本发明涉及一种细胞溶解素，特别涉及一种耐热细胞溶解素及其在烟草薄片制备工艺中的应用。
背景技术：
烟草薄片又称重组烟叶、均质烟叶。主要由烟末、碎片、烟梗或低次烟叶加入胶粘剂和其他添加剂等组成。烟草薄片可作为烟制品原料，用来代替天然的雪茄内包叶，现已广泛用作卷烟原料。烟草薄片的制备方法主要有造纸法、稠浆法和辊压法3种。其中，造纸法的应用最为广泛。造纸法是将烟草原料先用水浸提，不溶性物质打浆、抄造制成基片，浸提液浓缩涂布至基片上，再干燥即得。由于在造纸法制备烟草薄片过程中，直接将浓缩后的萃取液直接浸涂或喷涂到薄片片基上，浓缩后的萃取液中的大分子化合物，如蛋白质、淀粉等化学成份，在制备过程中几乎不发生变化，且烟草废弃料具有先天性缺陷，如缺少卷烟特征香气、烟草香气淡、杂气、木质气较重、喉部干燥感和舌部刺辣感明显等，因此将这些原料加入卷烟配方后会显著降低卷烟等级。
国内目前主要通过在烟草物料萃取过程中酶解或在浓缩液中加料加香来改善烟草薄片吃味差等缺点。酶解主要是利用降解酶对烟草原料中的大分子物质进行降解。但是由于烟草浸提过程中的高温工艺影响了降解酶的活性，因此再造烟叶浸提液过程中，普通的降解酶几乎难以发挥其原有的活性功能。但是由于高温降解酶的成本较高，且烟草原料中大分子物质的种类较多，因此采用多种耐高温降解酶辅助烟草萃取时，存在操作繁琐、成本较高，降解效果不理想的问题。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种耐热细胞溶解素及其在烟草薄片制备工艺中的应用，该耐热细胞溶解素能够有效降低浸提液中的蛋白质含量，提高可溶性总糖含量，并降低制备成型的烟草薄片的木质素含量。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种耐热细胞溶解素，将耐热细胞溶解素基因克隆到大肠杆菌中，再通过蓝白斑筛选含有该耐热细胞溶解素基因的阳性克隆子，最后对阳性克隆子进行诱导表达，即得。
所述的耐热细胞溶解素基因为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
一种利用耐热细胞溶解素制备烟草薄片的方法，包括以下步骤：
(1)在烟草原料中加入水和含有耐热细胞溶解素的溶液，在55-75℃条件下浸提1-2h，过滤，得到一级浸提液和一级烟草固体物；
(2)在一级烟草固体物中加入水和含有耐热细胞溶解素的溶液，在55-75℃条件下浸提5-10min，过滤，得到二级浸提液和二级烟草固体物；
(3)重复步骤(2)，得到三级浸提液和三级烟草固体物；
(4)合并一级浸提液、二级浸提液和三级浸提液，离心除去杂质，取上清液浓缩至26波美度，得到烟草浸提浓缩液；
(5)将三级烟草固体物打浆、抄造，制得烟草薄片片基，再将烟草浸提浓缩液涂布至烟草薄片片基上，干燥，制得烟草薄片。
步骤(1)中烟草原料与水的固液比为1:5-6，步骤(2)中一级烟草固体物与水的固液比为1:5-6。
步骤(1)中含有耐热细胞溶解素的溶液的用量为烟草原料与水总体积的1/500-1/200；步骤(2)中含有耐热细胞溶解素的溶液的用量为一级烟草固体物与水总体积的1/500-1/200。
所述的含有耐热细胞溶解素的溶液的制备方法为：
(1)将耐热细胞溶解素基因连接至载体，构建重组质粒；
(2)将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，通过蓝白斑筛选含有该耐热细胞溶解素基因的阳性克隆子；
(3)将阳性克隆子单菌落接种至LB液体培养基5ml中，37℃培养过夜，得到大肠杆菌菌液，﹣20℃保存备用；
(4)将﹣20℃保存的大肠杆菌菌液10μl接种至LB液体培养基100ml中，37℃培养过夜；
(5)将步骤(4)培养过夜的菌液2ml接种至LB液体培养基2000ml中，37℃振荡培养至菌液OD600为0.6，降温至18℃；
(6)在步骤(5)的菌液中加入IPTG至IPTG终浓度为0.5mM，18℃继续振荡培养至OD600达到1.0，离心，收集菌体沉淀；
(7)将菌体沉淀悬浮于50ml预冷的NTA-0缓冲液中，冰浴，超声破碎菌体，离心，收集上清液，即得。
所述的耐热细胞溶解素基因为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
所述的三级烟草固体物打浆的温度为40℃。
本发明的有益效果：
1、本发明以SEQ ID NO.1所示的基因片段为目的基因，通过大肠杆菌进行诱导表达，得到耐热的细胞溶解素。该细胞溶解素在高温条件下仍然具有极高的活性，其最适活性温度为50-85℃，适应于烟草原料浸提的高温工艺，能够用于协助制备烟草薄片，提高浸提效率，增加浸提液中可溶性总糖含量。
2、本发明的细胞溶解素参与到烟草三次浸提和打浆过程中，能够大幅提高浸提效率，进一步降解烟草原料和浸提液中的大分子物质。实验结果表明，本发明制备薄片过程中的浸提液中蛋白质含量降低、可溶性总糖增加；制备成型的薄片经过检测后木质素含量有所减少，通过评析后烟草香味物质增加，杂气减少。
3、本发明的方法简单、操作快捷，成本较低，易于工业化推广，具有良好的社会和经济效益。
附图说明
图1为实施例1菌体破碎后上清液与细胞沉淀的电泳图。其中，1为Mark，2为细胞破碎后上清液，3为细胞破碎后沉淀的悬浮液。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
本发明重组质粒构建以及大肠杆菌克隆的方法，利用的是基因工程的原理和方法，具体方案可参考分子克隆实验指南。
实施例1
耐热细胞溶解素的获取：
(1)从Genbank调取登录号为：KF408298的栖热菌(Thermus scotoductus)基因片段，并进行了相应的优化，优化后的序列具体如下：
ATGCGTATTCTGGAACCGTGGAATCGTTGGTATCGTCAGAAAGGTGTTTATCGTATTCGTGGCACCCCTCCGCATTATATTGTTCTGCATCATACCGCAGGTCCGGTTGATCAGGCACCGGAAGTTATTCGTGATTTTCACGAAAAAGGTCGTGGTTGGCCTCATATTGGTTATCATTATCTGGTTTATCAGGATGGTCGCGTGTATAAAACCCTGCCGAATAATGCAATTCCGATTTGCGTTCGTGAATTTAATCCGGTTAGCCTGTGTATTGCAGCAGTTGGTGATTTTAGCCAGGGTCCGGCATGGCCTGATAATGCACCGGGTTGGAAAGCACTGCTGGAACTGAAAGATGCACTGGTTAAAGCATATCCGAAAGCAGTTCTGGTTCTGCATAAAGAACTGACCCAGACCACCTGTCCGGGTGTTCTGAGCTGGGGTATGGTTGCAGAAAAAGGTGGTAAA(SEQ ID NO:1)
对该基因片段进行合成，并将该基因片段连接至载体，构建重组质粒；
(2)将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，通过蓝白斑筛选含有目的基因片段的阳性克隆子；
(3)将阳性克隆子单菌落接种至LB液体培养基(硫酸卡那霉素20-40μg/ml)5ml中，37℃培养过夜，得到大肠杆菌菌液，﹣20℃保存备用；
(4)将﹣20℃保存的大肠杆菌菌液10μl接种至LB液体培养基(硫酸卡那霉素20-40μg/ml)100ml中，37℃培养过夜；
(5)将步骤(4)培养过夜的菌液2ml接种至LB液体培养基2000ml中，37℃振荡培养至菌液OD600为0.6，降温至18℃；
(6)在步骤(5)的菌液中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至IPTG终浓度为0.5mM，18℃继续振荡培养至OD600达到1.0，8000rpm离心30min，收集菌体沉淀；
(7)将菌体沉淀悬浮于50ml预冷的NTA-0缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol)中，冰浴30min，超声破碎菌体，控制功率为200W，超声3s，暂停4s，重复99次，16000rpm、4℃离心50min，收集上清液；同时收集沉淀，将上清液和沉淀4℃保存备用。
将沉淀重悬于PBS缓冲液中，得到沉淀悬浮液。分别取50μl的上清液和沉淀悬浮液进行SDS-PAGE检测，结果见图1。从图1中可以看出，上清液和沉淀中均存在目的产物，即耐热细胞溶解素，且电泳结果显示上清液和沉淀悬浮液中目的产物的比例关系约为1:1。
实施例2
本发明利用耐热细胞溶解素制备烟草薄片的方法，包括以下步骤：
(1)在烟草原料中加入水和含有耐热细胞溶解素的溶液(即上清液)，在65℃条件下浸提1h，过滤，得到一级浸提液和一级烟草固体物；
其中，烟草原料与水的固液比为1:6，含有耐热细胞溶解素的溶液的用量为烟草原料与水总体积的1/500；
(2)在一级烟草固体物中加入水和含有耐热细胞溶解素的溶液，在65℃条件下浸提5min，过滤，得到二级浸提液和二级烟草固体物；
其中，一级烟草固体物与水的固液比为1:5，含有耐热细胞溶解素的溶液的用量为一级烟草固体物与水总体积的1/500；
(3)重复步骤(2)，得到三级浸提液和三级烟草固体物；
(4)合并一级浸提液、二级浸提液和三级浸提液，离心除去杂质，取上清液浓缩至26波美度，得到烟草浸提浓缩液；
(5)将三级烟草固体物打浆、抄造，制得烟草薄片片基，再将烟草浸提浓缩液涂布至烟草薄片片基上，干燥，制得烟草薄片。
所述的三级烟草固体物打浆的温度为40℃。
实施例3
本发明利用耐热细胞溶解素制备烟草薄片的方法，包括以下步骤：
(1)在烟草原料中加入水和含有耐热细胞溶解素的溶液，在55℃条件下浸提2h，过滤，得到一级浸提液和一级烟草固体物；
其中，烟草原料与水的固液比为1:6，含有耐热细胞溶解素的溶液的用量为烟草原料与水总体积的1/400；
(2)在一级烟草固体物中加入水和含有耐热细胞溶解素的溶液，在55℃条件下浸提10min，过滤，得到二级浸提液和二级烟草固体物；
其中，一级烟草固体物与水的固液比为1:5，含有耐热细胞溶解素的溶液的用量为一级烟草固体物与水总体积的1/400；
(3)重复步骤(2)，得到三级浸提液和三级烟草固体物；
(4)合并一级浸提液、二级浸提液和三级浸提液，离心除去杂质，取上清液浓缩至26波美度，得到烟草浸提浓缩液；
(5)将三级烟草固体物打浆、抄造，制得烟草薄片片基，再将烟草浸提浓缩液涂布至烟草薄片片基上，干燥，制得烟草薄片。
所述的三级烟草固体物打浆的温度为40℃。
实施例4
本发明利用耐热细胞溶解素制备烟草薄片的方法，包括以下步骤：
(1)在烟草原料中加入水和含有耐热细胞溶解素的溶液，在75℃条件下浸提1h，过滤，得到一级浸提液和一级烟草固体物；
其中，烟草原料与水的固液比为1:6，含有耐热细胞溶解素的溶液的用量为烟草原料与水总体积的1/200；
(2)在一级烟草固体物中加入水和含有耐热细胞溶解素的溶液，在75℃条件下浸提5min，过滤，得到二级浸提液和二级烟草固体物；
其中，一级烟草固体物与水的固液比为1:5，含有耐热细胞溶解素的溶液的用量为一级烟草固体物与水总体积的1/200；
(3)重复步骤(2)，得到三级浸提液和三级烟草固体物；
(4)合并一级浸提液、二级浸提液和三级浸提液，离心除去杂质，取上清液浓缩至26波美度，得到烟草浸提浓缩液；
(5)将三级烟草固体物打浆、抄造，制得烟草薄片片基，再将烟草浸提浓缩液涂布至烟草薄片片基上，干燥，制得烟草薄片。
所述的三级烟草固体物打浆的温度为40℃。
对照例1
本对照例制备烟草薄片的方法与实施例2基本相同，不同之处在于：本对照例以实施例1的沉淀悬浮液代替含有耐热细胞溶解素的溶液。
对照例2
本对照例制备烟草薄片的方法与实施例2基本相同，不同之处在于：本对照例以PBS缓冲液代替含有耐热细胞溶解素的溶液。
实验例
1、蛋白质含量检测
采用Broadford法测定实施例2-4以及对照例1-2的烟草浸提浓缩液中的蛋白质含量，同时设置未加入相应物质(含有耐热细胞溶解素的溶液、沉淀悬浮液或PBS缓冲液)的空白组，每个样品重复三次，计算平均值，结果见表1。
表1蛋白质含量测定结果
2、可溶性总糖含量测定
采用蒽酮比色法测定实施例2-4以及对照例1-2的烟草浸提浓缩液中的可溶性总糖含量，同时设置未加入相应物质(含有耐热细胞溶解素的溶液、沉淀悬浮液或PBS缓冲液)的空白组，每个样品重复三次，计算平均值，结果见表2。
表2可溶性总糖含量测定结果
3、木质素含量测定
采用低温NaOH/尿素法测定实施例2-4以及对照例1-2的制备成型的烟草薄片中木质素的含量，同时设置未加入相应物质(含有耐热细胞溶解素的溶液、沉淀悬浮液或PBS缓冲液)的空白组，每个样品重复三次，计算平均值，结果见表3。
表3木质素含量测定结果
4、烟草感官评析
将实施例2-4以及对照例1-2的制备成型的烟草薄片交由专业人员评吸，以对比不同制备工艺烟草薄片的感官情况。
表4感官评析
从表1-4可知，本发明的细胞溶解素功能多样，耐高温能力强，适用于烟草原料浸提的高温工艺，能够有效降低烟草浸提浓缩液中蛋白质的含量，提高可溶性总糖的含量，并能够降低烟草薄片的木质素含量，达到提高烟草香味物质，减少杂气的效果。