本发明属于生物检测领域，具体涉及一种聚多巴胺修饰的离心管及其制备方法和在核酸分离中的应用。
背景技术：
在聚合酶链式反应(PCR)技术中，高质量的核酸(DNA)模板对于PCR的正常进行起着非常重要的作用，因此对于DNA提取方法的探究非常必要。
酚-氯仿法是传统的DNA提取方法，但这种方法操作步骤复杂，耗时长，涉及多步的离心，会由于剪切力对DNA产生损伤，而且不适于自动化和微型化，同时需使用酚、氯仿等高毒性的试剂。
基于硅基质的固相萃取方法虽然操作简单，能够省去一些有毒有机溶剂的使用，但由于其固液分离仍然依靠多步离心导致其耗时，而且也容易对DNA造成损伤；另外聚乙二醇(PEG)和高盐的加入会使得溶液黏度变大而降低DNA回收率。
基于磁性材料的磁性固相萃取技术避免了离心分离步骤产生的剪切力而使DNA降解的可能性，但作为固相吸附剂的磁性微粒需要通过外加磁场实现分离。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺陷，本发明的首要目的在于提供一种聚多巴胺修饰的离心管的制备方法，该方法基于多巴胺的自聚和聚多巴胺(PDA)的粘附能力在弱碱性溶液中通过过硫酸铵提供氧气制备了聚多巴胺修饰离心管，该制备方法简单，条件温和，重现性好。
本发明的另一目的在于提供由上述方法制得的聚多巴胺修饰的离心管。
本发明的再一目的在于提供上述的聚多巴胺修饰的离心管在核酸分离中的应用。以聚多巴胺修饰的离心管为吸附材料，利用PDA的结构特点，通过调节溶液的酸度实现对核酸的分离和富集，该方法具有很强的通用性和可操作性，实用价值高。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种聚多巴胺修饰的离心管的制备方法，包括以下步骤：
将盐酸多巴胺和过硫酸铵溶解在碱性溶液中，混合均匀，制得多巴胺悬浮液；将多巴胺悬浮液加入离心管中，在摇床上振荡反应，在离心管壁上会形成聚多巴胺薄膜；将多巴胺悬浮液倒出后，离心管内部用40℃氮气烘干，这是加强PDA涂层的稳定性；再依次用三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液和去离子水洗涤，以除去残留的未反应物，最后经40℃氮气烘干，得到聚多巴胺修饰的离心管；
所述盐酸多巴胺与过硫酸铵的质量比为(2.5～10):1；盐酸多巴胺与碱性溶液的质量体积比为0.5～2.0mg:1mL；
所述的碱性溶液为Tris-HCl缓冲液，其pH值为7.5～9.5；Tris-HCl缓冲液中三羟甲基氨基甲烷的浓度为10～40mmol/L；
所述振荡反应优选在25～50℃下振荡反应8～24h，转速为0～150rpm。
由上述方法制得的聚多巴胺修饰的离心管可用于核酸分离。通过调节核酸吸附和洗脱溶液的酸度，该离心管可以对核酸进行吸附和洗脱，从而实现对核酸的分离和富集，具有很强的通用性和可操作性，实用价值高。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明的聚多巴胺修饰的离心管以聚多巴胺涂层为载体吸附DNA，利用聚多巴胺与DNA的静电吸附作用，只需要在离心管中就可以实现对核酸的抓取，再通过静电排斥作用对所吸附的DNA进行洗脱，最后通过PCR扩增和电泳检测来对所提取的DNA进行评价。该离心管的普适性和实用性为DNA提取提供了一种便捷的方法。
2、本发明的聚多巴胺修饰的离心管极大地简化了目前DNA提取的过程，优于传统的酚-氯仿法和商业化的试剂盒提取方法，在提取过程中不使用任何有毒的有机试剂，也无需繁琐的离心步骤，同时无需磁固相萃取技术中的外加磁场。此外，吸附和洗脱缓冲液的组成都很简单，整个吸附及洗脱过程都是在室温下(25℃)完成的，无须加热到较高温度。将聚多巴胺修饰离心管提取DNA过程与PCR扩增和凝胶电泳检测相结合，可以实现快速地对样品中致病菌的检测。
3、本发明中，离心管内形成的聚多巴胺涂层具有极强的粘附能力，除强碱性水溶液(pH>13)以外，PDA涂层在大多数环境中都能表现出良好的长期稳定性，这是传统涂覆改性技术所无法实现的。
附图说明
图1是聚多巴胺修饰的离心管提取的DNA经PCR后的琼脂糖凝胶电泳图(泳道1为标准DNA片段；泳道2、7、12为裂解液的扩增结果；泳道3、8、13为空白对照；泳道4、5、6、9、10、11、14、15、16为聚多巴胺修饰的离心管提取的细菌DNA模板的PCR产物)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
以下以聚多巴胺修饰的离心管提取Escherichia coli O157:H7基因组DNA为例，来阐述应用本发明进行实际样品检测的过程。
步骤1：聚多巴胺修饰离心管的制备
准确称取20mg盐酸多巴胺和8mg过硫酸铵，依次加入20mL 10mmol/L Tris-HCl缓冲液中(pH值8.5，其中三羟甲基氨基甲烷的浓度为20mmol/L)混合均匀，然后将制得的混合液迅速加入离心管中，在100rpm和40℃条件下摇床上振荡反应12h。将经过上述处理的离心管放入40℃烘箱中进行氮气烘干，然后依次用10mmol/L Tris-HCl缓冲液中(pH值7.0)和去离子水洗涤，再放入40℃烘箱中进行氮气烘干。
步骤2：提取DNA
取1.5mL细菌培养液，10000rpm离心1min，将细菌与培养基分离。随后向菌体沉淀中加入400μL裂解液(40mmol/L Tris-CH3COOH，20mmol/L NaAc，1mmol/L EDTA，1％SDS，pH值7.8)，37℃水浴孵育1h，为保证裂解效果在孵育期间需不时的震荡。然后，向其中加入3μL核糖核苷酸酶溶液(10mg/mL)，37℃水浴孵育15min。孵育完成后，向其中加入200μL NaCl(5.0mol/L)充分混合，将混合液4℃离心(10000rpm)20min。然后，取300μL上清液(细菌裂解液)，并加入700μL吸附液(10mmol/L MES-HCl，pH值2.0)，充分混合后，加入到步骤1制备的聚多巴胺修饰的离心管中。将混合液在室温下轻轻震荡孵育10min后，将上清液小心地移出。将聚多巴胺修饰的离心管用70％的乙醇(V/V)洗两次，在室温下放置干燥。然后向其中加入100μL洗脱液(10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA，pH值8.0)，室温下轻轻震荡孵育10min，使吸附的DNA从管壁上洗脱下来。将上清液小心地移出，转移到一个新的离心管中，4℃封存待用。
步骤3：PCR扩增实验
PCR扩增过程中用到的试剂包括：5μL DNA模板，2×PCR buffer，1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTP混合液，0.4mmol/L上下游引物，0.2U/μL Taq DNA聚合酶，总的反应体积为25μL。选取的上下游引物是针对E.coli O157:H7的毒力基因rfbE设计的，其目标扩增片段大小为168bp。上下游引物的序列如下：
上游引物：5′‐CAGTTTACCAACCGTCAT-3′
下游引物：5′-GAGCAACCGTTCCATTAC-3′
PCR反应在PCR扩增仪上进行。具体的扩增过程为反应液首先在94℃预变性3min，然后按以下条件进行循环反应：变性(94℃，30s)，退火(56℃，30s)，延伸(72℃，30s)，循环40次后，再延伸3min。反应结束后，将PCR产物置于4℃环境保存待用。
步骤4：琼脂糖凝胶电泳检测
配制1％琼脂糖凝胶，取8μL PCR产物，加入加样缓冲液2μL混匀，以GeneRuler100bp DNAladder作为参照，100V恒压电泳30min。凝胶经SYBR Green I染色后，用凝胶成像系统成像，结果见图1。
通过对比泳道1的标准DNA片段，泳道2的裂解液扩增结果和泳道3的空白对照均未得到明显的目的扩增条带(暗带为引物二聚体条带)，而泳道4、5、6为聚多巴胺修饰离心管提取的E.coli O157:H7DNA模板的PCR产物，可以看到明亮的扩增条带，大小为168bp。说明本发明的聚多巴胺修饰的离心管可成功地用于DNA的提取分离。
实施例2
以下以聚多巴胺修饰的离心管提取Listeria monocytogenes基因组DNA为例，来阐述应用本发明进行实际样品检测的过程。
步骤1：聚多巴胺修饰离心管的制备
准确称取40mg盐酸多巴胺和8mg过硫酸铵，依次加入20mL 20mmol/L Tris-HCl缓冲液中(pH值7.5，其中三羟甲基氨基甲烷的浓度为40mmol/L)混合均匀，然后将制得的混合液迅速加入离心管中，在25℃条件下摇床振荡反应24h。将经过上述处理的离心管放入40℃烘箱中进行氮气烘干，然后依次用10mmol/L Tris-HCl缓冲液中(pH值7.0)和去离子水洗涤，再放入40℃烘箱中进行氮气烘干。
步骤2：提取DNA
细菌裂解步骤同实施例1。然后，取200μL上清液(细菌裂解液)，并加入700μL吸附液(10mmol/L MES-HCl，pH值2.0)，充分混合后，加入步骤1制备的聚多巴胺修饰离心管中。吸附和洗脱步骤同实施例1。
步骤3：PCR扩增实验
PCR扩增过程中用到的试剂除了引物外，其他的均同实施例1。选取的上下游引物是针对L.monocytogenes的毒力基因hlyA设计的，其目标扩增片段大小为106bp。上下游引物的序列如下：
上游引物：5′‐GGGAAATCTGTCTCAGGTGATGT-3′
下游引物：5′-CGATGATTTGAACTTCATCTTTTGC-3′
PCR反应条件同实施例1
步骤4：琼脂糖凝胶电泳检测同实施例1
结果见图1。通过对比泳道1的标准DNA片段，泳道7的裂解液扩增结果和泳道8的空白对照均未得到明显的目的扩增条带(暗带为引物二聚体条带)，而泳道9、10、11为聚多巴胺修饰离心管提取的L.monocytogenes DNA模板的PCR产物，可以看到明亮的扩增条带，大小为106bp。说明本发明的聚多巴胺修饰的离心管可成功地用于DNA的提取分离。
实施例3
以下以聚多巴胺修饰的离心管提取Staphylococcus aureus基因组DNA为例，来阐述应用本发明进行实际样品检测的过程。
步骤1：聚多巴胺修饰离心管的制备
准确称取20mg盐酸多巴胺和2mg过硫酸铵，依次加入40mL 40mmol/L Tris-HCl缓冲液中(pH值9.5，其中三羟甲基氨基甲烷的浓度为10mmol/L)混合均匀，然后将制得的混合液迅速加入离心管中，在25℃条件下摇床振荡反应8h。将经过上述处理的离心管放入40℃烘箱中进行氮气烘干，然后依次用10mmol/L Tris-HCl缓冲液中(pH值7.0)和去离子水洗涤，再放入40℃烘箱中进行氮气烘干。
步骤2：提取DNA
细菌裂解步骤同实施例1。然后，取225μL上清液(细菌裂解液)，并加入750μL吸附液(10mmol/L MES-HCl，pH值2.0)，充分混合后，加入步骤1制备的聚多巴胺修饰离心管中。吸附和洗脱步骤同实施例1。
步骤3：PCR扩增实验
PCR扩增过程中用到的试剂除了引物外，其他的均同实施例1。选取的上下游引物是针对S.enterica的16S rRNA基因设计的，其目标扩增片段大小为177bp。上下游引物的序列如下：
上游引物：5′‐AAGAAGTGGGCGAACGCTTA-3′
下游引物：5′-ACGGTTCAGTTCTCTGCATCA-3′
PCR反应条件同实施例1。
步骤4：琼脂糖凝胶电泳检测同实施例1
结果见图1。通过对比泳道1的标准DNA片段，泳道12的裂解液扩增结果和泳道13的空白对照均未得到明显的目的扩增条带(暗带为引物二聚体条带)，而泳道14、15、16为聚多巴胺修饰离心管提取的S.enterica DNA模板的PCR产物，可以看到明亮的扩增条带，大小为177bp。说明本发明的聚多巴胺修饰的离心管可成功地用于DNA的提取分离。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南师范大学
<120> 聚多巴胺修饰的离心管及其制法和在核酸分离中的应用
<130> 20161209
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 上游引物
<400> 1
cagtttacca accgtcat 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 下游引物
<400> 2
gagcaaccgt tccattac 18
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 上游引物
<400> 3
gggaaatctg tctcaggtga tgt 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 下游引物
<400> 4
cgatgatttg aacttcatct tttgc 25
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 上游引物
<400> 5
aagaagtggg cgaacgctta 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 下游引物
<400> 6
acggttcagt tctctgcatc a 21