本发明涉及将微流控芯片技术应用到组织仿生以及实时监测的细胞生物学研究的技术领域，具体涉及一种基于微流控芯片的肿瘤内渗模型的建立方法及应用。
背景技术：
肿瘤脑转移是一个复杂的生理过程，肿瘤细胞从病灶部位远端转移包括多个步骤，如肿瘤细胞从肿瘤组织脱离、原位生长与增殖、侵袭并外渗、穿过血管壁进入循环系统、粘附血管壁、内渗进入远端的另一种组织或器官，每一个步骤都离不开肿瘤微环境的调节与支持。在肿瘤相关疾病致死病例中，转移性肿瘤的致死率高达90％，并且临床统计表明，肺癌的转移率和致死率是最高的。由于肿瘤转移过程的复杂性和宽泛性，以及参与其中的肿瘤微环境的多样性，近年来，许多研究人员付出了大量的努力来研究和探索原发性肿瘤转移的特殊过程以及相应的肿瘤微环境。结果表明，慢性炎症是影响肿瘤微环境最直接的因素，并能够进一步调控肿瘤转移。在复杂的转移过程中，肿瘤细胞转移至炎症损伤的血管部位并发生粘附被认为是肿瘤转移的早期关键步骤，然而，很少有合适的体外模型和系统能够重现或再建这一过程。因此，建立一种合适的模型来模拟炎症血管系统中肿瘤细胞的粘附行为是当前肿瘤转移研究的首要任务。
微流控芯片实验室又称芯片实验室或微流控芯片，指的是把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测、细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规化学或生物实验室的各种功能的一种技术。微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种细胞功能研究等特点而成为新一代生物仿生和细胞研究的重要平台。目前，利用微流控芯片进行组织工程的模拟，尤其是脑微血管炎症的模拟以及循环肿瘤细胞在炎症部位的运动特征研究分析还处于空白阶段。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种基于微流控芯片的脑微血管炎症模型的建立方法及应用，并应用于肺癌细胞在病变部位运动特征的研究，该方法具有对细胞运动实时监测的特点，同时能够实现对细胞运动速度和轨迹的准确表征。
本发明提供了一种微流控芯片，该微流控芯片主要由细胞入口、细胞培养室和废液出口组成，细胞培养室上连细胞入口，细胞培养室下连废液出口。
本发明提供的微流控芯片，该微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为浓硫酸煮过的洁净玻璃。所述微流控芯片的上下两层分别进行紫外过夜照射的灭菌处理，然后等离子体处理60s进行封接。
一种基于微流控芯片的脑微血管炎症模型的建立方法，采用上述微流控芯片，按照以下步骤进行如下：
(1)芯片修饰
将配制好的0.1mg/mL胶原工作液经由细胞入口加入芯片，将固定芯片的培养皿常温静置12-36小时，随后移除胶原工作液，细胞培养液冲洗通道2-4次，对通道底面进行修饰；
(2)芯片内细胞的接种与培养
提取纯化原代大鼠脑微血管内皮细胞，消化调整至1×105-5×105cells/mL，经由细胞入口加入到芯片中，细胞迅速贴壁并均匀铺展于细胞培养室底面，当在光学显微镜下观察到细胞在细胞培养室中均匀分布时，立即将芯片移入二氧化碳培养箱中继续培养；
(3)炎症脑微血管模型的建立
待脑微血管内皮细胞经过增殖完全铺满细胞培养室底面后，经由细胞入口向通道中加入以细胞培养液配制的10μMTNF-α溶液，并继续培养24小时，使脑微血管内皮细胞对TNF-α分子产生相应，模拟脑微血管炎症模型。
一种基于微流控芯片的脑微血管炎症模型的应用，该模型用于脑微血管炎症模型的肿瘤内渗研究，方法过程如下：
(1)细胞灌注
将肺癌细胞(A549细胞)消化调整至1×105-5×105cells/mL，经由细胞入口灌注到芯片中，调整灌流速度，使得流体剪切力大小为1dyne/cm2。通过屏幕录像软件记录A549细胞在脑微血管内皮细胞表面的滚动和黏附现象；以无细胞培养液连续灌流10分钟，选择6个随机区域拍照，统计分析紧密粘附的A549细胞数。
(2)粘附抑制
将肺癌细胞(A549细胞)消化调整至1×105-5×105cells/mL，同时加入Y27632，终浓度为10nM，以同样方法灌注并统计分析紧密粘附的A549细胞数。
本发明建立的脑微血管炎症模型的芯片内细胞活性考察及血管病变部位细胞黏附功能变化的表征，方法过程如下：
(1)用Live/Dead细胞检测试剂盒检测芯片内培养的脑微血管内皮细胞的活性；
(2)常规免疫荧光染色法表征TNF-α和Y27632分子作用后，脑微血管内皮细胞表面eNOS、vincul in、vWF、ICAM-1、VCAM-1以及integrin-β4蛋白的表达，用于表征脑微血管内皮细胞表面粘附性的变化。
本发明还提供了上述建立的脑微血管炎症模型应用于肺癌细胞在内皮细胞表面的黏附与滚动现象的研究。
本发明提供的基于微流控芯片的脑微血管炎症模型的建立方法，并应用于肺癌细胞在病变部位表面的运动特征研究，可采用生物学上常用的细胞检测手段对内皮细胞进行检测，包括细胞死活标记染色、细胞免疫荧光染色、细胞运动速度和距离的检测等。
附图说明
图1本发明微流控芯片整体结构示意图；
图2本发明微流控芯片通道内，脑微血管内皮细胞的贴壁与增殖情况；
图3 TNF-α和Y27632分子作用于脑微血管内皮细胞后，Live/Dead细胞检测试剂盒表征细胞的增殖与凋亡情况；
图4 TNF-α和Y27632分子作用于脑微血管内皮细胞24h后，免疫荧光染色法检测脑微血管内皮细胞内eNOS、vWF、Int-β4、vinculin、VCAM-1、ICAM-1表达量的变化；A为免疫荧光染色图，B为对荧光强度进行定量统计数据图；
图5流体剪切力FSS＝1dyne/cm2的条件下，肺癌细胞在脑微血管内皮细胞表面的滚动与粘附现象；
图6不同分子作用下，肺癌细胞在脑微血管内皮细胞表面的黏附与滚动情况；其中，A显示的是在对照条件下，肺癌细胞在脑微血管内皮细胞表面的滚动与粘附现象，B显示的是在TNF-α作用下，肺癌细胞在脑微血管内皮细胞表面的滚动与粘附现象，C显示的是在TNF-α与Y27632分子作用下，肺癌细胞在脑微血管内皮细胞表面的滚动与粘附现象，D是对上述黏附细胞数进行定量统计结果。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
一种微流控芯，该微流控芯片主要由细胞入口1、细胞培养室2和废液出口3组成；细胞培养室2上连细胞入口池1，细胞培养室2下连废液出口3。
本发明提供的微流控芯片，该微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为浓硫酸煮过的洁净玻璃。所述微流控芯片的上下两层分别进行紫外过夜照射的灭菌处理，然后等离子体处理60s进行封接。
一种基于微流控芯片的脑微血管炎症模型建立方法采用上述微流控芯片，按照以下步骤进行如下：
(1)芯片修饰
将配制好的0.1mg/mL胶原工作液经由细胞入口加入芯片，将固定芯片的培养皿常温静置12-36小时，随后移除胶原工作液，细胞培养液冲洗通道2-4次，对通道底面进行修饰；
(2)芯片内细胞的接种与培养
提取纯化原代大鼠脑微血管内皮细胞，消化调整至1×105-5×105cells/mL，经由细胞入口加入到芯片中，细胞迅速贴壁并均匀铺展于细胞培养室底面，当在光学显微镜下观察到细胞在细胞培养室中均匀分布时，立即将芯片移入二氧化碳培养箱中继续培养；
(3)炎症脑微血管模型的建立
待脑微血管内皮细胞经过增殖完全铺满细胞培养室底面后，经由细胞入口向通道中加入以细胞培养液配制的10μMTNF-α溶液，并继续培养24小时，使脑微血管内皮细胞对TNF-α分子产生相应，模拟脑微血管炎症模型。
实施例1
应用脑微血管内皮细胞建立血管炎症病变模型
利用实验室自行设计制作的微流控芯片，结构如图1所示。配制浓度为0.1mg/mL的I型鼠尾胶原工作液，经由细胞入口注入芯片内，常温静置过夜，24小时后移除胶原工作液，细胞培养液冲洗通道3次。将脑微血管内皮细胞消化后，稀释成浓度为5×106cells/mL的细胞悬液，经由细胞入口加入100μL细胞悬液至芯片内，在胶原的修饰作用下，细胞迅速贴壁并均匀铺展于细胞培养室底面，当在光学显微镜下观察到细胞在细胞培养室中均匀分布时，立即将芯片移入二氧化碳培养箱中继续培养，观察细胞在芯片内的生长和增殖情况，结果如图2所示。分别加入含有TNF-α和Y27632分子的细胞培养液处理脑微血管内皮细胞，Live/dead细胞检测试剂盒表征脑微血管内皮细胞的生长和增殖情况，结果如图3所示。
实施例2
脑微血管炎症模型细胞内功能蛋白的表征
利用实验室自行设计制作的微流控芯片，结构如图1所示。芯片修饰后，采用与实施例1相同的细胞接种和培养方式建立脑微血管炎症模型。刺激24h后，进行细胞免疫荧光染色，监测蛋白为一氧化碳合成酶(eNOS)、血管性血友病因子(vWF)、整合素β4(Intβ4)、黏着斑蛋白(vinculin)、内皮细胞粘附分子-1(VCAM-1)及细胞间粘附分子-1(ICAM-1)，荧光显微镜下拍照，记录相应蛋白的表达情况，结果如图4所示。
实施例3
流体剪切力作用下肺癌细胞在脑微血管内皮细胞表面的黏附与滚动
利用实验室自行设计制作的微流控芯片，结构如图1所示。芯片修饰后，采用与实施例1相同的细胞接种和培养方式建立脑微血管炎症模型。随后将肺癌细胞消化稀释成细胞悬液，浓度为1×106cells/mL，经由细胞入口通入通道中，显微镜持续拍摄肺癌细胞在脑微血管内皮细胞表面的黏附与滚动现象，统计发生粘附与滚动的肺癌细胞数目，结果如图5所示。图6为不同分子作用下，肺癌细胞在脑微血管内皮细胞表面的黏附与滚动情况；其中，A显示的是在对照条件下，肺癌细胞在脑微血管内皮细胞表面的滚动与粘附现象，B显示的是在TNF-α作用下，肺癌细胞在脑微血管内皮细胞表面的滚动与粘附现象，C显示的是在TNF-α与Y27632分子作用下，肺癌细胞在脑微血管内皮细胞表面的滚动与粘附现象，D是对上述黏附细胞数进行定量统计结果。