一种细菌抗药性检测系统及其操作方法与流程

本发明涉及医药检测技术领域，尤其涉及一种细菌抗药性检测系统及其操作方法。

背景技术：

抗生素是人和动物保健必需的重要产品，但是它的使用，尤其滥用，会导致病原菌的抗药性、毒副作用以及畜产品和环境生态的大量累积和残留，形成抗药性病原菌流行，因此建立完善的抗药性检测技术体系势在必行。为此，2016年8月，卫计委、发改委等14个部门联合印发了《遏制细菌耐药国家行动计划(2016-2020年)》。

目前，世界发达国家都建立了各国的抗药性检测体系，如，世界卫生组织WHONET、美国NARMS、瑞典SWARM、丹麦DANMAP、加拿大CIPARS等，国际上也形成两大药敏试验标准：美国临床标准实验室（CLSI,the Clinical and Laboratory Standards Institute）药敏试验标准、欧盟药敏试验委员会（EUCAST，European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing）标准。我国医院系统1998年引进CLSI标准作为卫生部标准颁布施行，加入WHONET，并建立多个专业化的医院抗药性检测网，而兽医抗药性研究和检测开展较迟，至今没有完善的检测技术体系和网络。

目前，我国兽医抗药性检测面临的问题是：①抗药性水平较高，无法直接采用国际标准，需要根据实际抗药性水平确定用药剂量；②缺乏统一检测体系：检测方法粗放，数据碎片化；③采样难：养殖场因防疫限制，外人进入采样困难；④采样贵：养殖场分散偏僻，直接采样检测耗费人力物力巨大；⑤统计难：检测与数据库分离，数据难以自动准确汇集、统计。这些问题导致养殖场、兽药厂和监管部门无法动态获得确切的抗药性流行数据。

技术实现要素：

本发明针对现有兽医抗药性检测面临的问题，研制一种细菌抗药性检测系统及其操作方法，本发明利用细菌接种仪、图像采集转换仪，结合数据库技术和网络技术建立细菌抗药性检测系统。

本发明解决技术问题的技术方案为：一种细菌抗药性检测系统，包括药敏试验接种仪、药敏试验图像采集转换仪、药敏检测盒、菌株培养器，药敏检测盒中设置有培养基，药敏试验接种仪向药敏检测盒中接种菌株，菌株培养器为药敏检测盒中的菌株提供生长环境，药敏试验图像采集转换仪用于采集转换药敏检测盒中的菌株图像，药敏试验图像采集转换仪中设置有管理软件，该管理软件与网络连通。

作为优化，所述的药敏试验接种仪包括接种板、移动载板、竖直导杆、底座，所述移动载板、竖直导杆安装在底座上，接种板上设置有多根接种针，接种板安装在竖直导杆上，移动载板设置在接种板下方，移动载板上设置有菌种板、药敏检测盒，移动载板设置两固定点，移动载板位于两固定点时，菌种板、药敏检测盒分别与接种板对应。

作为优化，所述竖直导杆上安装有导套，接种板安装在导套上，导套上安装有转接板，接种板通过手动连接机构安装在转接板上，所述手动连接机构包括旋转轴、压板、压头，旋转轴安装在转接板上，压板的一端连接旋转轴且可绕旋转轴旋转，压头安装在压板的另一端，压头为旋转柱塞或带螺纹的滚珠弹簧锁销；旋转轴与转接板之间固定，压板与旋转轴之间活动或旋转轴与转接板之间活动，压板与旋转轴之间固定；接种板上设置有与压头对应的定位孔。

作为优化，所述竖直导杆上位于接种板的下方设置有弹簧；竖直导杆、导套、转接板、手动连接机构设置两组，接种板位于两转接板之间，两竖直导杆通过顶部的横向板连接，两导套通过连接板连接，连接板上设置有操作手柄，操作手柄的手柄部分高于横向板，横向板上设置有手柄让位孔；接种板的下方设置有限位销。

作为优化，所述的药敏试验图像采集转换仪包括壳体、显示屏、图像采集室、控制板、图像采集转换装置，其中显示屏安装在壳体上，控制板、图像采集转换装置、图像采集室设置在壳体内部，药敏检测盒放置在图像采集室中，图像采集转换装置与图像采集室对应，控制板上设置有控制器，图像采集转换装置的数据输出端口连接控制器的数据接收端口，显示屏连接控制器。

作为优化，所述的图像采集转换装置包括扫描仪、光源，扫描仪、光源分别置于药敏检测盒的下方、上方，药敏检测盒为透明材质，扫描仪、光源连接控制器。

作为优化，所述的图像采集转换装置为感光器，感光器连接控制器，感光器为CCD感光器或CMOS感光器。

一种细菌抗药性检测系统的操作方法，包括以下步骤：样品采集a、菌株分离b、接种c、菌株培养d、信息采集e、数据库分析f、信息监测反馈g；其中信息采集e、数据库分析f、信息监测反馈g通过管理软件实现。

一种细菌抗药性检测系统的操作方法，包括以下步骤：

第一步、打开管理软件，进入检测平台：新建一个检测项目，包括具体的地点、时间、动物、采样部位、菌种、抗生素及其梯度等，抗生素及其梯度、菌种有默认的顺序；

第二步、制备菌种板：

纯化鉴定的菌株，在MHA固体培养基上划线培养，12～24小时后选择典型单菌落转移到含有1ml无菌生理盐水的2ml离心管中，震荡分散，用移液器吸取200μl至菌种板中，每个菌株占用一个孔，菌液中细菌数量控制在十万到一千万个（10⁵-10⁷）；待测病原菌若为保藏菌种，需要提前一天进行复苏活化，这个过程中，需要保证接种环、离心管、生理盐水、移液器枪头无菌，在酒精灯火焰周围即可操作；

菌种板中取两孔依次放入两个重复的质控菌株，作为阳性对照和质量控制；一孔放入无菌生理盐水作为阴性对照；其他孔放入分离纯化的病原菌，按照坐标位置记录各菌株的编号，与软件中生成的编号一致；

第三步、制备不同种类抗生素及其不同梯度的药物检测板：

药物检测板与菌种板外形尺寸相同，用50ml玻璃瓶装MH琼脂培养基18ml，灭菌，冷却到45-50℃，加入特定浓度抗生素溶液2ml，上下颠倒混匀，避免产生气泡，倾倒入检测板，轻轻晃动覆盖底部，水平放置，充分冷却凝固，加盖；

特定浓度的抗生素溶液可以在无菌培养皿中用无菌水进行倍比稀释，围绕CLSI临界值R或者临床推荐剂量，配置1/4、1/2、1、2、4倍剂量的5个梯度或更多个梯度，以便检测在哪一种抗生素的哪一个梯度的培养基中接种的细菌形成菌落，每种抗生素的多个梯度按顺序为一摞；配置一个无药检测板作对照，以确定每孔中都接种了菌株；

第二步和第三步可同时或穿插进行；

第四步、用药敏试验接种仪转接菌液：

第五步、菌落培养：

药物检测板充分吸收接种液后，将所有药物检测板倒置，37℃培养12-24小时，保证未被抑制的菌株充分形成菌落；

第六步、图像采集和MIC统计分析：

按照软件中出现的药物，并按照药物检测板的实际梯度，依次将培养后的药物检测板放在药敏试验图像采集转换仪内，点击软件的扫描按钮，扫描采集图像；

软件将根据图像中每个接种点形成的菌落的像素数量，判断有无菌落生长，自动统计形成MIC频率分布，以表格和柱形图显示，可以导出为检测报告，结合制剂和给药方式，确定临床剂量，用于防治相应的细菌病；

第七步、公共查询：

药敏试验结果能够直接指导现场确定临床剂量，除此以外还可以汇集到公共数据库，形成区域抗药性分布图，便于行业内养殖场较为统一地使用当地敏感的药物，减少抗生素滥用。

一种细菌抗药性检测系统的操作方法，包括以下步骤：

第一步、打开管理软件，进入检测平台：新建一个检测项目，包括具体的地点、时间、动物、采样部位、菌种、抗生素检测板等；抗生素及其梯度、菌种有默认的顺序；

第二步、制备96孔药敏试验板：

一般采用“多药对一菌”模式，按照CLSI标准的临界值R设定的抗生素种类和浓度范围，在试管中用MHB肉汤溶解和稀释抗生素；也可以设置较宽范围的抗生素梯度，测定具体的MIC；此外，为了适应检测样本会分离出多种细菌，药敏检测板可以采用“多菌对一药”模式，设置一种抗生素的12个梯度（列），每排接种一种细菌；

在无菌的一次性的圆底96孔板，设置各种抗生素及其浓度的孔位置，每孔50ul；其中，96孔药敏试验板中留四个孔为空孔和无药缓冲液孔；

然后，在无菌的洁净环境中，冷冻干燥，或者常温下风干；单块盖上盖子，或者多块（一般5块）药敏试验板摞起，最上面的盖上盖子，真空塑料包装；配置4片无菌塑料膜，装入塑料袋中，发送到用户实验室；

第三步、制备待测菌株的菌液：

纯化鉴定的菌株，在MHA固体培养基上划线培养，12-24小时后选择4-5个典型单菌落转移到含有12ml无菌生理盐水的50ml离心管中，震荡分散，倒入9cm直径的培养皿中，每毫升菌液中细菌数量控制在十万到一千万个（10⁵-10⁷）；待测病原菌若为保藏菌种，需要提前一天进行复苏活化；这个过程中，需要保证接种环、离心管、生理盐水、移液器枪头无菌，在超净工作台内操作；记录各菌株的编号，与软件中生成的编号一致；

第四步、用移液器转接菌液：

“多药对一菌”模式，用8道移液器从培养皿中吸取100μl菌液，依次靠在1-12列的孔上沿加入菌液，不要接触孔中药物；其中两孔没有药物，加入无菌水作为阴性对照，另取两孔不加药物，加入缓冲液作为阳性对照；全部加完，换枪头；再从另外培养皿吸取制作另一株细菌的菌液，依次加入另一块药敏试验板的每列孔中；

“多菌对一药”模式，则用12道移液器逐排加入各自菌液；最后一列4个孔为质控对照；

摞起各药敏试验板，盖上盖子培养；或者每块药敏试验板盖上一片无菌塑料膜，单独培养；

第五步、培养：

将所有药物试验板正置，37℃培养8-12小时，保证未被抑制的菌株充分形成浑浊，沉积在孔底；

第六步、图像采集和MIC统计分析：

按照软件中菌株顺序，依次将培养后的药物检测板放在图像采集转换仪的滑动板槽内，推入转换仪，点击软件的扫描按钮，获取图像；

软件将根据图像中每孔底部形成的菌体沉淀图像的像素数量，判断有无菌生长，自动统计形成MIC频率分布，以表格和柱形图显示，可以导出为检测报告；

第七步、公共查询：

药敏试验结果能够直接指导确定临床剂量，除此以外还可以汇集到公共数据库，形成区域抗药性分布图，便于行业内养殖场较为统一地使用当地敏感的药物，减少抗生素滥用。

本发明的有益效果：

1．本发明线上线下结合，线下各监测点采用菌种板、药物检测板、管理软件、药敏试验图像采集转换仪、药敏试验接种仪，完成样品采集、菌株分离、药敏试验，直接指导临床用药；线上online的管理软件完成信息采集、数据库分析、信息监测反馈，实现抗药性监测数据共享。与触屏电脑、网站和数据库结合，实现了智能化操作和检测结果的即时上传汇总统计，在满足现场检测需要的同时，方便养殖场、兽药厂和管理部门的数据分析和决策。定量测定MIC，给出MIC频率分布，适应我国目前较高水平的抗药性现状，满足抗药性定量的网络化监测需要；兼顾肉汤稀释法与琼脂稀释法，适应大规模监测与零散样品检测的不同需要。

2．通过将接种板安装在竖直导杆上，能够保证接种板与菌种板、药敏检测盒的平行度，从而保证各接种针接种量均匀、接种针充分接触药敏检测盒中的培养基，保障了试验结果的准确性。

3．接种板通过活动连接机构安装在转接板上，可以直接手动实现接种板的安装与拆卸，方便了设备消毒工作的进行。当压头为旋转柱塞时通过提起压头可拆装接种板，当压头为带螺纹的滚珠弹簧锁销时，直接旋转压板即可拆装接种板，无需借助工具，完全手动即可方便的实现接种板的安装与拆卸，方便了设备消毒工作的进行。

附图说明

图1为本发明药敏试验接种仪的正视图。

图2为本发明药敏试验接种仪的右视图。

图3为本发明药敏试验接种仪的总体结构图。

图4为图3A区域的局部放大图。

图5为药敏试验图像采集转换仪一种实施例的总体结构图。

图6为药敏试验图像采集转换仪一种实施例隐藏部分壳体后的总体结构图。

图7为药敏试验图像采集转换仪另一种实施例的总体结构图。

图8为药敏试验图像采集转换仪另一种实施例隐藏部分壳体后的总体结构图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合附图来详细解释本发明的实施方式。

图1至图6为本发明的一种实施例，一种细菌抗药性检测系统，包括药敏试验接种仪、药敏试验图像采集转换仪、药敏检测盒、菌株培养器，药敏检测盒中设置有培养基，药敏试验接种仪向药敏检测盒中接种菌株，菌株培养器为药敏检测盒中的菌株提供生长环境，药敏试验图像采集转换仪用于采集转换药敏检测盒中的菌株图像，药敏试验图像采集转换仪中设置有管理软件，该管理软件与网络连通。该管理软件已获得软件著作权，名称：“96点阵药物试验图像采集系统VL.0”，证书号：软著登字第1200574号，登记号：2016SR021957。点面结合，线上线下结合，线下各监测点采用菌种板、药物检测板、管理软件、药敏试验图像采集转换仪、药敏试验接种仪，完成样品采集、菌株分离、药敏试验，直接指导临床用药；线上online的管理软件完成信息采集、数据库分析、信息监测反馈，实现抗药性监测数据共享。与触屏电脑、网站和数据库结合，实现了智能化操作和检测结果的即时上传汇总统计，在满足现场检测需要的同时，方便养殖场、兽药厂和管理部门的数据分析和决策。定量测定MIC，给出MIC频率分布，适应我国目前较高水平的抗药性现状，满足抗药性定量的网络化监测需要；兼顾肉汤稀释法与琼脂稀释法，适应大规模监测与零散样品检测的不同需要。

如图1至图4所示，所述的药敏试验接种仪包括接种板1、移动载板2、竖直导杆3、底座10，所述移动载板2、竖直导杆3安装在底座10上，接种板1上设置有多根接种针，接种板1安装在竖直导杆3上，移动载板2设置在接种板1下方，移动载板2上设置有菌种板4、药敏检测盒5，移动载板2设置两固定点，移动载板2位于两固定点时，菌种板4、药敏检测盒5分别与接种板1对应。通过将接种板1安装在竖直导杆3上，能够保证接种板1与菌种板4、药敏检测盒5的平行度，从而保证各接种针接种量均匀、接种针充分接触药敏检测盒5中的培养基，保障了试验结果的准确性。

所述竖直导杆3上安装有导套6，接种板1安装在导套6上，导套6上安装有转接板7，接种板1通过手动连接机构8安装在转接板7上，所述手动连接机构8包括旋转轴801、压板802、压头803，旋转轴801安装在转接板7上，压板802的一端连接旋转轴801且可绕旋转轴801旋转，压头803安装在压板802的另一端，压头803为旋转柱塞或带螺纹的滚珠弹簧锁销；旋转轴801与转接板7之间固定，压板802与旋转轴801之间活动或旋转轴801与转接板7之间活动，压板802与旋转轴801之间固定；接种板1上设置有与压头803对应的定位孔。接种板1通过活动连接机构8安装在转接板7上，可以直接手动实现接种板1的安装与拆卸，方便了设备消毒工作的进行。当压头803为旋转柱塞时通过提起压头803可拆装接种板1，当压头803为带螺纹的滚珠弹簧锁销时，直接旋转压板802即可拆装接种板1，无需借助工具，完全手动即可方便的实现接种板1的安装与拆卸，方便了设备消毒工作的进行。

所述竖直导杆3上位于接种板1的下方设置有弹簧9；竖直导杆3、导套6、转接板7、手动连接机构8设置两组，接种板1位于两转接板7之间，两竖直导杆3通过顶部的横向板11连接，两导套6通过连接板12连接，连接板12上设置有操作手柄13，操作手柄13的手柄部分高于横向板11，横向板11上设置有手柄让位孔；接种板1的下方设置有限位销14。

如图5、图6所示，所述的药敏试验图像采集转换仪包括壳体21、显示屏22、图像采集室23、控制板24、图像采集转换装置，其中显示屏22安装在壳体21上，控制板24、图像采集转换装置、图像采集室23设置在壳体21内部，药敏检测盒5放置在图像采集室23中，图像采集转换装置与图像采集室23对应，控制板24上设置有控制器，图像采集转换装置的数据输出端口连接控制器的数据接收端口，显示屏22连接控制器。

所述的图像采集转换装置包括扫描仪25、光源26，扫描仪25、光源26分别置于药敏检测盒5的下方、上方，药敏检测盒5为透明材质，扫描仪25、光源26连接控制器。

图7、图8为药敏试验图像采集转换仪的另一种实施例，其与第一种实施例的区别在于：所述的图像采集转换装置为感光器28，感光器28连接控制器，感光器28为CCD感光器或CMOS感光器。

一种细菌抗药性检测系统的操作方法，包括以下步骤：样品采集a、菌株分离b、接种c、菌株培养d、信息采集e、数据库分析f、信息监测反馈g；其中信息采集e、数据库分析f、信息监测反馈g通过管理软件实现。

图7、图8为本发明的另一种实施例，其与第一实施例的区别在于。

一种细菌抗药性检测系统的操作方法，包括以下步骤：

第一步、打开管理软件，进入检测平台：新建一个检测项目，包括具体的地点、时间、动物、采样部位、菌种、抗生素及其梯度等，抗生素及其梯度、菌种有默认的顺序；

第二步、制备菌种板：

纯化鉴定的菌株，在MHA固体培养基上划线培养，12～24小时后选择典型单菌落转移到含有1ml无菌生理盐水的2ml离心管中，震荡分散，用移液器吸取200μl至菌种板中，每个菌株占用一个孔，菌液中细菌数量控制在十万到一千万个（10⁵-10⁷）；待测病原菌若为保藏菌种，需要提前一天进行复苏活化，这个过程中，需要保证接种环、离心管、生理盐水、移液器枪头无菌，在酒精灯火焰周围即可操作；

菌种板中取两孔依次放入两个重复的质控菌株，作为阳性对照和质量控制；一孔放入无菌生理盐水作为阴性对照；其他孔放入分离纯化的病原菌，按照坐标位置记录各菌株的编号，与软件中生成的编号一致；

第三步、制备不同种类抗生素及其不同梯度的药物检测板：

药物检测板与菌种板外形尺寸相同，用50ml玻璃瓶装MH琼脂培养基18ml，灭菌，冷却到45-50℃，加入特定浓度抗生素溶液2ml，上下颠倒混匀，避免产生气泡，倾倒入检测板，轻轻晃动覆盖底部，水平放置，充分冷却凝固，加盖；

特定浓度的抗生素溶液可以在无菌培养皿中用无菌水进行倍比稀释，围绕CLSI临界值R或者临床推荐剂量，配置1/4、1/2、1、2、4倍剂量的5个梯度或更多个梯度，以便检测在哪一种抗生素的哪一个梯度的培养基中接种的细菌形成菌落，每种抗生素的多个梯度按顺序为一摞；配置一个无药检测板作对照，以确定每孔中都接种了菌株；

第二步和第三步可同时或穿插进行；

第四步、用药敏试验接种仪转接菌液：

第五步、菌落培养：

药物检测板充分吸收接种液后，将所有药物检测板倒置，37℃培养12-24小时，保证未被抑制的菌株充分形成菌落；

第六步、图像采集和MIC统计分析：

按照软件中出现的药物，并按照药物检测板的实际梯度，依次将培养后的药物检测板放在药敏试验图像采集转换仪内，点击软件的扫描按钮，扫描采集图像；

软件将根据图像中每个接种点形成的菌落的像素数量，判断有无菌落生长，自动统计形成MIC频率分布，以表格和柱形图显示，可以导出为检测报告，结合制剂和给药方式，确定临床剂量，用于防治相应的细菌病；

第七步、公共查询：

药敏试验结果能够直接指导现场确定临床剂量，除此以外还可以汇集到公共数据库，形成区域抗药性分布图，便于行业内养殖场较为统一地使用当地敏感的药物，减少抗生素滥用。

一种细菌抗药性检测系统的操作方法，包括以下步骤：

第一步、打开管理软件，进入检测平台：新建一个检测项目，包括具体的地点、时间、动物、采样部位、菌种、抗生素检测板等；抗生素及其梯度、菌种有默认的顺序；

第二步、制备96孔药敏试验板：

一般采用“多药对一菌”模式，按照CLSI标准的临界值R设定的抗生素种类和浓度范围，在试管中用MHB肉汤溶解和稀释抗生素；也可以设置较宽范围的抗生素梯度，测定具体的MIC；此外，为了适应检测样本会分离出多种细菌，药敏检测板可以采用“多菌对一药”模式，设置一种抗生素的12个梯度（列），每排接种一种细菌；

在无菌的一次性的圆底96孔板，设置各种抗生素及其浓度的孔位置，每孔50ul；其中，96孔药敏试验板中留四个孔为空孔和无药缓冲液孔；

然后，在无菌的洁净环境中，冷冻干燥，或者常温下风干；单块盖上盖子，或者多块（一般5块）药敏试验板摞起，最上面的盖上盖子，真空塑料包装；配置4片无菌塑料膜，装入塑料袋中，发送到用户实验室；

第三步、制备待测菌株的菌液：

纯化鉴定的菌株，在MHA固体培养基上划线培养，12-24小时后选择4-5个典型单菌落转移到含有12ml无菌生理盐水的50ml离心管中，震荡分散，倒入9cm直径的培养皿中，每毫升菌液中细菌数量控制在十万到一千万个（10⁵-10⁷）；待测病原菌若为保藏菌种，需要提前一天进行复苏活化；这个过程中，需要保证接种环、离心管、生理盐水、移液器枪头无菌，在超净工作台内操作；记录各菌株的编号，与软件中生成的编号一致；

第四步、用移液器转接菌液：

“多药对一菌”模式，用8道移液器从培养皿中吸取100μl菌液，依次靠在1-12列的孔上沿加入菌液，不要接触孔中药物；其中两孔没有药物，加入无菌水作为阴性对照，另取两孔不加药物，加入缓冲液作为阳性对照；全部加完，换枪头；再从另外培养皿吸取制作另一株细菌的菌液，依次加入另一块药敏试验板的每列孔中；

“多菌对一药”模式，则用12道移液器逐排加入各自菌液；最后一列4个孔为质控对照；

摞起各药敏试验板，盖上盖子培养；或者每块药敏试验板盖上一片无菌塑料膜，单独培养；

第五步、培养：

将所有药物试验板正置，37℃培养8-12小时，保证未被抑制的菌株充分形成浑浊，沉积在孔底；

第六步、图像采集和MIC统计分析：

按照软件中菌株顺序，依次将培养后的药物检测板放在图像采集转换仪的滑动板槽内，推入转换仪，点击软件的扫描按钮，获取图像；

软件将根据图像中每孔底部形成的菌体沉淀图像的像素数量，判断有无菌生长，自动统计形成MIC频率分布，以表格和柱形图显示，可以导出为检测报告；

第七步、公共查询：

药敏试验结果能够直接指导确定临床剂量，除此以外还可以汇集到公共数据库，形成区域抗药性分布图，便于行业内养殖场较为统一地使用当地敏感的药物，减少抗生素滥用。

上述虽然结合附图对发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。