM培养基的培养皿，37℃、5％CO₂培养箱中培养，待293T细胞培养至80～90％融合时，接种至新的培养皿，然后弃液相，用1mL D-Hanks solution洗涤两次。

b、完成步骤a后，向所述培养皿中加入1mL Trypsin-EDTA Solution，混匀，弃液相，然后37℃静置3min。

c、完成步骤b后，向所述培养皿中加入2mL含10％(体积比)FBS的DMEM培养基，反复吹打，形成单细胞悬液。

d、完成步骤c后，将所述单细胞悬液接种于直径为15cm的培养皿，加入18mL含10％(体积比)FBS的DMEM培养基，37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。

e、完成步骤d后，取所述培养皿，弃液相，先加入8mLDMEM培养基，然后逐滴加入混合物，轻轻混匀，然后37℃、5％CO₂培养箱中培养4h。

所述混合物为将溶液1(将1.5mLDMEM培养基、60μg质粒Y1868和1.5mL包装质粒溶液(含20μg质粒pGag/Pol、20μg质粒pRev和20μg质粒Pvsv-G)混匀，然后室温静置5min)和溶液2(将1.5mLDMEM培养基和300μLRNAi-mate混匀，然后室温静置5min)混匀，然后室温静置20min得到的。

f、完成步骤e后，取所述培养皿，弃液相，加入18mL含10％(体积比)FBS的DMEM培养基，37℃、5％CO₂培养箱中培养72h。

g、完成步骤f后，取所述培养皿，取上清，然后4℃、4000rpm离心4min，得到上清液；将所述上清液用0.45μm过滤器过滤，得到滤液；将所述滤液4℃、20000rpm离心2h，得到Y1868病毒液。

(2)Y1868病毒稀释液的获得

取Y1868病毒液，用含10％(体积比)FBS的DMEM培养基稀释至5倍体积，获得Y1868病毒稀释液。

3、ATDC5－Y1868稳定株、C6－Y1868稳定株和293T－Y1868稳定株的构建

(1)同实施例1步骤三3中(1)。

(2)同实施例1步骤三3中(2)。

(3)同实施例1步骤三3中(3)。

(4)同实施例1步骤三3中(4)。

(5)完成步骤(4)后，取所述6孔板，每孔加入Polybrene和1mL的Y1868病毒稀释液，得到混合液；该混合液中，Polybrene的浓度为5μg/mL。

(6)同实施例1步骤三3中(6)。

结果判断：待对照孔中的ATDC5细胞全部死亡后，实验孔中的ATDC5细胞即为ATDC5－Y1868稳定株。

按照上述方法，将ATDC5细胞替换为C6细胞，其它步骤均不变，得到C6－Y1868稳定株。按照上述方法，将ATDC5细胞替换为293T细胞，其它步骤均不变，得到293T－Y1868稳定株。

4、转染

获得hRb1－Y1868－293T细胞组的方法如下：

①同实施例1步骤三4中①。

②将293T－Y1868稳定株置于装有10％(体积比)FBS的DMEM培养基的培养皿(直径为10cm)，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待细胞培养至80～90％融合时，接种于6孔板(每孔约接种1×10⁶个细胞)，37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。

③同实施例1步骤三4中③。

④同实施例1步骤三4中④。

⑤重复步骤③一次。

⑥重复步骤④一次。

⑦同实施例1步骤三4中⑦。

⑧完成步骤⑦后，1000rpm离心3min，得到沉淀。沉淀即为hRb1AscrRNA转染后的293T细胞组，简称hRb1－Y1868－293T细胞组。

按照上述的方法，将①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液分别替换为含3μg hP53 AscrRNA的crRNA溶液和含3μg h/m/rDicer1 AscrRNA的crRNA溶液，其它步骤均不变，得到hP53－Y1868－293T细胞组和hDicer1－Y1868－293T细胞组。

按照上述的方法，将①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液分别替换为含3μg mRb1 AscrRNA的crRNA溶液、含3μg mP53 AscrRNA的crRNA溶液和含3μg h/m/rDicer1 AscrRNA的crRNA溶液，将②中293T－Y1868稳定株替换为ATDC5－Y1868稳定株，其它步骤均不变，得到mRb1－Y1868－ATDC5细胞组、mP53－Y1868－ATDC5细胞组和mDicer1－Y1868－ATDC5细胞组。

按照上述的方法，将①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液分别替换为含3μg rRb1 AscrRNA的crRNA溶液、含3μg rP53 AscrRNA的crRNA溶液和含3μg h/m/rDicer1 AscrRNA的crRNA溶液，将②中293T－Y1868稳定株替换为C6－Y1868稳定株，其它步骤均不变，得到rRb1－Y1868－C6细胞组、rP53－Y1868－C6细胞组和rDicer1－Y1868－C6细胞组。

按照上述的方法，将①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液替换为水，其它步骤均不变，得到Y1868－293T细胞组，作为空白对照。

按照上述的方法，将①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液替换为水，将②中293T－Y1868稳定株替换为C6－Y1868稳定株，其它步骤均不变，得到Y1868－C6细胞组，作为空白对照。

按照上述的方法，将①中含3μg hRb1 AscrRNA的crRNA溶液替换为水，将②中293T－Y1868稳定株替换为ATDC5－Y1868稳定株，其它步骤均不变，得到Y1868－ATDC5细胞组，作为空白对照。

5、荧光检测

将上述步骤4获得的各个细胞组在荧光显微镜下进行观察。结果表明，慢病毒介导的FnCpf1基因能够有效包装慢病毒并侵染ATDC5细胞、C6细胞或293T细胞。

6、各细胞组的基因组DNA的提取和PCR扩增产物的获得

(1)用Genomic DNA Extraction kit分别提取步骤4获得的各个细胞组的基因组DNA。

(2)PCR扩增产物的获得

以hRb1－Y1868－293T细胞组的基因组DNA为模板，以5’-AGAAGTGTTTTGCTGCTTTGAAG-3’和5’-GATTACAGGCATGAACCACCGTG-3’为引物进行PCR扩增，得到约408bp的PCR扩增产物a。

以hP53－Y1868－293T细胞组的基因组DNA为模板，以5’-TTCCATGGGACTGACTTTCTGCT-3’和5’-GGCATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3’为引物进行PCR扩增，得到约694bp的PCR扩增产物b。

以hDicer1－Y1868－293T细胞组的基因组DNA为模板，以5’-AAGGTACAGAATGCTTGACTCCT-3’和5’-ATTAATCAGAAGTGGGAGGCCTG-3’为引物进行PCR扩增，得到约515bp的PCR扩增产物c。

以mRb1－Y1868－ATDC5细胞组的基因组DNA为模板，以以5’-TTCCGTCTTCCCAGTGTGCTTTA-3’和5’-TCAGAATCATCACCACAGCCACT-3’为引物进行PCR扩增，得到约655bp的PCR扩增产物f。

以mP53－Y1868－ATDC5细胞组的基因组DNA为模板，以5’-TCCCCTTGCCTGAGAGAAACAAA-3’和5’-ACTCACCGTGCACATAACAGACT-3’为引物进行PCR扩增，得到约612bp的PCR扩增产物g。

以mDicer1－Y1868－ATDC5细胞组的基因组DNA为模板，以5’-TTTAATGCCTGCCTGTACGTTGG-3’和5’-TTAATCAGAAGAGGCGGGCTTGA-3’为引物进行PCR扩增，得到约719bp的PCR扩增产物h。

以rRb1－Y1868－C6细胞组的基因组DNA为模板，以5’-TGCTGCTCTGGATGTATGTGGTT-3’和5’-AAAGTTGGAAGGCGGAGATGAGA-3’为引物进行PCR扩增，得到约610bp的PCR扩增产物i。

以rP53－Y1868－C6细胞组的基因组DNA为模板，以5’-CCTGCGCATAAGTTCCCCAAAAT-3’和5’-ACAGAATCTCACTTACCCCAGGC-3’为引物进行PCR扩增，得到约502bp的PCR扩增产物j。

以rDicer1－Y1868－C6细胞组的基因组DNA为模板，以5’-TCCTTTGTTTTAACCCCGCATGG-3’和5’-ATGACATGCGTGACTGAACCCTA-3’为引物进行PCR扩增，得到约506bp的PCR扩增产物k。

以Y1868－ATDC5细胞组的基因组DNA为模板，以5’-TTTAATGCCTGCCTGTACGTTGG-3’和5’-TTAATCAGAAGAGGCGGGCTTGA-3’为引物进行PCR扩增，得到约719bp的PCR扩增产物l，作为空白对照。

以Y1868－C6细胞组的基因组DNA为模板，以5’-TCCTTTGTTTTAACCCCGCATGG-3’和5’-ATGACATGCGTGACTGAACCCTA-3’为引物进行PCR扩增，得到约506bp的PCR扩增产物m，作为空白对照。

以Y1868－293T细胞组的基因组DNA为模板，以5’-TTCCATGGGACTGACTTTCTGCT-3’和5’-GGCATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3’为引物进行PCR扩增，得到约694bp的PCR扩增产物n，作为空白对照。

7、T7E1突变检测

(1)退火样品的制备

①将PCR扩增产物a进行胶回收，得到回收产物a。

②完成步骤①后，将回收产物a和野生型DNA等摩尔混合，得到样品a。野生型DNA的核苷酸序列如序列表中的序列3所示。

③完成步骤②后，配制退火反应体系，然后进行退火反应，得到退火样品a。

退火反应体系包括退火样品a 1～3μg、突变检测buffer 3μL，用ddH₂O补至30μL。

退火反应条件为：首先98℃10min，然后缓慢降温(降温速度<1℃/10s)至25℃，最后25℃5min。

按照上述方法，将步骤①中的PCR扩增产物a分别替换为PCR扩增产物b、PCR扩增产物c、PCR扩增产物f、PCR扩增产物g、PCR扩增产物h、PCR扩增产物i、PCR扩增产物j、PCR扩增产物k、PCR扩增产物l、PCR扩增产物m和PCR扩增产物n，其它步骤均不变，得到退火样品b、退火样品c、退火样品f、退火样品g、退火样品h、退火样品i、退火样品j、退火样品k、退火样品l、退火样品m和退火样品n。

(2)T7E1处理

取步骤(1)制备的退火样品(退火样品a、退火样品b、退火样品c、退火样品f、退火样品g、退火样品h、退火样品i、退火样品j、退火样品k、退火样品l、退火样品m或退火样品n)20μL，加入0.5μL T7E1，得到处理体系；然后37℃条件下反应30min。

(3)电泳分析和结果判断

将完成步骤(2)的处理体系用浓度为1.8％的琼脂糖凝胶电泳分析，然后进行如下结果判断：

如果PCR扩增产物a可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为56bp和352bp、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成hRb1基因的突变；如果PCR扩增产物a被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成hRb1基因的突变；

如果PCR扩增产物b可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为269bp和425bp、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成hP53基因的突变；如果PCR扩增产物b被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成hP53基因的突变；

如果PCR扩增产物c可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为192bp和323p、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成hDicer1基因的突变；如果PCR扩增产物c被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成hDicer1基因的突变；

如果PCR扩增产物f可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为258bp和399bp、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成mRb1基因的突变；如果PCR扩增产物f被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成mRb1基因的突变；

如果PCR扩增产物g可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为189bp和423bp、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成mP53基因的突变；如果PCR扩增产物g被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成mP53基因的突变；

如果PCR扩增产物h可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为154bp和565p、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成mDicer1基因的突变；如果PCR扩增产物h被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成mDicer1基因的突变；

如果PCR扩增产物i可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为270bp和340bp、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成rRb1基因的突变；如果PCR扩增产物i被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成rRb1基因的突变；

如果PCR扩增产物j可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为270bp和232bp、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成rP53基因的突变；如果PCR扩增产物j被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成rP53基因的突变；

如果PCR扩增产物k可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为229bp和277p、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成rDicer1基因的突变；如果PCR扩增产物k被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成rDicer1基因的突变。

T7E1突变检测的部分实验结果见图3(图3中A从左至右依次为：hP53为hP53－Y1868－293T细胞组，hDicer1为hDicer1－Y1868－293T细胞组，293T为Y1868－293T细胞组，M为DNA Marker，mRb1为mRb1－Y1868－ATDC5细胞组，mP53为mP53－Y1868－ATDC5细胞组，mDicer1为mDicer1－Y1868－ATDC5细胞组，ATDC5为Y1868－ATDC5细胞组；图3中B：rRb1和rRb1－2均为rRb1－Y1868－C6细胞组，rP53和rP53－2均为rP53－Y1868－C6细胞组，rDicer1为rDicer1－Y1868－C6细胞组，C6为Y1868－C6细胞组，M为DNA Marker)。结果表明，慢病毒介导的FnCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中均造成了hP53基因和rP53基因的突变。因此，慢病毒介导的FnCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中有一定的基因编辑能力。

8、PCR扩增产物的测序

将PCR扩增产物a进行测序，测序引物为5’-TTGACTTACCATGCAAGCAAATA-3’。将PCR扩增产物b进行测序，测序引物为5’-GATCCCCACTTTTCCTCTTGCAG-3’。将PCR扩增产物c 进行测序，测序引物为5’-TACCCAGCTCACTAGGACAGACA-3’。将PCR扩增产物f进行测序，测序引物为5’-TTCAAAACTGTGCTGGTGTGTGC-3’。将PCR扩增产物g进行测序，测序引物为5’-GTTGGGTGTCTGTAAATCCTGCG-3’。将PCR扩增产物h进行测序，测序引物为5’-CCCTGCATGGTTGTGTAATGGTA-3’。将PCR扩增产物i进行测序，测序引物为5’-GCTTTGTCTCAACGCTGTCTCGC-3’。将PCR扩增产物j进行测序，测序引物为5’-CATCTCCCTGCCAGATAGTCCAC-3’。将PCR扩增产物k进行测序，测序引物为5’-CCAAACCGACCATGGGAAGAATC-3’。将PCR扩增产物l进行测序，测序引物为5’-CCCTGCATGGTTGTGTAATGGTA-3’。将PCR扩增产物m进行测序，测序引物为5’-CCAAACCGACCATGGGAAGAATC-3’。

PCR扩增产物j的测序结果为

测序结果表明，慢病毒介导的FnCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中均造成了hRb1基因、hP53基因、hDicer1基因、mRb1基因、mP53基因、mDicer1基因、rRb1基因、rP53基因和rDicer1基因的突变，尤其对rP53基因的突变效果最为明显。因此，慢病毒介导的FnCpf1蛋白可运用于CRISPR/Cpf1基因编辑系统进行基因编辑。

按照上述步骤三的方法，将质粒Y1868替换为质粒Y1871、质粒Y1872或质粒Y1873，其它步骤均不变，结果表明，慢病毒介导的FnCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中均造成了hRb1基因、hP53基因、hDicer1基因、mRb1基因、mP53基因、mDicer1基因、rRb1基因、rP53基因和rDicer1基因的突变。质粒Y1871为将载体LV5的限制性内切酶NotI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子，得到的重组质粒。质粒Y1872为将载体LV8的限制性内切酶NotI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子，得到的重组质粒。质粒Y1873为将载体LV11的限制性内切酶NotI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子，得到的重组质粒。因此，慢病毒介导的FnCpf1蛋白可运用于CRISPR/Cpf1基因编辑系统进行基因编辑。

按照上述步骤三的方法，将质粒Y1868替换为质粒Y1874或质粒Y1875，其它步骤均不变，结果表明，腺病毒介导的FnCpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中均造成了hRb1基因、hP53基因、hDicer1基因、mRb1基因、mP53基因、mDicer1基因、rRb1基因、rP53基因和rDicer1基因的突变。质粒Y1874为将载体ADV11的限制性内切酶EcoRI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子，得到的重组质粒。质粒Y1875为将载体ADV4的限制性内切酶EcoRI和BamHI识别序列间的片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子，得到的重组质粒。因此，腺病毒介导的FnCpf1蛋白可运用于CRISPR/Cpf1基因编辑系统进行基因编辑。

上述结果表明，慢病毒或腺病毒介导的FnCpf1蛋白可运用于CRISPR/Cpf1基因编辑系统进行基因编辑。