一种检测犬巴贝斯焦虫的PCR检测试剂盒的制作方法

本实用新型是一种检测犬巴贝斯焦虫的PCR检测试剂盒，属于动物病原的检测领域，专一针对犬巴贝斯焦虫的PCR检测试剂盒，适用于犬巴贝斯焦虫的快速检测试剂盒。

背景技术：

犬的巴贝斯虫病主要经硬蜱传播并寄生于犬红细胞内引起的虫媒性血液原虫病。巴贝斯虫隶属原生动物亚界、孢子纲、真球虫目、梨形虫亚目、巴贝斯虫科、巴贝斯虫属的一类原生生物寄生虫(谷钧相等2001)。巴贝斯虫主要寄生于脊椎动物的红细胞，盛行的地区包括亚洲、非洲、欧洲、中东及北美洲。该属包括90多种巴贝斯虫，并且除了各别虫体如田鼠的巴贝斯虫(Babesiamicroti)不仅寄生于田鼠有时也会侵害人体，其余大多数巴贝斯虫都有严格的宿主特异性(张西臣和赵权2005)。

关于感染犬巴贝斯虫病原的分类，以往根据巴贝斯虫的大小主要分为大小二型，体积较大者(2.5～5.0μm)为犬巴贝斯虫(Babesiacanis)，虫体呈梨形；体积小的(1.0～2.5μm)为吉氏巴贝斯虫(Babesiagibsoni)，虫体呈戒指样。由于近些年分子生物学技术的快速发展，试验利用对核糖体RNA小亚基基因(18SrDNA)、第一和第二内转录间隔区(ITS1，ITS2)位点、干预5.8SrRNA基因编码区、热休克蛋白70(HSP70)以及细胞色素B基因地深入研究，表明可感染犬的巴贝斯虫不止有两种，并且每一种巴贝斯虫病的感染会表现不同的临床症状。现已发现的巴贝斯虫有犬巴贝斯虫、韦氏巴贝斯虫、罗氏巴贝斯虫、吉氏巴贝斯虫、康拉德巴贝斯虫、microti样梨形虫(又称泰勒原虫或“西班牙分离株”)、还有一种未命名其形态类似于双芽巴贝斯的大型巴贝斯虫，主要感染免疫功能低下的犬。

依据特征性临床症状(高热、贫血、血红蛋血尿和脾肿大)以及有蜱存在或叮咬的病史可做出初步诊断。采病犬末梢血(耳尖血)做涂片，瑞氏液染色后镜检，发现红细胞内有巴贝斯虫可确诊。目前，血液样品的血涂片镜检技术仍是诊断犬巴贝斯虫病最合适的方法，但是该方法具有很大的一个缺点-低敏感性，因此不能应用于外周血内寄生虫含量很低动物以及感染耐过后的带虫动物的检测。血清学检查也是犬巴贝斯虫流行病学研究行之有效的方法，但是该类方法不能区别动物是正处于感染中还是已经感染耐过，不能鉴定带虫动物以及贮存宿主。而且在检测犬的巴贝斯虫病过程中发现，犬巴贝斯虫与双芽巴贝斯虫之间常出现交叉反应。敏感性更高的方法，例如常规PCR检测技术、基于DNA水平的分子诊断，其敏感性与靶基因扩增的数目是息息相关的。因此选择一个在基因组中高拷贝数的基因作为靶基因将会大大提高现有PCR方法的敏感性。建立一种简便、高效、实用的DNA检测方法。该方法可用于犬巴贝斯虫病快速检测，应用前景广阔。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于避免现有技术的不足提供一种检测犬巴贝斯焦虫的PCR检测试剂盒。

为实现上述目的，本实用新型采取的技术方案为：一种检测犬巴贝斯焦虫的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测犬巴贝斯焦虫的PCR检测试剂盒，包括有包装盒1，内衬2，在内衬2上设有数个正方形的定位孔，通过定位孔将试剂管安装定位其内部，所述试剂管包括并列安装的：5xbuffer管3，Tag酶管4，dNTPmix管5，引物mix管6，阳性对照管7，阴性对照管8，去离子水管9；

优选的，阳性对照管7为棕色管，阴性对照管8为蓝色管；

优选的，5xbuffer管3为半透明的PE管；

优选的，Tag酶管4为全黑不透明的PE管。

上述各种液体分别装在容器内，插入容器孔内。

所述的核苷酸序列为：

上游引物为5’-TAGCGATGGACCATTCAAGT-3’；

下游引物为5’-CGTTTGTCTGGACCTGGTGAG-3’；

其中，所述的阳性对照为：从医院一例犬巴贝斯焦虫病阳性样本中分离的犬巴贝斯焦虫构建质粒。

所述的阴性对照是蒸馏水。

PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s,56℃40s,72℃1min,35Cycle；72℃10min；4℃∞。

判定结果：如果从待检测的样品中扩增到了892bp片段，则该检测样品含有巴贝斯焦虫病原。

本实用新型的有益效果是：由于采用了上述技术方案，本实用新型研制了用于检测犬巴贝斯焦虫的PCR试剂盒，可从犬全血临床样本中直接检测到犬巴贝斯焦虫病原核酸，试剂盒的灵敏度为34.2fg,从开始到出结果整个检测过程仅需5小时。由此可见，该试剂盒具有快速、灵敏性高、特异性强等特点。适用于犬巴贝斯焦虫的检测、诊断和流行病学调查。

附图说明

图1是本实用新型的立体示意图；其中，包装盒1，内衬2，5xbuffer管3，Tag酶管4，dNTPmix管5，引物mix管6，阳性对照管7，阴性对照管8，去离子水管9；

图2实用新型实施例2中的检测结果，其中M代表DNA2000Marker,1代表阳性样本，2代表阴性对照。

图3实用新型敏感性检测的检测结果，M代表DNA2000Marker,1代表00、2代表10^-1、3代表10^-2、4代表10^-3、5代表10^-4、6代表10^-5、7代表10^-6、8代表10^-7、9代表阴性对照。

图4实用新型特异性检测的检测结果，M代表DNA2000Marker，分别是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10样，11代表阴性对照。

具体实施方式

以下结合实施例对本实用新型的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本实用新型，并非用于限定本实用新型的范围。

实施例1：一种检测犬巴贝斯焦虫的PCR检测试剂盒，所述检测犬巴贝斯焦虫的PCR检测试剂盒包括有包装盒1，内衬2，在内衬2上设有数个正方形的定位孔，通过定位孔将试剂管安装定位其内部，所述试剂管包括并列安装的：5xbuffer管3，Tag酶管4，dNTPmix管5，引物mix管6，阳性对照管7，阴性对照管8，去离子水管9；

优选的，阳性对照管7为棕色管，阴性对照管8为蓝色管；

优选的，5xbuffer管3为半透明的PE管；

优选的，Tag酶管4为全黑不透明的PE管。

上述各种液体分别装在容器内，插入容器孔内。

所述的核苷酸序列为：

上游引物为5’-TAGCGATGGACCATTCAAGT-3’；

下游引物为5’-CGTTTGTCTGGACCTGGTGAG-3’；

其中，所述的阳性对照为：从医院一例犬巴贝斯焦虫病阳性样本中分离的犬巴贝斯焦虫构建质粒。

所述的阴性对照是蒸馏水。

PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s,56℃40s,72℃1min,35Cycle；72℃10min；4℃∞。实施例2：一种检测犬巴贝斯焦虫的PCR检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

选用一例阳性样本为研究对象，用DNA Mini kit试剂盒提取DNA。提取流程如下：1.5ml离心管中加入20ul蛋白酶K,再加入200ul全血；加入200ul的AL液，混匀56℃，10min；加入200ul的无水乙醇，混匀；将700ul的液转入2ml的离心柱中，离心，倒掉废液；加入750ulAW1，离心，倒掉废液，加入750ulAW2，离心，倒掉废液，重复此步骤一次，空离2分钟，打开柱子凉几分钟；加入50TEbuffer，-80保存

2、PCR检测

PCR反应体系25ul,5Xbuffer5ul,dNTP2ul，引物mix2ul，Tag酶0.2ul，提取DNA2ul，ddH2O 13.8ul

95℃5min；95℃30s,56℃40s,72℃1min,35Cycle；72℃10min；4℃∞。

PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，使用DNA2000Marker,溴乙啶颜色后上凝胶成像系统，具体见说明书附图图2，M代表DNA2000Marker,1代表阳性样，2代表阴性对照。

实施例3：敏感性检测

选取构建好的质粒，用分光光度计测定提取的质量浓度为342ng/ul,取出1ul做梯度稀释，依次为00、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，10^-6、10^-7、10^-8、按照上所方法进行法进行PCR，PCR产物见说明书附图图3，M代表DNA2000Marker,1代表00、2代表10^-1、3代表10^-2、4代表10^-3、5代表10^-4、6代表10^-5、7代表10^-6、8代表10^-7、9代表10^-8、10代表阴性对照。

实施例4：特异性检测

从北京各家动物医院收集了10份巴贝斯焦虫病阳性样本全血，经PCR检测结果如电泳图4，M代表DNA2000Marker，分别是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10样，11代表阴性对照。

以上所述仅为本实用新型的较佳实施例，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。