一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam/V的制备方法与流程

技术特征：

1.一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam/V的制备方法，其特征在于包括山羊信号淋巴细胞激活分子slam/V引物序列，通过构建山羊slam/V慢病毒表达载体，获得slam/V复制缺陷型慢病毒样粒子，以获得的slam/V慢病毒感染Vero靶标细胞，筛选稳定表达slam/V的Vero阳性细胞亚克隆，验证阳性细胞亚克隆Vero/Slam/V表达的Slam/V的活性、遗传稳定性及其对PPRV复制的增殖效果。

2.根据权利要求1所述的一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam/V的制备方法，其特征在于所述slam/V引物带有与载体匹配的B位点同源臂，其序列为：

SEQ ID NO.1:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGCTAGATCTGCGGAAAGGTGACT,

SEQ ID NO.2:GGGGACAACTTTTGTATACAAAGTTGTGGCATGCTGAGGGCCAAGAGTGAG。

3.根据权利要求1所述的一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam/V的制备方法，其特征在于所述Slam/V表达载体的构建，包括Slam/V与pDONR^TM221供体载体进行B、P位点重组，获得入门载体pDONR/Slam/V，pDONR/Slam/V与pLenti6.2/V5-DEST^TMVector表达载体进行L、R位点重组获得表达克隆pDEST/Slam/V。

4.根据权利要求1所述的一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam/V的制备方法，其特征在于所述Slam/V复制缺陷型慢病毒样粒子的获得，是将pDEST/Slam/V质粒与包装混合物pLP1、pLP2及VSV-G共同转染人胚肾细胞株293-FT，收获细胞上清，获得具有感染性的Slam/V复制缺陷型慢病毒样粒子。

5.根据权利要求1所述的一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam/V的制备方法，其特征在于所述筛选稳定表达slam/V的Vero阳性细胞亚克隆，是采用杀稻瘟菌素blasticidin进行抗性筛选，获得稳定表达Slam/V的Vero阳性细胞亚克隆。

6.如权利要求5所述的一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam/V的制备方法，其特征在于所述Vero细胞对blasticidin杀稻瘟菌素的耐受浓度为3.5ug/ml。

7.如权利要求1所述的一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam/V的制备方法，其特征在于所述敏感细胞亚克隆Vero/Slam/V的验证，采用靶标基因扩增方法、间接免疫荧光方法、western-blot免疫印迹检测方法及致细胞病变效应分别验证slam/V基因组整合、转录，slam/V蛋白表达、反应活性以及PPRV在表达slam/V的阳性细胞亚克隆上的增殖效果。