一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam/V的制备方法与流程

本发明涉及生物学领域中敏感细胞亚克隆的制备技术，特别涉及一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam/V的制备方法。

背景技术：

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起，以高热(40℃以上)、结膜炎、眼、鼻黏液性或脓性分泌物、口腔溃疡、咳嗽、恶臭的腹泻为主要临床特征，肺炎和出血性肠炎为主要病理变化的急性、热性、高度接触性传染病。该病属于副黏病毒科(Paramyxo-viridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)的成员，同属的还有牛瘟病毒(Rinderpestvirus,RPV)、犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)、海豹瘟病毒(Porpoise distemper，PDV)、海豚瘟病毒(Dolphin distemper，DDV)和麻疹病毒(Measles Virus,MV)。病毒分离和鉴定是当前流行PPRV毒株生物学特性研究的基础，但PPRV在Vero、BHK-21、PK-15等常用的细胞系上或不易适应，或不产生典型细胞病变(CPE)，或传代几次后病毒丢失，分离率较低，影响和限制了对PPRV野毒株的分离、生物学特性和致病机制的研究。因此，建立易于PPRV培养增殖的敏感细胞，对开展PPRV的深入研究和疫苗毒生产都具有重要的应用价值。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有技术难以分离到高滴度小反刍兽疫病毒的不足，构建靶向小反刍兽疫病毒特定细胞受体的慢病毒载体介导稳定整合的一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam/V的制备方法。

为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案：

一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam/V的制备方法，包括山羊信号淋巴细胞激活分子Slam/V引物序列，通过构建山羊Slam/V慢病毒表达载体，获得Slam/V复制缺陷型慢病毒样粒子，以获得的Slam/V慢病毒样粒子感染Vero靶标细胞，筛选稳定表达Slam/V的Vero阳性细胞亚克隆，验证阳性细胞亚克隆Vero/Slam/V表达的Slam活性、遗传稳定性及其对PPRV复制的增殖效果。

所述序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2包括：

SEQ ID NO.1:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGCTAGATCTGCGGAAAGGTGACT,

SEQ ID NO.2:GGGGACAACTTTTGTATACAAAGTTGTGGCATGCTGAGGGCCAAGAGTGAG。

所述Slam/V慢病毒表达载体构建，包括Slam/V与pDONR^TM221供体载体进行B、P位点重组获得入门载体pDONR/Slam/V，以及pDONR/Slam/V与pLenti6.2/V5-DEST^TMVector表达载体进行L、R位点重组获得表达克隆pDEST/Slam/V。

所述Slam/V完整慢病毒的获得，是将pDEST/Slam/V质粒与包装混合物pLP1、pLP2及VSV-G共同转染人胚肾细胞株293-FT，收获细胞上清，获得具有感染性的Slam/V复制缺陷型慢病毒样粒子。

所述Vero/Slam/V阳性敏感细胞亚克隆，以获得的Slam/V慢病毒样粒子感染Vero细胞，并采用杀稻瘟菌素blasticidin进行抗性筛选，获得稳定表达Slam/V的Vero阳性细胞亚克隆。

所述Vero/Slam/V阳性细胞亚克隆提高小反刍兽疫病毒复制效果的验证方法，采用靶标基因扩增、间接免疫荧光、western-blot免疫印迹检测技术及致细胞病变效应等技术分别验证slam/V基因组整合、转录，slam/V蛋白表达、反应活性以及PPRV在表达slam/V阳性细胞亚克隆上的增殖效果。

本发明Vero/slam/V功能区敏感细胞亚克隆的制备及验证方法的具体步骤如下：

a.设计并合成针对Slam/V功能区的引物，该引物带有与载体P位点匹配的B位点同源臂；

b.分离山羊外周血淋巴细胞，提取其总RNA；

c.扩增Slam/V功能区，并与pDONR^TM221供体载体利用BP ⅡEnzyme Mix酶进行B、P位点同源重组，重组物转化One Mach1^TM T1^R Chemically Competent Cells感受态细胞，挑选阳性克隆，测序检验序列的保真性，获得入门载体pDONR/Slam/V；

d.将上述pDONR/Slam/V与pLenti6.2/V5-DEST^TMVector表达载体通过LRⅡplus Enzyme Mix酶进行L、R位点同源重组，获得表达骨架pDEST/Slam/V；

e.获得的表达骨架pDEST/Slam/V质粒与Packaging Mix pLP1、pLP2及VSV-G共转染293-FT细胞，获得Slam/V复制缺陷型慢病毒样粒子；

f.用上述获得的Slam/V复制缺陷型慢病毒样粒子感染Vero细胞；

g.blasticidin抗性筛选，获得表达Slam/V功能区的Vero阳性细胞亚克隆；

h.分别用靶标基因扩增、间接免疫荧光、western-blot免疫印迹检测技术及致细胞病变效应等技术分别验证slam/V基因组整合、转录，slam/V蛋白表达、反应活性以及PPRV在表达slam/V阳性细胞亚克隆上的增殖效果。

淋巴细胞信号活化因子(Signaling lymphocyte activation molecule，SLAM，又称CD150)是PPRV感染的细胞受体，具有免疫球蛋白超家族的两个特征性结构域：N端的V结构域和C端的C2结构域，其中V结构域是与病毒蛋白结合的功能区，包含与病毒蛋白特异性结合的关键氨基酸位点。因此，表达Slam/V功能区的受体的确可以提高细胞分离病毒的敏感性，但是国内目前没有可以提高小反刍兽疫分离的敏感细胞。故选用Slam/V结构域作为靶标建立PPRV敏感细胞。

鉴于此，本发明借助慢病毒表达系统，采用Gateway技术将山羊Slam/V功能区基因稳定整合在Vero细胞基因组染色体上，通过杀稻瘟菌素blasticidin抗性筛选获得永久表达Slam/V功能区的稳定细胞亚克隆，为小反刍兽疫病毒分离、鉴定提供可靠工具，也为PPRV感染过程、致病机制等研究奠定基础，对开展PPRV的深入研究和疫苗毒生产都具有重要的应用价值。具体体现如下：

第一、使用BP和LR两个反应构成的Gateway技术快速、准确、高效构建pDEST/Slam/V表达载体。该技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，保证了正确的方向和阅读框,便于功能基因的分析和蛋白质的表达。靶标DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。

第二、Vero/Slam/V敏感细胞亚克隆采用慢病毒表达系统将Slam基因稳定整合在Vero细胞基因组染色体上，使其具有良好的遗传稳定性，即传代不丢失，瞬时转染虽然也具有一定功效，但仅仅停留在验证阶段，并没有建立真正具有稳定增强PPRV复制的阳性细胞亚克隆。

第三、构建的Vero/Slam/V敏感细胞亚克隆与正常Vero细胞相比，形态上稍有改变，经细胞生长曲线、细胞毒性实验等一系列实验验证，其生物学特性没有异常，所以无论科学研究还是生产疫苗，该Vero/Slam/V敏感细胞亚克隆完全可以用于小批量或大规模生产使用。

第四、与正常Vero细胞相比，构建的Vero/Slam/V敏感细胞亚克隆能够明显提高PPRV分离率，其一PPRV致Vero/Slam/V敏感细胞亚克隆的病变时间比致正常Vero细胞病变时间明显缩短，其二Vero/Slam/V敏感细胞亚克隆分离病毒的拷贝数比正常Vero细胞提高100倍以上。

本发明采用慢病毒表达系统制备的Vero/slam/V敏感细胞亚克隆无论从基因水平、转录水平或蛋白水平进行验证时，均表现出良好的活性。Vero/slam/V与正常Vero生长特性无显著差异,说明表达的蛋白对细胞没有明显毒性。Vero/slam/V与正常Vero细胞相比，接种PPRV后细胞病变时间明显缩短，可见，Vero/slam/V敏感细胞亚克隆表达的slam/V能够明显提高PPRV的分离率。

附图说明

图1为基因组扩增验证Vero/slam/V功能区敏感细胞中slam/V基因整合及其遗传稳定性核酸电泳图；

图2为间接免疫荧光从蛋白水平验证Vero/slam/V功能区敏感细胞中slam基因表达荧光图；

图3为Vero/slam/V功能区敏感细胞表达slam/V功能区后活性分析的western-blot结果蛋白电泳图；

图4为PPRV对Vero/slam/V功能区敏感细胞的易感性细胞图；

图5为real-time RT-PCR验证PPRV在vero/slam/V功能区敏感细胞上的增殖效果柱状图。

图1中A为Vero/slam/V功能区细胞筛选扩大培养后扩增slam/V基因；B为Vero/slam/V功能区细胞传30代后扩增slam/V基因；M为DL2000分子量Marker；

图2中A为正常vero细胞；B为vero/slam/V功能区细胞；C为免疫荧光检测slam/V基因在vero细胞中的表达；D为免疫荧光检测slam/V基因在vero/slam/V功能区细胞中的表达；

图4中A为PPRV致vero细胞病变效应；B为PPRV致vero/slam/V功能区细胞病变效应。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行进一步详细叙述。

实施例1

1、设计并合成针对山羊的信号淋巴细胞激活分子Slam/V功能区的引物，该引物与载体P位点匹配可以进行同源重组，即带有B位点同源臂，序列如下：

SEQ ID NO.1:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGCTAGATCTGCGGAAAGGTGACT,

SEQ ID NO.2:GGGGACAACTTTTGTATACAAAGTTGTGGCATGCTGAGGGCCAAGAGTGAG。

2、制备山羊信号淋巴细胞激活分子RNA模板

采集并分离健康山羊外周血淋巴细胞，提取其总RNA。

3、制备Slam/V功能区的DNA

扩增Slam/V功能区，建立50ul扩增体系，如下：

上述点击混匀，进行RT-PCR扩增，反应条件为：

4、Slam/V入门载体构建

凝胶回收并纯化上述PCR产物，并与pDONR^TM221供体载体利用BPⅡEnzyme Mix酶进行B、P同源重组，BP重组反应体系为：

点击混匀，25℃进行重组反应，2h后，体系中加入proteinase k，37℃反应10min后产物转化OneMach1^TM T1^R Chemically Competent Cells感受态细胞，挑选阳性克隆，测序检验序列的保真性，获得入门载体，命名为pDONR/slam/V。

5、pDONOR/slam/V表达载体的构建

将上述pDONR/slam/V功能区与pLenti6.2/V5-DEST^TMVector表达载体通过LRⅡplus Enzyme Mix酶进行L、R位点同源重组，LR重组反应体系为：

点击混匀，25℃进行重组反应，16h后，体系中加入proteinase k，37℃反应10min后产物入50uL在冰上融化的OneMach1^TM T1^R Chemically Competent Cells感受态细胞中混匀，冰浴30min，42℃热击60s(切勿振荡)，冰浴2～3min，加入450uL预热的SOC培养基，封口膜封口，混匀，37℃水平转速225rpm，振荡1h，4000rpm离心2min，吸弃约350uL，剩余100uL菌液涂布于氨苄抗性的LB平板，正立平板吸收液体10min后，37℃倒置培养14h至单菌落出现。随机挑取生长于LB(氨苄抗性)上的数个单菌落，增菌培养后小量提取质粒，经PCR鉴定为阳性的测序验证其保真性，验证合适的为获得的表达骨架，命名为pDEST/slam/V。

6、slam/V复制缺陷型慢病毒样粒子的获得

pDEST/slam/V功能区与已经优化的ViraPower^TM Packaging Mix(pLP1、pLP2及VSV-G)共转染人胚肾细胞293-FT(脂质体3000法转染)，48h收获无复制能力的slam/V慢病毒上清液。4℃3500rpm，离心5min以去除细胞碎片，收集上清，即为slam/V复制缺陷型慢病毒样粒子，-70℃保存备用。

7、slam/V复制缺陷型慢病毒样粒子感染Vero细胞以及阳性细胞亚克隆的筛选

吸弃Vero细胞培养液，加入3ml slam/V复制缺陷型慢病毒液，37℃孵育2h，补加7ml正常细胞培养液，2d后更换含有blasticidin的新鲜DMEM培养液，进行抗性筛选。当出现blasticidin抗性的细胞克隆时，胰酶消化转至新的培养瓶，待细胞长满后继续抗性筛选。直至细胞不再死亡时，进行有限稀释，找细胞亚克隆岛，并扩大培养、连续传代，进行一系列后续验证、分析。

8、通过基因组扩增从基因水平验证Vero/slam/V细胞亚克隆中slam/V基因整合及其遗传稳定性

取一瓶扩大培养以及连续传30代后的Vero/slam/V功能区细胞，吸弃培养液，胰酶消化后，500ul PBS重悬，利用基因组DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，以SEQ IDNO.1，SEQ IDNO.2为引物，进行扩增，扩增体系及扩增条件如上述。

9、结果

如图1所示，Vero/slam/V功能区及其30代细胞中均成功扩增到slam/V功能区基因，片段大小与预期一致，为429bp，测序验证合适，说明slam/V功能区已成功整合在Vero细胞基因组染色体上，连续传30代不丢失，可见具有良好的遗传稳定性。

实施例2

1-7步骤同实施例1。

8、通过间接免疫荧光从蛋白水平验证Vero/slam/V功能区细胞中slam/V基因表达情况

实施案例1中步骤7筛选的阳性vero/slam/V功能区阳性细胞亚克隆接种于提前加入飞片的6孔细胞培养板，培养48h后，取出飞片，以PBS缓冲液(pH7.6)轻洗细胞面2次，沥干液体后加入预冷的80％丙酮，放入-20℃冰箱固定25min，吸弃丙酮，以PBST缓冲液(pH7.6)洗涤单层细胞3次。室温下用含3～5％BSA的PBS封闭液封闭45min。弃掉封闭液，用PBS洗涤细胞3次。每孔加入PBS 1:200稀释的山羊抗Slam一抗(圣克鲁斯生物技术有限公司)，37℃湿盒中作用1h，弃一抗，用PBST缓冲液洗涤单层细胞3次。每孔加入1:500稀释的FITC异硫氰酸荧光素标记的驴抗山羊IgG，湿盒中37℃孵育1h，吸弃荧光二抗，用PBST冲洗细胞3次，吸干冲洗液后滴加2滴50％甘油溶液，置于荧光显微镜下观察染色结果并照相。

9、结果

通过免疫荧光检测发现，slam/V基因在假型病毒的介导下得到了表达，而且表达的蛋白能被slam荧光标记抗体所识别，而正常vero细胞中slam受体表达量非常低。进一步从蛋白水平验证了构建的vero/slam/V阳性细胞亚克隆能够提高slam/V受体的表达量。如图2。

实施例3

1-7步骤同实施例1。

8、Vero/slam/V阳性细胞亚克隆表达slam/V后的活性分析

用胰酶消化，PBS收集vero/slam/V阳性细胞亚克隆，细胞裂解液裂解后经12％SDS-PAGE电泳后转印至PVDF转移膜，PBS洗膜3次，每次5min，滴加5％脱脂奶粉的PBS封闭过夜。PBST洗膜3次，每次5min，加入1:200稀释的山羊抗slam一抗，37℃结合1.5h。用PBS洗膜3次，每次10min，加入1∶500稀释的驴抗山羊酶标二抗，室温下轻摇孵育1h，PBST洗膜3次,每次5min，经四氯-1-奈酚底物显色、氨基黑染色分析结果，以检查表达产物是否具有特异性免疫活性。

9、结果

经SDS-PAGE电泳后，表达的外源蛋白在14kDa左右出现阳性条带，而空白对照组未出现特异条带，说明表达的外源蛋白具有活性结构，转印至PVDF转移膜后，分别与山羊抗slam一抗和驴抗山羊IgG/HRP作用，结果表明在目的条带位置上出现特异显色条带(如图3)，正常vero对照细胞未出现条带，说明目的蛋白slam/V功能区可被slam抗体所识别，具有免疫学活性。

实施例4

1-7步骤同实施例1。

8、接种PPRV病毒，验证PPRV对vero/slam/V阳性细胞亚克隆的易感性

同时取vero/slam/V和vero正常细胞各两瓶，同时设空白对照，弃培养液，接种PPRV病毒液3ml，37℃孵育2h，补加维持液7ml，置37℃，观察致细胞病变情况。

9、结果

接种PPRV后，与正常vero细胞(如图2中A)相比，PPRV致vero/slam/V阳性细胞亚克隆(如图2中B)病变时间明显缩短，如图4，表明，vero/slam/V阳性细胞亚克隆表达的slam/V具有提高PPRV易感性功效。这一结果为繁殖PPRV提供了较好工具。

实施例5

1-7步骤同实施例1。

8、接种PPRV病毒，real-time RT-PCR从转录水平验证转基因阳性细胞亚克隆表达的山羊slam/V对PPRV的增殖效果

PPRV分别接种vero/slam/V敏感细胞亚克隆和正常vero细胞，分别于48h、72h及96h收集病毒，-70°冰箱反复冻融后，各取400ul，Trizol法分别提取其RNA，ND2000测定其浓度，稀释使所有RNA保持在一个浓度(100ng/uL)，每个样品3ul，利用实验室验证好的PPRV引物、探针引物及β-actin管家基因引物分别稀释成10umol/L，按照One StepPrimer Script^TMRT-PCR Kit(Perfect Real time)说明书配比，同步扩增PPRV和β-actin基因，每个样品重复3次。然后，用比较阈值法分析不同样品中PPRV的相对拷贝数。

9、结果

由图5可知，无论48h、72h或96h哪个时间点，PPRV在转基因vero/slam/V敏感细胞亚克隆上繁殖的相对拷贝数比正常Vero细胞的都要高，说明vero/slam/V敏感细胞亚克隆稳定表达的slam具有明显增强PPRV繁殖的功能。

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<110> OrganizationName : 中国农业科学院兰州兽医研究所

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<120> Title : 一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero-Slam-V的制备方法

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