使颗粒标签化以进行多路复用功能筛选的方法与流程
对相关申请的交叉引用
本申请要求2015年4月8日提交的美国专利申请no.14/681,601的优先权，其通过引用完整并入本文。
随此提交的序列表通过提述完整并入本文。
发明领域
本公开一般性涉及细胞生物学和实验室诊断领域，并具体涉及独特标签化的功能性分子的组合物，以及使大量分子独特标签化以促进鉴定具有期望的生物学活性的分子的一般性方法。
发明背景
寻找目标分子用于体内靶向，药物递送，治疗用途和特定分析物的监测时，可以探索组合的大量性质。尺寸，形状，电荷，磁性和光学性质，组成，表面修饰和靶向基团是可以变化的一些特征，其中每一种将导致不同的配制，递送，药代动力学，靶向和检测性质。大量不同的可能组合使得几乎不可能使用串行方式单独检查所有组合。需要方法来提高可以检查此类组合的速度。
发明概述
针对以上背景，本公开提供了相对于现有技术的某些优点和进步。本公开涉及使用独特地鉴定每种类型的功能化颗粒的标签(tag)来使功能化颗粒标签化(tagging)的一般性方法。然后可以汇集多种不同的标签化颗粒，然后将标签化的功能化颗粒的这种复合混合物引入体外或体内测定法中以选择特定性质。然后可以分离显示所需性质的颗粒(例如，通过它们在体内的位置或浓度，结合亲和力，化学性质等)，并且可以读取它们的标签。这有助于容易地鉴定具有所需性质的功能化颗粒。
如以下更全面地描述的，“标签”是独特鉴定与其连接的颗粒的化学部分，“功能部分”是待测试所需性质的化学或生物部分，“颗粒”是充当也与标签连接的一个或多个功能部分的基底或载体的化学或物理部分，“功能化的颗粒”是功能部分所关联(例如，共价或以其他方式连接)的颗粒。
在一个方面，本公开提供了包含与颗粒连接的一个或多个功能部分和独特标签的标签化的功能化颗粒。
在另一个方面，本公开提供制备标签化的功能化颗粒的方法，包括将一个或多个功能部分和独特的标签连接至颗粒。
在某些实施方案中，标签是核酸，肽，光学编码标签或质量编码标签。在某些实施方案中，功能部分是单克隆抗体，多克隆抗体，单链抗体，单域抗体或纳米抗体(nanobody)，双特异性抗体，affibody分子，肽，类肽(peptoid)，适体或其他核酸或小分子或其它化合物。在一些实施方案中，颗粒是聚合物基质。在一些实施方案中，通过汇集两种或多种类型的功能化颗粒来制备功能化颗粒的集合，每种类型的功能化颗粒包含标签和功能性部分的独特组合。
在另一个方面，本公开提供了筛选独特标签化的功能化颗粒的集合以鉴定具有所需性质的功能部分或功能部分的组合的方法，所述方法包括将标签化的功能化颗粒引入测定法中以选择特定的性质；分离表现出所需性质的标签化的功能化颗粒；鉴定分离的标签化的功能化颗粒的标签；以及从标签的身份确定功能部分或功能部分的组合。
该测定可以是体外或体内的，并且所需的性质可以是功能化颗粒或功能化颗粒的组合的位置，浓度，结合亲和力或化学性质。在一些实施方案中，通过如下鉴定独特标签：读取核酸标签的序列；进行肽或质量编码标签的质谱法；或对于作为荧光染料、量子点或纳米金刚石(nanodiamond)的标签进行流式细胞术或显微术。
从以下本发明的详细描述结合所附权利要求书将更充分地理解本公开的这些和其它特征和优点。应当注意，权利要求的范围由其中的叙述定义，而不是通过本说明书中阐述的特征和优点的具体讨论定义。
附图简述
根据以下附图可以获得对本公开更好的理解，这些所列的附图仅为了说明的目的，而不应当理解为以任何方式限制本发明的范围。
图1显示了独特核酸标签的示意图。
图2显示了独特核苷酸标签的扩增的示意图。
图3显示了用于制备用于测序的样品的引物的示意图(正向引物为seqidno:01，反向引物为seqidno:07；且靶标为seqidno:05)。
图4显示了计数和作为丰度的函数等级排序的颗粒条形码的图。
图5显示了组合单细胞概貌分析(profiling)与肿瘤细胞的标签化的功能化颗粒的方法。然后将细胞的异质性群体暴露于独特标签化的功能化颗粒的集合，其中每种颗粒与功能性部分或部分的组合连接。该细胞然后在原位或在单细胞分离后进行概貌分析。
图6显示了将核酸附接至颗粒的基于核酸的潜在方法的示意图。
本领域技术人员将理解，附图中的元件为了简单和清楚而示出，并且未必按比例绘制。例如，附图中的一些元件的尺寸可以相对于其他元件放大，以帮助提高对本公开的实施方案的理解。
发明详述
本公开涉及使用独特鉴定每种类型的功能化颗粒的标签来使功能化颗粒标签化的一般方法。然后可以汇集多种不同的标签化颗粒，然后将标签化的功能化颗粒的这种复合混合物引入体外或体内测定法中以选择特定性质。然后可以分离显示所需性质的颗粒(例如，通过它们在体内的位置或浓度，结合亲和力，化学性质等)，并且可以读取它们的标签。这有助于容易地鉴定具有所需性质的功能化颗粒。
在一个方面，本公开提供了包含与颗粒连接的一个或多个功能性部分和独特标签的标签化的功能化颗粒。
在另一个方面，本公开提供制备标签化的功能化颗粒的方法，包括将一个或多个功能部分和独特的标签连接至颗粒。
如本文所使用的，术语“标签”和“独特标签”指代任何化学部分，其独特地鉴定与其连接的颗粒。该标签与颗粒和功能化颗粒分开合成(即在将标签连接于颗粒之前)。标签不参与筛选过程(即标签用来鉴定功能化颗粒，而不影响或筛选所需性质)。在合成标签化的功能化颗粒之前，标签序列是规定的(即用户定义的)，并与具有已知(即用户定义的)功能性部分的仅一种类型的颗粒独特相关。
在某些实施方案中，独特标签是核酸(即寡核苷酸)，其中该寡核苷酸为5-150核苷酸(即条形码)的单链或双链dna、rna或xna。在一些实施方案中，所述寡核苷酸可以是约5至约150个核苷酸长，约5至约100个核苷酸长，约5至约90个核苷酸长，约5至约80个核苷酸长，约5至约70个核苷酸长，约5至约60个核苷酸长，约5至约50个核苷酸长，约5至约45个核苷酸长，约5至约40个核苷酸长，约5至约35个核苷酸长，约5至约30个核苷酸长，约5至约25个核苷酸长，约5至约20个核苷酸长，约5至约15个核苷酸长，或约5至约10个核苷酸长，且就寡核苷酸能够实现所需的结果而言具体公开的大小长度中间的所有寡核苷酸。相应的，考虑5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,和100个核苷酸长的寡核苷酸。根据标准原则设计核酸序列以最小化二级结构，脱靶结合和复杂性(参见，例如，miretal.,plosone8(12):e82933(2013)；bystrykh,plosone7(5):e36852(2012))。单链寡核苷酸可以在商业上合成或获得(例如，integrateddnatechnologies)。制备预定序列的寡核苷酸的方法是公知的。参见例如sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual(2nded.1989)和f.eckstein(ed.)oligonucleotidesandanalogues,1sted.(oxforduniversitypress,newyork,1991)，其全部内容通过引用并入本文。
在其它实施方案中，所述标签是肽，其中所述肽是短肽、类肽，或特定模式的同位素标记肽(aspecificpatternofisotopelabeledpeptide)。在此类实施方案中，肽或类肽可以是已知序列的5-20个氨基酸。
在其它实施方案中，所述标签是光学编码标签，其中光学组分是荧光分子或染料之一或组合(荧光分子或染料的非限制性实例可以是绿色荧光蛋白(gfp)，青色荧光蛋白(cfp)，黄色荧光蛋白(yfp)，蓝色荧光蛋白(bfp)，hcred，dsred，mcherry，若丹明，吖啶染料，异硫氰酸荧光素(fitc)，
在其它实施方案中，标签是光学编码的标签，其中光学组分是量子点之一或组合(量子点是小颗粒，并且可以是由半导体材料制成的纳米晶体，其足够小以显示出独特的量子机械和/或光学性质；金属如金，银，铁，钴，锌，镉，镍，钆，铬，铜，锰，钯，锡和合金和/或其氧化物的传统上硫族化物(硒化物或硫化物)(例如cdse，zno或zns)，其直径范围为2至10纳米，聚合物点(参见zhangetal.,angewandtechemieintedengl.52(15):4127-31,(2013))，纳米金刚石和
在另一个实施方案中，独特的标签是质量编码或同位素编码标签，其中所述质量编码标签是镧系元素元素原子或肽(单种类或其组合)。
术语“功能性部分”是指要测试所需性质的任何化学或生物学部分。在一些实施方案中，功能性部分是单克隆抗体，多克隆抗体，单链抗体，单域抗体或纳米抗体，双特异性抗体，affibody分子，肽，类肽，小分子(通常但并不总是小于约1000da的有机化合物，但可以包括与金属络合或螯合的有机化合物)，适体或其他核酸或其它化合物。功能性部分可以存在于功能性部分的文库中。文库的非限制性实例包括合成小分子，天然产物或提取物，和纯化的酶例如蛋白酶或激酶的文库。在一些实施方案中，功能性部分是不能在单一固体支持物上合成的部分。这些功能性部分的代表性实例是抗体和聚合物(除例如核酸和氨基酸聚合物外)。
在一个实施方案中，功能性部分是抗体。如本文所用，术语“抗体”是指任何免疫球蛋白，无论是天然的还是全部或部分合成产生的。保持特异性结合能力的所有其衍生物也包括在该术语中。该术语还涵盖具有与免疫球蛋白结合结构域同源或大部分同源的结合结构域的任何蛋白质。此类蛋白质可以衍生自天然来源，或部分或全部合成产生。抗体可以是单克隆或多克隆的。抗体可以是任何免疫球蛋白类别的成员，包括任何以下人类类别：igg，igm，iga，igd和ige。如本文所用，术语“抗体片段”是指小于全长的抗体的任何衍生物。通常，抗体片段保留全长抗体的特异性结合能力的至少相当大的部分。抗体片段的实例包括但不限于fab，fab'，f(ab')2，scfv，fv，dsfv双抗体和fd片段。可以通过任何方式产生抗体片段。例如，抗体片段可以通过完整抗体的断裂酶促或化学产生，和/或可以从编码部分抗体序列的基因重组产生。或者或另外，抗体片段可以全部或部分合成产生。抗体片段可任选地包含单链抗体片段。或者或另外，抗体片段可以包含连接在一起的多个链，例如通过二硫键。抗体片段可任选地包含多分子复合物。功能性抗体片段通常包含至少约50个氨基酸，更典型地包含至少约200个氨基酸。许多标志物的抗体是本领域技术人员已知的，并且可以商业获得或通过已知方法例如使用噬菌体展示或酵母展示技术容易地获得。
在另一个实施方案中，功能部分是适体。有时称为“合成抗体”，适体是预先选择的单链寡核苷酸(例如dna或rna)或肽分子，其以与抗体相当的亲和力和特异性结合特定靶分子，包括蛋白质和肽。这些分子由于它们倾向于形成具有特定结合袋的螺旋和单链环而可以呈现多种形状，解释了它们与多种靶标结合的多功能性。它们的特异性和特征不是由其一级序列，而是由它们的三级结构直接确定的，所述三级结构类似于trna的球形形状。适体具有广泛的应用，包括诊断和治疗，并且可以使用已知技术化学合成。此外，适体可以提供优于传统抗体的许多优点，包括避免特别知道精确表位或生物标志物本身的需要。最后，适体通常是非免疫原性的，易于合成，表征，修饰并且表现出对其靶抗原的高特异性和亲和力。
通过使用各种选择技术，可以选择适体以发现靶标，例如在感兴趣的细胞表面上或内部或体液中，而不需要鉴定精确生物标志物或表位本身。在许多情况下，适体鉴定过程可以开始于寡核苷酸库或肽的大随机合并物，所述寡核苷酸库或肽系统地经过针对靶标(例如蛋白质分子)的反复阴性和阳性选择轮次以分离出低亲和性或非特异性结合物。可以收集和扩增(例如pcr扩增)富集合并物中的其余适体，并在随后的选择轮次中使用。通常进行靶标结合，分离和扩增的3至20个循环，然后表征候选适体的结合亲和力和特异性。该选择过程，称为通过指数富集的配体系统演化(systemicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)或selex，通常用于选择和鉴定针对各种靶标的高度靶向性适体，所述靶标包括完整活细胞。对于从适体文库筛选和分离结合分子(例如适体)的selex方法的综述，参见stoltenburgetal.biomolecularengineering,2007,vol.24,pp.381-403；和ozeretal.,moleculartherapynucleicacids,2014,vol.3,e183，发表于2014年8月5日，两者均通过引用整体并入。已经使用各种方法来分离靶结合和未结合的适体，包括硝酸纤维素滤器结合，基于珠的，电泳，微流体，基于微阵列和显微镜方法。
在一些实施方案中，功能性部分结合体液例如血液、间质或出汗中的靶分析物，例如，葡萄糖或离子如钠，钾，钙或氯化物。在其它实施方案中，功能性部分结合与特定发展阶段或特定疾病状态相关的器官，组织，细胞，细胞外基质组分和/或细胞内隔室(即“靶标”或“标志物”)。在一些实施方案中，靶标是细胞表面上的抗原，例如细胞表面受体，整联蛋白，跨膜蛋白，离子通道和/或膜转运蛋白。在一些实施方案中，靶标是细胞内蛋白。在一些实施方案中，靶标是可溶性蛋白质，例如免疫球蛋白。在一些实施方案中，靶标在疾病区域(例如器官，组织，细胞，亚细胞区域和/或细胞外基质组分)中比在健康区域中更普遍，更易接近和/或更丰富。
术语“颗粒”是指充当也可与独特的标签连接的一个或多个功能性部分的基底或载体的任何化学或物理部分。该颗粒有利于将标签与功能性部分联合，并可以有助于分离或鉴定与功能化颗粒相连的标签。在一些实施方案中，颗粒具有可检测的光学和/或磁性性质。在一个实施方案中，光学可检测的颗粒是可以使用与细胞活力相容的光学装置在活细胞内检测的颗粒。在一些实施方案中，颗粒可以具有独特的光学(即荧光)，机械和热性质；并且是无毒的。颗粒可以包括但不限于金属，半导体和绝缘体颗粒组分，以及聚合物(直链，支链，树枝状分子(dendrimer)(有机和无机))。颗粒的另外的实例包括但不限于量子点，等离子体颗粒如金或银颗粒，上转换纳米晶体(upconvertingnanocrystals)，氧化铁颗粒或其它超顺磁或磁性颗粒，二氧化硅，脂质体，胶束，碳纳米管，掺杂或未掺杂的石墨烯，氧化石墨烯，纳米金刚石，二氧化钛，氧化铝和金属氧化物。在一些实施方案中，颗粒可以是光学或磁性可检测的。在一些实施方案中，包含荧光或发光部分的固有荧光或发光颗粒，等离子体共振纳米颗粒，和磁性颗粒在各种实施方案中使用的可检测颗粒之中。一般而言，颗粒应当具有足够小的尺寸以使其具有功能，但在注射到受试者中时对于受试者无毒性或无害。典型地，颗粒可以具有小于1000nm，900nm，800nm，700nm，600nm，500nm，400nm，300nm，200nm或更小的最长直尺寸(例如直径)。在一些实施方案中，颗粒可以具有200nm或更小的直径。在其它实施方式中，颗粒具有100nm或更小的直径。在一些实施方案中使用较小的颗粒，例如具有50nm或更小的直径，例如5nm-30nm。在一个实施方案中，颗粒尺寸为50nm-300nm。
光学特性可以是吸收，发射或散射光谱的特征或吸收，发射或散射光谱特征的变化。光学性质可以是视觉上可检测的特征，例如颜色，表观尺寸或可见度(即，简单地说颗粒在特定条件下是否可见)。光谱的特征包括例如峰值波长或频率(发生最大发射，散射强度，消光，吸收等的波长或频率)，峰值幅度(例如，峰值发射值，峰值散射强度，峰值吸光度值，等等)，半高度的峰宽度，或由任意前述导出的度量，例如峰值幅度与峰值宽度的比率。某些光谱可以含有多个峰，其中一个峰通常是主峰，并且具有比其它峰显著更大的强度。每个光谱峰具有相关的特征。通常，对于任何特定光谱，参考主峰确定光谱特征，例如峰值波长或频率，峰值幅度，半高度的峰宽度等。每个峰的特征，峰的数量，峰的分离等作为整体可以认为是光谱的特征。可以根据照射颗粒的光的偏振方向的函数来测量上述特征；从而可以测量极化依赖性(polarizationdependence)。可以测量与hyper-rayleigh散射相关的特征。荧光检测可以包括荧光模式的检测。发光检测也可用于光学成像目的。拉曼散射也可以是有用的。
在一些实施方案中，颗粒可以是生物相容的和/或可生物降解的。如本文所用，术语“生物相容的”是指对细胞无毒性或以对细胞无毒性的水平存在的物质。在一些实施方案中，如果物质在体内对细胞的添加不会在体内诱发炎症和/或其他不利影响，则该物质认为是“生物相容的”。在其他实施方案中，构成功能化颗粒的材料可以是通常认为安全的(gras)或fda批准的材料。一般而言，术语“可生物降解的”是指在生理条件下降解的物质。在一些实施方案中，可生物降解的物质是被细胞机器分解的物质。在一些实施方案中，可生物降解的物质是通过化学过程分解的物质。
在一些实施方案中，颗粒包含聚合物基质或珠粒。珠粒是本领域已知的，可从各个制造商获得。可以使用的珠粒的非限制性实例是磁珠(针对包含一种或多种金属或其氧化物或氢氧化物的磁性响应颗粒的磁珠，实例包括但不限于compeltm，promagtm，
在一些实施方案中，颗粒具有可检测的光学和/或磁性性质。在多个实施方案中，固有荧光或发光颗粒，包含荧光或发光部分的颗粒，等离子体共振颗粒和磁性颗粒在可以使用的可检测颗粒之中。此类颗粒可以具有各种不同的形状，包括各种不同的形状，包括球形，扁球形，圆柱体，卵形，椭圆形，壳形，立方形，长方形，圆锥形，锥形，棒形(例如，圆锥形或具有正方形或矩形横截面的细长结构)，四脚锥形(具有四个腿状附属物的纳米颗粒)，三角形，棱形等。颗粒也可以是固体或中空的，并且可以包含一层或多层(例如纳米壳，纳米环等)。颗粒可以具有核/壳结构，其中所述核和壳可以由不同的材料制成。颗粒可以包括梯度或均质合金。颗粒可以是由两种或更多种材料制成的复合材料，其中一种，多于一种或全部材料具有磁性性质，可电学检测性质和/或可光学检测的性质。
术语“功能化颗粒”是指与一个或多个功能部分缔合(例如共价或以其它方式连接)的颗粒。所述功能化颗粒以下述方式合成，使得在组装标签化的功能化颗粒之前确定和知晓标签和功能性部分的身份以及它们之间的对应关系(即，将功能化颗粒与独特的标签连接以包含标签化的功能化颗粒)。在一些实施方案中，标签化的功能化颗粒和标签化的功能化颗粒的文库包含不与靶标或结合配偶体复合或在其它情况下包含靶标或结合配偶体的标签化的功能化颗粒，且它们的文库不与靶标或结合配偶体复合或在其它情况下包含靶标或结合配偶体。
术语“连接”是指将标签或功能性部分与颗粒独特地相关联，缀合或连接的任何方法。例如，标签可以非共价包埋于颗粒聚合物基质中或共价地嵌合到颗粒聚合物基质(参见例如poonetal.,nanolett.11:2096-2103,(2011))。在另一个非限制性实例中，标签可以共价地附接到颗粒表面(参见，例如marguliesetal.,nature437:376-380,(2005))。关于“连接”的唯一要求是实验条件下(例如测定条件)标签保持与功能化颗粒相关联并且可用于检测和鉴定，所述实验条件是标签化的功能化颗粒经历的实验条件。例如，考虑的接头包括线性聚合物(例如，聚乙二醇，聚赖氨酸，葡聚糖等)，支链聚合物(参见例如denkenwalter等人的美国专利号4,289,872，1981年9月15日公告；tam的美国专利号5,229,490，1993年7月20日公告，frechet等人的wo93/21259，1993年10月28日公布，其全部通过引用以其整体并入)；脂质；胆固醇基团(如类固醇)；或碳水化合物或寡糖。其它接头包括一种或多种水溶性聚合物附着物，例如聚氧乙烯二醇或聚丙二醇，如描述于美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192和4,179,337，其全部以引用以其整体并入。本领域已知的作为接头的其它有用的聚合物包括单甲氧基聚乙二醇，葡聚糖，纤维素或其它基于碳水化合物的聚合物，聚(n-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇，以及这些聚合物的混合物。在一些实施方案中，可以使用可切割接头将功能性部分或独特标签与颗粒缀合。在其它实施方案中，接头是不可切割的。
接头可以是功能性基团或反应性基团，或者可以包括功能性基团或反应性基团。功能性基团包括包含反应性基团的单功能性接头以及包含能够与两个或多个不同的功能性靶标(例如标记物，蛋白质，大分子，半导体纳米晶体，或基底)形成键的两个或多个反应性基团的多功能性交联体。在一些实施方案中，所述多功能性交联体是包含两个或多个不同的反应性基团的异双功能性交联体。适合的反应性基团包括但不限于硫醇(--sh)，羧酸盐/酯(-coo)，羧酸(-cooh)，胺(nh2)，羟基(-oh)，醛(-cho)，醇(roh)，酮(r2co)，活性氢，酯，巯基(sh)，磷酸盐/酯(-po3)，光反应性部分，叠氮化物，炔烃，烯烃或四嗪。胺反应性基团包括但不限于例如异硫氰酸盐/酯，异氰酸盐/酯，酰基叠氮化物，nhs酯，磺酰氯，乙醛和乙二醛，环氧化物和环氧乙烷，碳酸盐/酯，芳化剂，亚氨酸酯，碳二亚胺和酸酐。硫醇反应性基团包括但不限于例如卤代乙酰基和卤代烷基衍生物，马来酰亚胺，氮杂环丙烷，丙烯酰基衍生物，芳化剂和硫醇-二硫化物交换试剂。羧酸盐/酯反应性基团包括但不限于例如重氮烷烃和重氮乙酰化合物，例如羰基二咪唑和碳二亚胺。羟基反应性基团包括但不限于例如环氧化物和环氧乙烷，羰基二咪唑，使用高碘酸氧化，n,n'-二琥珀酰亚胺盐/酯，n-羟基琥珀酰亚胺氯甲酸盐/酯，酶氧化，卤代烷基和异氰酸盐/酯。醛和酮反应性基团包括但不限于例如用于席夫碱形成或还原胺化的肼衍生物。活性氢反应性基团包括但不限于例如用于曼尼希缩合和碘化反应的重氮化合物衍生物。光反应性基团包括但不限于例如芳基叠氮化物和卤代芳基叠氮化物，二苯甲酮，重氮化合物和双吖丙啶(diazirine)衍生物。
其它适合的反应性基团和反应类别包括生物共轭化学领域公知的那些。目前与反应性螯合物一起可用的有利的反应类型是在相对温和条件下进行的那些。这些包括但不限于亲核取代(例如，胺和醇与卤化酰基，活性酯的反应)，亲电子取代(例如烯胺反应)以及碳-碳和碳-杂原子多键的添加(例如，michael反应，diels-alder添加)。这些和其它有用的反应在例如march(1985)advancedorganicchemistry,3rded.,johnwiley&sons,newyork,hermanson(1996)bioconjugatetechniques,academicpress,sandiego；和feeneyetal.(1982)modificationofproteins；advancesinchemistryseries,vol.198,americanchemicalsociety,washington,d.c.中讨论，其全部内容通过引用并入本文。
在某些实施方案中，通过汇集两种或更多种类型的标签化的功能化颗粒来制备标签化的功能化颗粒的集合，其中每种类型的功能化颗粒包含标签和功能性部分的独特组合。例如，标签化的功能化颗粒的集合可以包含多种(例如，100种)类型的功能化颗粒，每种类型包含特定抗体和标签。在另一个实施方案中，功能化颗粒的集合中标签化的功能化颗粒的类型包括其中多种抗体之一(例如，100种之一)和多种小分子之一(例如，100种小分子之一)的颗粒。在存在100种不同抗体和100种小分子的此类实施方案中，所述集合将包含10,000种不同的功能化颗粒，每种经独特地标签化以鉴定与标签化的颗粒相关的抗体和小分子的特定组合，跨越所有可能的组合。
在另一方面，本公开提供了筛选独特标签化的功能化颗粒的集合以鉴定具有所需性质的功能部分或功能部分的组合的方法，所述方法包括将标签化的功能化颗粒的集合引入测定法以选择特定的性质；分离表现出所需性质的标签化的功能化颗粒；鉴定分离的标签化的功能化颗粒的标签；以及从标签的身份确定功能部分或功能部分的组合。
在一些实施方案中，所述测定法是体外或体内的，并且所需性质是功能部分或功能部分的组合的位置，浓度，结合亲和力，药代动力学，药效学或化学性质。测定法的非限制性实例包括分离的分子靶标测定法，无细胞多组分测定法和基于细胞或生物体的测定法。在一些实施方案中，所述测定法筛选功能化颗粒的合并物或集合以结合工程化或患者来源的细胞系或组织的能力。一般而言，筛选在功能性部分(例如配体)保持附接到颗粒时进行。
在另一个实施方案中，通过本领域技术人员根据所使用的独特标签将认为适当的方法读取所述独特标签。例如，如果标签是核酸，则可以使用核苷酸测序；如果标签是肽或质量编码的或同位素编码的，则可以使用质谱分析；或者如果标签是荧光染料，量子点或纳米金刚石，则可以使用流式细胞术或显微术。
本文所述方法中使用的核苷酸测序技术可产生例如每读取约30bp，约40bp，约50bp，约60bp，约70bp，约80bp，约90bp，约100bp，约110bp，约150bp，约200bp，约250bp，约300bp，约350bp，约400bp，约450bp，约500bp，约550bp或约600bp。核苷酸测序技术可以包括但不限于maxam-gilbert测序，链终止方法，下一代方法(例如，大规模并行签名测序(mpss)，polony测序，454焦磷酸测序，illumina(solexa)测序，solid测序，离子激流半导体测序，dna纳米球测序，heliscope单分子测序，单分子实时(smrt)测序)，纳米孔dna测序，杂交测序，质谱测序，微流体sanger测序或体外病毒高通量测序。
由于每种功能化颗粒包含与所述颗粒缔合的功能性部分或功能性部分的组合的独特标签，在标签被读取(即鉴定)之后，可以鉴定特定功能部分或功能部分的组合。
本文描述的方法可用于鉴定可用于本领域已知的诊断系统，药物目的，化妆品和药用目的的各种分子。此外，该方法可以允许研究人员快速进行数百万次化学，遗传或药理学测试。通过这一方法可以快速鉴定调节特定生物分子途径的活性化合物，抗体或基因。
诊断系统可以非侵入性地检测和测量受试者的多个生理参数，其可以包括可能涉及受试者健康的任何参数。例如，系统可以包括用于测量血压，脉率，皮肤温度等的传感器。至少一些生理参数可以通过系统来获得，所述系统非侵入性地检测和/或测量表面下脉管系统中循环的血液中的一种或多种分析物。一种或多种分析物可以是任何分析物，其当存在于或不存在于血液中时，或以特定浓度或浓度范围存在时，可以指示人的医学状况或健康。例如，所述一种或多种分析物可以包括离子例如钠钾、钙和氯、酶、激素、蛋白、药物代谢物、肿瘤细胞、肿瘤标志物或其它分子。
在一个实例实施方案中，系统通过检测临床相关分析物对或与材料例如功能化颗粒的结合或相互作用获得至少一些健康相关的信息，所述材料引入表面下脉管系统表面下脉管系统的腔体中，其已经使用靶向实体功能化，所述靶向实体具有特异性亲和力以结合特定分析物例如葡萄糖或与其相互作用。术语“结合”以其最广泛的意义理解，使得还包括临床相关分析物和标签化的功能化颗粒之间的可检测相互作用。标签化的功能化颗粒可以通过注射，摄入，吸入，经皮或以某种其它方式引入受试者的血液流中。
标签化的功能化颗粒可以通过共价或以其他方式附着或关联靶向实体来功能化，所述靶向实体以对靶分析物确定的亲和力特异性结合，经历细胞摄取，或以其它方式与特定临床相关的靶分析物相互作用。也可以将其它化合物或分子附着于颗粒，例如报告物标记物如荧光团或自发荧光或发光标记物或非光学造影剂(例如声阻抗造影剂，rf造影剂等)，其可以有助于在体内询问功能化颗粒。
标签化的功能化颗粒可以包含具有通常等于或小于约200微米的直径的纳米颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒具有约10纳米至1微米量级的直径。在另外的实施方案中，直径为10-100纳米量级的小纳米颗粒可以组装形成1-10微米量级的较大的“簇”或组装物。此外，纳米颗粒可以是任何形状，例如球形，棒，非对称形状等。
该系统还可以包括一个或多个数据收集系统，用于以非侵入方式询问在特定局部区域中表面下脉管系统的腔体中存在的标签化的功能化颗粒。在一个实例中，系统包括检测器，其配置为检测从表面下脉管系统的一部分传输的响应信号。响应信号可以包括分析物响应信号(其可以与一种或多种靶分析物与标签化的功能化颗粒的相互作用相关)，以及背景噪声信号两者。例如，标签化的功能化颗粒可以包括化学发光标志物，其配置为以发光辐射形式产生响应信号，其响应至少部分针对靶分析物与颗粒的结合引发的化学反应而产生。
在一些实例中，系统还可以包括用于传输询问信号的询问信号源，所述询问信号源可以穿透到表面下脉管系统的一部分或另一机体系统，以及检测器，所述检测器用于检测响应询问信号，从表面下脉管系统的该部分或其它机体系统传输的响应信号。询问信号可以是对患者良性的任何种类的信号，例如电磁，磁性，光学，声学，热学，机械的，电的，并且产生响应信号，其可用于测量生理参数，或者更具体的，可以检测临床相关分析物与标签化的功能化颗粒的结合或相互作用。在一个实例中，询问信号是射频(rf)信号，并且响应信号是例如磁共振信号例如核磁共振(nmr)。在另一个实例中，在标签化的功能化颗粒包括荧光团的情况下，询问信号是具有可以激发荧光团并穿透皮肤或其它组织和表面下脉管系统的波长的光学信号(例如，波长在约500到约1000纳米的范围)，并且响应信号是来自荧光团的荧光辐射，其可以穿透表面下血管和组织到达检测器。在另一个实例中，在标签化的功能化颗粒包括导电材料或磁性损耗材料的情况下，询问信号可以是时变磁场或射频(rf)电磁信号，具有足够的信号功率以快速加热颗粒。响应信号可以是由颗粒的快速热膨胀引起的或由与颗粒接触的液体介质的空化引起的颗粒的声发射。如上文所述，在某些情况下，询问信号可以不必产生分析物响应信号。
另外，系统还可以包括配置成调制分析物响应信号的调制源。调制源可以配置成与背景噪声信号不同地调制分析物响应信号。为此，调制可以通过例如提高信噪比来帮助辨别目标分析物和基本上体内的每种其它物质。一般来说，调制可以包括任何空间，时间，光谱，热，磁，机械，电，声，化学或电化学等调制技术或其任何组合。
在某些情况下，也可以有用的是检测和区分分析物响应信号(同与靶分析物结合或相互作用的标签化的功能化颗粒相关)和“未结合”颗粒信号(与不与靶分析物结合或相互作用的标签化的功能化颗粒相关)两者。在一些测量和表征方案中，确定已经与靶分析物结合的引入身体的标签化的功能化颗粒的百分比可以是有用的。在此类情况下，调制源可以配置为相比于未结合颗粒信号不同地调制分析物响应信号。
由检测器收集的数据可以发送到处理器用于分析。处理器可以被配置为通过至少部分地基于调制来从背景噪声信号区分分析物响应信号，非侵入式地检测一种或多种靶分析物。在一些情况下，处理器可以进一步置为从未结合颗粒信号区分分析物响应信号。此外，处理器可以配置为至少部分地从分析物响应信号，确定血液中特定靶分析物的浓度。处理器处理的检测和浓度数据可以与患者通信，传输至医疗或临床人员，本地存储或传输到远程服务器，云和/或数据可以存储或稍后访问的任何其它系统。
处理器可以位于外部读取器上，外部读取器可以作为外部身体安装装置提供，例如项链，腕表，眼镜，移动电话，手持或个人计算装置或其某些组合。由检测器收集的数据可以经由通信接口传送到外部读取器。控制电路可以通过修改与检测器通信的天线的阻抗从而特征地修改来自天线的反向散射来将数据无线传输到外部读取器。在一些实例中，外部读取器可以操作以间歇地询问检测器来提供读数，其通过辐射足够的辐射来为检测器供电以获得测量并通信结果。以这种方式，外部读取器可以随时间获取一系列分析物识别和浓度测量，而不用继续为检测器和/或处理器供电。处理器也可以在远离检测器的另一位置处提供，并且检测器数据经由有线连接，存储卡，usb设备或其他已知方法传送到处理器。或者，处理器可以位于检测器的近端，并且可以被配置为对其收集的数据进行本地分析，然后将分析结果发送到外部读取器或服务器。
外部读取器可以包括用户界面，或者可以将收集的数据进一步发送到具有可以指示数据分析的结果的用户界面的设备。以这种方式，穿戴，握持或查看该装置的人可以察觉到分析和/或潜在的医疗状况。外部读取器还可以配置为产生听觉或触觉(振动)响应，以向患者警告医疗状况。此外，外部读取器还可以被配置为从患者接收关于他/她的健康状态，保健状态(wellnessstate)，活动状态，营养摄入等的信息作为对处理器的附加输入信息。例如，用户可以输入健康或保健状态，例如经历偏头痛症状，神经紧张，赛跑心脏(racingheart)，胃部不适，感觉疲倦，活动状态，包括身体活动营养摄入的类型和持续时间，包括膳食时间和组成等，以及其它参数，包括体重，药物摄取，睡眠质量，压力水平，使用的个人护理产品，环境条件，社会活动等。此外，阅读器还可以从一个或多个其它检测器接收信号，例如计步器，心率传感器，血压传感器，血氧饱和水平，体温，gps或其它位置或定位传感器，麦克风，光传感器等。
系统可以被配置为在预设测量周期期间或响应于提示来获得数据。例如，系统可以被配置为操作检测器并且每小时收集数据一次。在其它例子中，系统可以配置为响应于诸如患者或医师的手动输入的提示来操作检测器。该系统还可以配置为响应于内部或外部事件或事件的组合(例如物理活动期间或之后，休息，高脉搏率，高或低血压，寒冷或炎热天气条件等)获得数据。在其它例子中，系统可以更频繁地或不太频繁地操作检测器，或者系统可以比其它分析物更频繁地测量一些分析物。
系统收集的数据可以用于如上所述通知患者分析物水平或现有或迫近的医疗紧急情况。在一些例子中，数据可以用于为患者开发个体基线概貌。基线概貌可以包括一个或多个患者的分析物水平如何通常随时间而变化的模式，例如在一天，一周或一个月的过程中，或响应于特定类型的食物/药物的消耗。基线概貌实质上可以为患者建立测量分析物的“正常”水平。可以将另外的测量期间收集的另外的数据与基线概貌比较。如果所述另外的数据与基线概貌中体现的模式一致，则可以确定患者的状况没有改变。另一方面，如果所述另外的数据偏离基线概貌中体现的模式，则可以确定患者的状况已经改变。状况的变化可以例如指示患者已经形成疾病，病症或其它不良医疗状况，或者可以有风险在不久的将来严重的医疗状况。此外，状况的变化可以进一步表明患者的饮食习惯的改变，无论是积极还是消极的，这可能是医疗人员感兴趣的。此外，可以将患者的基线和从基线的偏离与从装置的佩戴者群体收集的基线和偏离数据比较。
当检测到状况的改变时，可以咨询临床方案以产生适合于患者的状况改变的一个或多个推荐。例如，可以建议患者他/她自己注射胰岛素，改变他/她的饮食习惯，采取特定的药物或补充物，安排与医护人员的预约，进行特定的医疗检查，去医院寻求立即就医，避免某些活动等。临床方案可以至少部分地基于由服务器得到的分析物浓度和健康状态之间的相关性，患者的任何人已知的健康信息或病史，和/或在医疗领域的认可标准。然后可以将一个或多个推荐传输到外部读取器，以经由用户界面与用户交流。
可以在由系统测量的分析物浓度和患者报告的健康状态之间导出相关性。例如，分析物数据和健康状态数据的分析可以揭示当分析物达到一定浓度时患者对化疗没有响应。该相关性数据可用于为患者生成推荐或开发临床方案。血液分析可以补充其它生理测量，如血压，心率，体温等，以增加或增强这些相关性。
此外，可以使用从多个患者收集的包括分析物测量和健康状态指示的数据来开发由服务器使用的一种或多种临床方案以产生建议和/或由医疗专业人员使用来为其患者提供医疗护理和咨询。该数据还可以用于识别群体中血液分析物与健康状况之间的相关性。健康专业人员可以进一步使用这些数据来诊断和预防生病和疾病，预防群体中的严重的临床事件，并更新临床方案，治疗过程和护理标准。
上述系统可以作为装置实施。在一个实施方案中，该装置是可穿戴装置。如本公开中使用的术语“可穿戴装置”是指能够在身体表面处，之上或邻近身体表面穿戴的任何装置，例如手腕，脚踝，腰部，胸部，耳朵，眼睛或其它身体部分。为了以非侵入性的方式从体外进行体内测量，可穿戴装置可以位于身体的一部分，其中表面下脉管系统易于观察，其条件将取决于使用的检测系统的类型。该装置可以放置在皮肤或组织附近，但不必与其接触或紧密接触。可以提供诸如皮带，腕带，脚踝带，头带等的安装件来将装置安装在身体表面，身体表面上，或临近身体表面。安装件可以防止可穿戴设备相对于身体移动，以减少测量误差和噪音。此外，安装件可以是用于将可穿戴装置粘附到穿着者身体的粘合基底。检测器，调制源，询问信号源(如果适用)，和在一些实例中的处理器可以在可穿戴设备上提供。在其它实施方案中，上述系统可以被作为固定测量装置实施，必须使得用户与其接触或与其临近，或者作为在一个或多个测量周期期间针对身体表面临时放置或保持的装置。
应当理解，提供以上实施例和本文中描述的其它实施例是为了说明的目的，并不旨在限制。
本文引用的所有出版物，专利和专利申请在此明确地通过引用并入本文，用于与本公开一致的程度的所有目的。
本领域技术人员熟知的方法可用于构建根据本公开的表达载体和重组细菌细胞。这些方法包括体外重组dna技术，合成技术，体内重组技术和pcr技术。参见例如描述于maniatisetal.,1989,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork；ausubeletal.,1989,currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingassociatesandwileyinterscience,newyork,和pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications(innisetal.,1990,academicpress,sandiego,ca)中的技术。
在详细描述本发明之前，将定义一些术语。如本文所使用的，单数形式“一个”，“一种”和“该”，除非上下文另有明确规定包括复数指示物。例如，提及“核酸”是指一种或多种核酸。
应当注意，术语“优选”，“通常”和“典型”在本文中不用于限制要求保护的发明的范围或暗示某些特征对于结构或功能是关键的，必要的甚至重要的。相反，这些术语仅用于突出在本发明的特定实施例中可以或不能使用的替代或附加特征。
为了描述和定义本发明的目的，应注意，术语“基本上”在本文中用于表示可以归因于任何定量比较，值，测量或其它表示的固有程度的不确定性。术语“基本上”也用于表示定量表示可以从所述参考值变化而不导致所讨论的主题的基本功能改变的程度。
如本文所用，术语“核酸”，“多核苷酸”，“核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，以指包含dna，rna及其衍生物的单链或双链核酸(例如异核酸(xenonucleicacids,xna)，使用合成的核酸制备并如dna或rna能够进行信息储存)，或其组合。
实施例
以下实施例是说明本发明具体实施方式及其各种用途。它们仅仅是为了说明的目的而提出的，并不认为是对本发明的限制。
实施例1：基于核酸的方法
含有独特序列(即独特标签)的dna(单链或双链)或rna或xna(异核酸，使用合成核酸制备，并如dna或rna能够进行信息储存)分子可以非共价或共价包埋于颗粒聚合物基质或核心内。例如，可以将带负电荷的核酸整合到聚电解质多层中(即，逐层系统；参见poonetal.,nanolett.11:2096-2103,(2011))。或者，核酸可以共价附接到颗粒表面或与附接于颗粒表面的互补序列杂交。表面可以用合适的化学基团功能化以与核酸上的基团结合(共价或非共价)。例如，表面上的-cooh基团与-nh2功能化的dna反应；或表面上的链霉抗生物素蛋白与生物素化的dna结合；或表面上的共同核酸序列促进与条形码上的反向互补物杂交(参见marguliesetal.,nature437:376-380,(2005))。
在体外或体内进行颗粒选择之后，可以回收核酸并在大规模平行测序仪上测序以揭示标签身份和相对丰度，以及相应的颗粒身份和性质。核酸回收可以需要适合的化学和/或酶促条件以去除任何外部保护层(例如胰蛋白酶以降解聚-l-赖氨酸保护层)，或除去共价或非共价连接，并在适合的溶液中洗脱。
定量pcr也可以用作通过使用条形码特异性pcr读出标签子集的相对量的方式。
核酸设计
根据标准原理设计条形码序列以使二级结构，脱靶结合和复杂性最小化(参见例如miretal.,plosone8(12):e82933(2013)；bystrykh,plosone7(5):e36852(2012))。如图1所示，可以商业(例如使用integrateddnatechnologies)合成单链寡核苷酸。
标签化的功能化颗粒条码可以由6-25个核苷酸的已知序列组成，并且侧翼有共同衔接头序列(独特条形码的数目是4^n，其中n是条形码的长度)。该分子可退火至其反向互补物以形成双链构建体，或作为单链使用。在如上所述将寡核苷酸引入颗粒之中或之上后，通过标准化学法，可以使用另外的涂层，靶向基团，隐形层(stealthlayer)等进一步功能化特定的条形码化颗粒(参见例如wang&thanou,pharma.res.6(2):90-99(2010)；weisslederetal.,naturebiotech,23(11):1418-1423(2005),和davisetal.,nature464:1067-1071(2010))。然后可以合并不同的颗粒类型，并进行体外或体内细胞计数以选择具有某些性质的颗粒。选择后，可以如图2所示扩增核酸。该扩增可以发生在颗粒表面上，或者在从颗粒表面释放之后(或直接在颗粒表面上)。
在本实验中，正向引物(aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct；seqidno:01)含有illuminap5测序衔接头(aatgatacggcgaccaccgaga；seqidno:02)，且反向引物(caagcagaagacggcatacgagatnnnnnnnnnngtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct；seqidno:03)含有illuminap7衔接头(caagcagaagacggcatacgagat；seqidno:04)。反向引物中还有第二“分子”条形码。还可以在正向引物例如seqidno:01中包括分子条形码。双重分子条形码形式将消除嵌合体并改善计数统计量。也可以使用固定分子标签序列代替简并(nnnnnnnn；seqidno：06)序列，其中该标签是设计并预先已知的。分子条形码可以用作以下两个目的之一：第一，通过使其成为完全或部分简并的序列，其可以用作条形码分子的分子标签。这将改善后续计数统计量，其通过使得读取与共同分子条形码折叠(collapse)成单个读取，从而消除pcr扩增偏倚。第二，可以选择分子标签以使用同一组条形码实现多路复用(multiplexing)实验。例如，可以用颗粒条形码组并将分子标签“a”添加到所有条形码进行一次实验，然后用相同的条形码并向所有条形码添加分子标签“b”进行第二次实验。然后可以将两次扩增产物合并并一起测序，且分子标签将鉴定读取的来源。
注意，条形码构建体不一定必须使用传统的化学合成来制备；其也可以依次使用连接，链延伸或基于杂交的方法制备。
结果
使用以下一般序列合成了192种不同的条形码：
5’acacgacgctcttccgatctnnnnnnnnagatcggaagagcacacgtctgaa3’(seqidno:05)
在该实验中，nnnnnnnn(seqidno:06)是包含8核苷酸条形码序列的独特标签。使用聚电解质多层分层方案将条形码加载到ademtech200nm羧基化纳米颗粒上：
初始分层
1.将300μlademtech200nm羧基化纳米颗粒置于1.5mleppendorf管中。
2.用1ml无rna酶无dna酶的水洗涤3次。
3.重悬于300ul无rna酶无dna酶的水中。
4.加入250ul～7.5mg/ml聚精氨酸(溶于水)。
5.置于水平振荡器上并以1500rpm，室温振荡4小时。
6.用1ml无rna酶无dna酶的水洗涤3次。
7.重悬于300ul无rna酶无dna酶的水中。
8.在zetasizer上测量尺寸/zeta电位。
9.根据需要重复步骤4至8以添加聚精氨酸的另外层。
条形码加载
10.向50μl该颗粒混合物中加入5ul的100um单链dna条形码和50ul的2.5mnacl/20％peg缓冲液。
11.置于水平振荡器上并以1500rpm，室温振荡14小时。
12.用1ml2.5mnacl/20％peg缓冲液洗涤颗粒3次。如果需要，保存上清以用于随后的qpcr分析。
13.在300ul2.5mnacl/20％peg缓冲液中重悬颗粒。
14.在zetasizer上测量尺寸/zeta电位。(在milliqh2o中将1μl稀释至1ml)。
然后可以用另外的聚合物层(capped)颗粒以最小化条形码从表面的释放和/或使得能够用靶向或隐形剂进行表面功能化。另外分层/层去除的示例过程可以由以下组成：
帽化(pla)
15.加入250ul～7.5mg/ml聚精氨酸(溶于无核酸酶的水)。
16.置于水平振荡器上并以1500rpm，室温振荡4小时。
17.用1ml无核酸酶的水洗涤3次。
胰蛋白酶降解外部pla层
18.加入50ul的5ng/μl胰蛋白酶。
19.置于水平摇床上，并以1500rpm，37c振荡12小时。
20.用1ml2.5mnacl/20％peg缓冲液洗涤3次。
按照上述方案，将192种单链dna条形码(分成96个的两组)加载到纳米颗粒的192个不同等分试样上。加载之后，将来自每个等分试样的等量纳米颗粒合并到两个池中(每个池具有96种不同类型的纳米颗粒)。将溶液稀释10^6倍并用图3中所示的以下引物(各自含有illumina流式细胞引物)通过pcr扩增条形码。
在这种情况下，反向引物含有作为分子条形码的8核苷酸简并序列(nnnnnnnn；seqidno：xx)。如文上所述，该条形码有助于消除pcr偏倚，并可以实现多路复用实验。
将得到的pcr扩增子加载到illuminamiseq测序仪上进行单端52bp测序。颗粒条形码计数并且作为丰度的函数等级排序(见图4)。
这说明了每组的所有96个条形码都存在，并且条形码的加载，混合和扩增在每组中都是一致的(对于两个组，～90/96条形码落在10^4-10^5个读段计数之间)。理论上，完美的情况是每个条形码以相同的频率存在(例如直的扁平线)。在实践中，由于过程的随机性，这可能是尽可能接近理想的。假设在筛选过程之前和之后对条形码纳米颗粒进行测序，可以将任何条形码特异性效果标准化。
实施2：基于肽的方法
类似于用于核酸的策略，但使用短肽，类肽和同位素标记的特定模式来编码颗粒身份。然后可以使用质谱法作为颗粒身份和丰度的读取(参见例如zhouetal.,acschemicalbiology,2(5):337-46(2007))。
实施例3：光学编码
荧光染料，量子点，纳米金刚石或fret系统(使用具有足够的光谱分离和独特的光学性质的组分)的不同组合可以包埋在颗粒内或共价连接到颗粒的表面。然后可以使用流式细胞仪或显微镜来读取所选颗粒的光学性质以进行鉴定(参见例如，hanetal.,natbiotech.19:631-35(2001)；xu&bakker,analchem.79:3716-23(2007)；pregibonetal.,science315:1393-96(2007))。
实施例4：质量编码的颗粒
镧系元素元素原子(单一种类或其组合)可以包埋在颗粒内或附接于颗粒表面。然后可以使用质谱法作为颗粒身份的读取。例如，使用稳定重金属同位素标记的颗粒使用飞行时间(time-of-flight)原子质量细胞计数技术(例如
实施例5：将单细胞概貌分析与标签化的功能化颗粒组合
由于高速率的体细胞突变，克隆扩增和多种多样的肿瘤微环境，实体癌肿瘤由基因和表型异质的细胞群体组成。这种遗传和/或表型多样性也可以自身表现为细胞从原发性肿瘤释放，并开始作为循环肿瘤细胞(ctc)通过循环系统。
可以将肿瘤或ctc的集合暴露于功能化颗粒的集合，以在单细胞水平上表征与功能性部分或部分的组合连接的特定功能化颗粒的身份，所述功能性部分或部分的组合与特定基因型或表型的细胞结合。
可以将组织或细胞与本文所述的功能化颗粒的集合接触，分选到物理分离的孔中，然后表征细胞基因型和/或表型(例如，通过全基因组测序，rnaseq，外显子组捕获，质谱法等)，并且与功能化颗粒连接的独特标签可用于确定与特定基因型或表型相关的功能性部分或部分的组合。细胞分选可以使用有限稀释方法，例如fluidigmc1的微流体单细胞分离平台，批量细胞分选器(bdfacsaria)或这些方法的组合来实现。在用适合的孔特异性条形码进行功能化颗粒的标签和细胞rna或基因组dna两者的文库制备以后，可以将多个样品合并到一起进行单个测序运行。该方法的一个优点是可以基于感兴趣的生物标志物(假定标志物可以被荧光标记)预先选择用于分析的细胞(即如果使用细胞分选则门控)。该方法受到通量的潜在限制，因为在单次实验中每个询问的额外细胞需要独特的孔标签。随着大规模并行dna合成的进展，这可能会得到缓解。
替代将细胞样品和功能化颗粒分选到物理分离的孔中，可以在大规模平行方法中进行原位测序以鉴定功能化颗粒标签和细胞的基本基因型/表型信息。使用功能化颗粒包被的细胞可以包埋在凝胶基质中并且例如在载玻片上物理分离，并且可以在细胞内的位置对rna直接测序(例如参见leeetal.,“highlymultiplexedsubcellularrnasequencinginsitu”science343:1360-63(2014)；leeetal.,natureprotocols10(3):442-58(2015))，例如原位测序用于在单细胞中从>8000个不同基因获得30bp读取。使用该方法，结合功能化颗粒上的条形码的原位测序(例如参见guetal.,“multiplexedsinglemoleculeinteractionprofilingofdnabarcodedproteins”nature2014)，将实现何种特定细胞基因型被特定单一功能化颗粒类型结合的单细胞分辨率。该方法的缺点是目前可用的相对短的读取(目前为30bp量级)以及可用于原位测序的全部基因组/转录物组的子集。
已经详细地并且通过参考其具体实施方式描述了本发明，显而易见的是，在不脱离所附权利要求限定的本发明的范围的情况下，可以进行修改和变化。更具体地说，虽然本发明的一些方面在本文中认为是特别有利的，但是可以预期，本发明不一定限于本发明的这些具体方面。
序列表
<110>威里利生命科学有限责任公司
<120>使颗粒标签化以进行多路复用功能筛选的方法
<130>14-2176-us(gp-23176-00-us)
<140>tbd
<141>2015-04-08
<160>7
<170>patentinversion3.5
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