一种表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体及其制备方法与流程
本发明涉及医学病毒学技术领域，具体涉及一种表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体及其制备方法。
背景技术：
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淋巴T细胞是构成细胞免疫的主要成分，而利用基因工程使T细胞表达嵌合抗原受体能使T细胞转化成为具有特异性杀伤肿瘤细胞的效应细胞，是一种有前景的肿瘤免疫治疗策略。嵌合性抗原受体应用的关键是确定一种肿瘤相关抗原，这种抗原具有在肿瘤细胞表面过表达或高表达，而在正常组织无表达或低表达。CD19是表达于B淋巴细胞及滤泡树突状细胞的表面蛋白，属于免疫球蛋白(Ig)超家族成员，位于16号染色体短臂上(16p11.2)，编码556个氨基酸的Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子量95KD。细胞外有N端及两个C2-Ig区，一个跨膜区，细胞内有C端及含9个酪氨酸残基的高度保守功能区，CD19在早期B细胞的发育中扮演重要的角色，所有的急性白血病都表达CD19。CD20是一种磷酸化蛋白质分子，分子质量约为35kD，属于4次跨膜的蛋白质超家族。它表达于90％以上的B淋巴瘤细胞和正常B淋巴细胞，而在造血干细胞、原始B淋巴细胞、正常血细胞以及其他组织上不表达。因此，CD19，CD20可作为恶性B淋巴细胞白血病免疫治疗的一种有效的靶抗原。因此，构建及表达靶向CD19和CD20抗体基因崁合抗原受体对于恶性B淋巴细胞白血病细胞免疫治疗具有重要临床前指导意义。
随着生物技术的发展，病毒学的基因转移方法，被越来越多的应用于基因治疗。它可以将外源基因导入包括鼠类、灵长类及人在内的体细胞中，并整合到细胞基因组中，达到长期稳定表达的目的，因而在包括遗传病治疗、移植、干细胞转导等许多领域的应用中有非常好的前景。病毒学的基因转移载体以逆转录病毒载体和腺病毒载体最为成熟。常见的逆转录病毒载体由小鼠白血病病毒(MLV)改造而来，虽可使目的基因整合至靶细胞基因组、实现稳定表达，但只能转导分裂细胞，因此只能用于基因治疗的离体方案。腺病毒载体既能转导分裂细胞，亦可转导静止细胞，转导效率也较高，但目的基因不整合至靶细胞基因组，仅能短暂表达，而且腺病毒本身某些抗原的表达可引起人体免疫反应，阻止其重复转导。近来，一些研究者把目光投向了以Ⅰ型人类免疫缺陷病(HIV-1)为代表的慢病毒。研究表明，以HIV-1为基础构建的慢病毒载体不仅能将目的基因整合至靶细胞基因组，实现长期稳定表达，同时具有可感染非分裂细胞、免疫反应小等优点，适于体内基因治疗，因此成为理想的基因转移载体。
目前，对于生产表达CD19和CD20崁合抗原受体重组慢病毒会遇到如下问题：1)耗时长；2)重复性低；3)难以转染甚至无法转染；4)难以达到目的基因的高效表达，一些蛋白相关的功能实验难以进行。与此相对照，本发明提供的重组慢病毒生产方法具有简单易行，重复性高，所生产慢病毒具有很高的感染效率，且很少引发机体的免疫反应，应用范围十分广泛。
技术实现要素：
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本发明的目的在于解决上述的技术问题，提供一种表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体及其制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现的：
一种表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体，通过将含有CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体基因的穿梭表达载体与辅助包装质粒共转染293T细胞后，重组收获及浓缩即形成表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体。
具体地，所述表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体的制备方法，包括如下步骤：
S1：293T细胞的准备
a.从初始细胞库中复苏293T细胞；
b.将复苏的293T细胞悬浮于10％FBS DMEM培养基中，接种于T75培养瓶中置于37℃条件下，5％CO2孵育箱内进行培养；
其中：所述10％FBS DMEM培养基中含有4.5g/L葡糖糖，1％丙酮酸钠，1％谷氨酰胺。
所述复苏的293T细胞于10％FBS DMEM培养基中按2X104/cm2的接种量接种于T75培养瓶中。
c.将培养的293T细胞每隔3～4天进行传代扩增培养一次；
所述传代扩增培养的方法，包括以下步骤：
a.移走用过的培养基，用PBS清洗细胞一次；
b.用0.5％胰蛋白酶37℃消化细胞3～15min，然后加入与细胞体积等量的含10％FBS的培养基使胰蛋白酶失活；
c.将收集的细胞离心并重新悬浮于新鲜培养基中，接种于T75/T500/CellStac培养瓶或培养盘中培养一直到获得足够数量用于转化的细胞。
所述收集的细胞按2X104/cm2的接种量接种于T75/T500/CellStac培养瓶或培养盘中。
S2：慢病毒CD19和CD20表达质粒与辅助包装质粒的共转染
a.将上述传代扩增的293T细胞于CellStack培养盘中，2天后当细胞覆盖培养盘面积的80％时开始转染；
所述传代扩增的293T细胞按0.5～1.5X104/cm2的接种量接种于CellStack培养盘中，可根据所需病毒生产量接种于多个培养盘中。
b.准备共转染混合物，即根据CellStack培养盘的用量或转染的细胞量的比例进行扩大或缩减转染，备用；
c.按照顺序依次加入以下质粒和试剂：
含有CD19和CD20基因的慢病毒载体，
含有水疱性口炎病毒G蛋白基因辅助包装质粒,
含有包装假型病毒颗粒必需的蛋白质基因的辅助包装质粒，使质粒总量为0.5μg/cm2，并将质粒溶于pH7.9的TE缓冲液中；
d.加入CaCl2和pH 7.2的2XHEPES生理缓冲液(HBS)混匀后，置于室温下5min～30min；
e.移去培养盘中原有的培养基，加入上述备用的共转染混合物和含有2％FBS的DMEM培养基，并将培养盘置于37℃，5％CO2孵育箱内培养2～3h；
f.移除共转染混合物后，加入含有丁酸盐的2％FBS的DMEM培养基中，再将培养盘置于37℃，5％CO2孵育箱进行培养72h；
S3：重组慢病毒收获及浓缩
a.收获上述培养72h后的重组慢病毒上清，即得粗制慢病毒；
b.将收获的粗制慢病毒上清经0.45μm滤器过滤以清除细胞杂质；
c.于16℃，50000Xg条件下超离心120min后，弃掉上清，再将离心管倒置晾干；
d.将上述沉淀溶于1XPBS中，离心1000pm，1～2min除去不溶物，所获的上清即为浓缩后的表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体。
本发明的有益效果在于：本发明表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体的制备方法具有简单易行，耗时短，重复性高，所生产的慢病毒具有很高的感染效率，可高效表达目的基因，且很少引发机体的免疫反应，应用范围十分广泛。
附图说明：
图1是本发明表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体的制备流程图；
图2是实施例的制备方法中10层的CellStack培养盘示意图。
具体实施方式：
下面对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
一种表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体的制备方法，包括以下步骤：
S1：293T细胞的准备
a.从初始细胞库复苏293T细胞；
b.将复苏的293T细胞悬浮于10％FBS DMEM培养基中(含4.5g/L葡糖糖，1％丙酮酸钠，1％谷氨酰胺)，按2X104/cm2的接种量接种于T75培养瓶中，置于37℃，5％CO2孵育箱培养；
c.每隔3～4天将293T细胞传代扩增培养，传代方法如下：
移走用过的培养基，用PBS清洗细胞一次；用0.5％胰蛋白酶37℃消化细胞3～15min，然后加入与细胞体积等量的含10％FBS的培养基使胰蛋白酶失活；将收集的细胞离心并重新悬浮于新鲜培养基中，按2X104/cm2的接种量接种于T75/T500/CellStac培养瓶或培养盘中培养一直到获得足够数量用于转化的细胞。
S2：慢病毒CD19和CD20表达质粒与辅助包装质粒的共转染
a.将传代扩增的293T细胞按0.5～1.5X104/cm2的接种量接种于10层的CellStack培养盘中(据所需病毒生产量可接种多个培养盘)，2天后当细胞覆盖培养盘面积的80％时开始转染；
b.共转染混合物的准备，此处所述混合物是转染一个10层的CellStack培养盘用量，如有多个10层CellStack培养盘或需转染细胞量小时可据此比例扩大或缩减；
c.按照顺序依次加入以下质粒和试剂：
1590.54μg含有CD19和CD20基因的慢病毒载体，558.36μg含有水疱性口炎病毒G蛋白基因辅助包装质粒和1031.91μg含有包装假型病毒颗粒必需的蛋白质基因的辅助包装质粒，使质粒总量为0.5μg/cm2，将质粒溶于50mL左右，pH7.9的TE缓冲液中；
d.加入2M CaCl2 7ML，加入pH 7.2 2XHEPES生理缓冲液(HBS)58mL,混匀，置室温不低于5分钟不超过30分钟；
e.移去培养盘中原有的培养基，加入上述转染混合物及1L含有2％FBS的DMEM培养基，将培养盘置于37℃，5％CO2孵育箱培养2～3h；
f.移除转染混合物，加入含有6μM丁酸盐于2％FBS的DMEM培养基中，将培养盘置于37℃，5％CO2孵育箱进行培养。
S3：重组慢病毒收获及浓缩
a.收获上述培养72h后的重组慢病毒上清，即得粗制慢病毒；
b.将所获的粗制慢病毒上清经0.45μm滤器过滤以清除细胞杂质；
c.超离心16℃，50000Xg，120min，弃掉上清，将离心管倒置晾干；
d.将沉淀溶于1XPBS中，然后离心1000pm，1～2min后除去不溶物，所获的上清即为浓缩后的表达CD19和CD20抗体基因嵌合抗原受体的慢病毒载体。
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