使用二代测序预测器官移植排斥的方法与流程

本申请涉及一种通过测定获自器官移植受体的生物样品中的供体特异性核酸序列和受体特异性核酸序列之间的比率非侵入性预测器官移植排斥的方法，更具体地，涉及一种基于通过分析获自器官移植受体的生物样品(例如血液)测定源于供体的标志物序列和源于受体的标志序列之间的比率的结果预测器官移植排斥的方法。
背景技术：
：准确及时诊断器官移植受体中的器官移植排斥对于器官移植受体的存活来说是必需的。然而，目前所使用的诊断器官移植排斥的方法具有许多缺陷。例如，用于诊断心脏移植排斥的黄金标准是使用心脏活检手术在各时间点检查组织，然而，此方法显示许多问题，包括高成本，组织活检医生之间的差异性，以及严重的患者不适(f.saraiva等，transplant.proc.卷43，第1908-1912页，2011)。为了克服这些缺陷，已经使用非侵入性方法，诸如，当发生器官移植排斥时测定基因表达信号的方法，测定免疫蛋白水平的方法，等等。然而，由于不同免疫反应的复杂交叉反应而倾向于产生高假阳性结果，并且基于组织特异性基因表达信号，这些方法也有局限性。在九十年代末，在器官移植受体的尿液和血液中检测到源于供体的无细胞dna(cfddna)(j.zhang等，clin.chem.卷45,第1741-1746页,1999.,y.m.lo等，lancet,卷351,第1329-1330页,1998)。基于此发现，已经推荐器官移植排斥的非侵入性诊断方法。例如，可使用检测y染色体的多种分子和化学检测分析具有来自雄性供体器官的雌性受体中的供体特异性dna(t.k.sigdel等，transplantation,卷96,第97-101页,2013)。然而，cfddna微量存在，而背景dna则大量存在。因此，需要用于分析此cfddna的高特异性和敏感的方法。二代测序(ngs)能够克服这些限制，并且越来越普及。不像现有的方法，二代测序技术能够在短时间跨度内产生大量数据。因此，对于个人基因组测序来说，此方法具有时间和成本有效性。二代测序还提供了检测孟德尔疾病、罕见病、癌症等疾病中的致病基因的史无前例的机会。在基因组测序平台方面已取得巨大进步，并且逐渐减少测序数据分析成本。在二代测序技术中，从样品提取dna并进行机械片段化，之后进行尺寸特异性文库构建，用于测序。当通过使用高通量测序系统重复带有一个碱基单元的四种互补核苷酸的缔合和解离时，产生起始测序数据。接下来，进行基于生物信息学的分析，其包括起始数据修整、绘制图谱、基因突变鉴定、以及突变注释。此分析使得鉴定可影响疾病和多种生物表型的基因突变。因此，通过新治疗剂的开发和商业化，二代测序技术有助于产生新的附加值。二代测序技术不仅可用于dna分析，还可用于rna和甲基化分析。这包括全外显子组测序(wes)，其仅对于编码蛋白质的外显子组区进行捕获和测序。此全外显子组测序技术是一种产生与疾病发生具有最直接关联的蛋白质的编码区序列的方法。此技术被广泛使用，这是因为与全基因组测序相比，仅外显子组区的测序更具有成本有效性。全外显子组测序技术的修饰通常被称为靶向测序。此测序技术具有通过使用设计的探针检测感兴趣的区域中的基因突变的能力。所述探针仅捕获感兴趣的基因区，这又转而用于检测感兴趣的主要基因中的基因突变。此技术相对容易实施，能够以显著较低的成本实现。此测序技术被称为靶向测序。使用此二代测序技术使得能够分析样品中存在的所有核酸，由此对于分析以非常低浓度存在于所需样品中的cfddna来说非常有用，这是众所周知的事实。例如，iwijindevlaminck等对于随时间从65名心脏移植患者获得的565份样品进行了分析，显示当出现器官移植排斥时来自受体的样品的cfddna水平升高(iwijindevlaminck等，sci.transl.med.卷6,241ra77,2014)。然而，此方法具有局限性，由于其分析全基因组数据需要大量的时间和成本。因此，本发明的发明人进行了多方面的努力以解决上述问题，结果发现当下列表1至10中所示的标志物被扩增至小于200bp的尺寸并用于二代测序时，样品中的cfdna可以完整使用，同时保持分析敏感性和准确性，分析时间和成本显著降低，由此实现了本发明。技术实现要素：技术问题本发明的目的是提供通过二代测序(ngs)或数字碱基扩增来预测获自从供体接受器官的受体的生物样品中器官移植排斥的方法。本发明的另一个目的是提供一种计算机系统，其包括以多个控制计算系统的指令编码的计算机可读介质，以通过使用二代测序(ngs)或数字碱基扩增对于获自从供体接受器官的受体的生物样品中的器官移植排斥进行预测操作。技术方案为了实现上述目的，本发明提供了通过二代测序(ngs)或数字碱基扩增来预测获自从供体接受器官的受体的生物样品中器官移植排斥的方法，所述方法包括如下步骤：从自供体接受器官的受体非侵入性获得生物样品，所述生物样品含有源于供体和源于受体的无细胞核酸分子；扩增自所述生物样品分离的无细胞核酸分子中的三种或更多种标志物序列，所述标志物序列选自表1至10所示的标志物序列；通过二代测序(ngs)或数字碱基扩增分析所扩增的序列；基于所述序列的分析，测定各所述源于供体的标志物序列和各所述源于受体的标志物序列之间的比率；以及将所述比率与一个或多个截断值进行比较。本发明还提供了通过二代测序(ngs)或数字碱基扩增来预测获自从供体接受器官的受体的生物样品中器官移植排斥的方法，所述方法包括如下步骤：从自供体接受器官的受体非侵入性获得生物样品，所述生物样品含有源于供体和源于受体的无细胞核酸分子；扩增自所述生物样品分离的无细胞核酸分子中的三种或更多种标志物序列，所述标志物序列选自表1至10所示的标志物序列；通过二代测序(ngs)或数字碱基扩增分析所扩增的序列；基于所述序列的分析，测定各所述源于供体的标志物序列和各所述源于受体的标志物序列之间的比率；以及随着时间测定所述比率，当各所述源于供体的标志物序列的比率增加时预测所述受体是否将具有移植排斥、移植物功能障碍或器官衰竭。本发明还提供了一种计算机系统，其包括以多个控制计算系统的指令编码的计算机可读介质，以通过使用二代测序(ngs)或数字碱基扩增对于获自从供体接受器官的受体的生物样品中的器官移植排斥进行预测操作，其中所述生物样品含有自供体接受器官的受体的源于供体的和源于受体的无细胞核酸分子，其中所述操作包括如下步骤：接收通过使用二代测序(ngs)或数字碱基扩增分析自所述生物样品分离的无细胞核酸分子中的三种或更多种标志物序列而获得的数据，所述标志物序列选自表1至10所示的标志物序列；基于所述序列的分析，测定各所述源于供体的标志物序列和各所述源于受体的标志物序列之间的比率；将所述比率与一个或多个截断值进行比较；以及基于所述比较，预测所述受体中是否将存在器官移植排斥。附图说明图1是描述通过二代测序(ngs)预测器官移植排斥的方法的概念视图。如图1所示，从患者非侵入性采集生物样品(例如，血液)，从所述生物样品分离循环无细胞dna。通过多重pcr扩增样品中的所选标志物组，通过短阅阅读长度二代测序分析以计算标志物等位基因之间的比率，由此预测器官移植排斥。图2描述了当使用所设计的引物扩增单个标志物并进行分析时，可以快速实施ngs，这是因为靶snp位点紧接地位于引物之后。图3描述了通过混合dna以人工制造选自表1至10所示标志物的2023种标志物的器官移植条件并检测移植受体中源于供体的snp标志物的百分比所获得的结果。图4描述了检测含有人工混合dna的样品中各snp标志物的结果。有益效果根据本发明所述的通过二代测序(ngs)或数字碱基扩增预测器官移植排斥的方法甚至适用于微量样品。此方法快速、廉价、能够快速进行数据分析、不管世界上各种器官和种族如何均适用，还可以检测测序误差的概率。因此，本发明的方法对于非侵入性预测器官移植排斥至关重要。进行本发明的最佳实施方式除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。一般而言，本文所使用的命名法和下文所描述的实验方法为本领域众所周知和常用的。本文所使用的术语“二代测序(ngs)”是指其中对于全基因组进行片段化并以高通量方式对于片段进行测序的技术。此术语包括agilent、illumina、roche以及lifetechnologies的技术。广义上，此术语包括诸如pacificbio、纳米孔技术(nanoporetechnology)等的第三代测序技术，还包括第四代测序技术。本文所使用的术语“器官移植排斥”包括急性和慢性移植排斥。当供体的器官被受体的免疫系统认作外源性的则发生“急性移植排斥(ar)”。“急性移植排斥”意味着受体的免疫细胞渗透移植的器官，导致移植器官破坏。急性移植排斥发生非常迅速，通常在器官移植手术后数周内发生。通常，急性移植排斥可以被诸如雷帕霉素(rampamycin)、环孢霉素a(cyclosprina)、抗cd4单克隆抗体等的免疫抑制剂阻止或抑制。“慢性移植排斥(cr)”通常在器官移植后数月或数年内发生。在所有类型的慢性移植排斥中发生的器官纤维化是降低各器官功能的普通现象。例如，在移植的肺脏中发生的慢性移植排斥导致纤维化反应，破坏气道，导致肺炎(闭塞性细支气管炎)。另外，当在移植的心脏中发生慢性移植排斥时，其导致纤维化动脉粥样硬化。相似地，移植的肾脏中的慢性移植排斥导致梗阻性肾病，肾硬变，肾小管间质性肾病等。慢性移植排斥还导致与免疫抑制剂相关的局部缺血损伤、移植器官的去神经、高脂血症以及高血压症状。本文所使用的术语“生物样品”是指获自受体并含有一种或多种感兴趣的核酸分子的任何样品。术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)，以及单链或双链形式的它们的聚合物。除非特别限制，此术语包括含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，其与参考核酸具有相似的结合特性，并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，特定的核酸序列还隐含包括它们的保守性修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、snp和互补序列，以及明确指明的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生其中一种或多种所选(或所有)密码子中的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列而实现(batzer等，nucleicacidres.19:5081(1991)；ohtsuka等，j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；和rossolini等,moi.cell.probes8:91-98(1994))。术语“核酸”与基因、cdna、mrna、小非编码rna、微rna(mirna)、piwi相互作用rna、以及由一个基因或基因座编码的短发夹rna(shrna)可互换使用。本文所使用的术语“单核苷酸多态性(snp)”是指单个物种中多个个体之间的单核苷酸差异。例如，当移植供体的染色体13中存在的rs7988514标志物是c/g，移植受体中的标志物是t/a时，本发明的方法可以用于分析受体血液中的源于供体的标志物的比率，由此预测器官移植排斥。本文所使用的术语“截断值”是指这样一种数值：即，其值用于裁定用于生物样品分类的两种或更多种状态(例如，正常状态和器官移植排斥状态)。例如，如果受体血液中的源于供体的标志物的比率大于截断值，则将受体归为器官移植排斥状态，或者如果受体血液中的源于供体的标志物的比率小于截断值，则将受体归为正常状态。在本发明中，发现当使用选自表1至10所示的标志物列表的至少三种标志物通过短阅读长度二代测序或数字碱基扩增分析自受体采集的生物样品时(图1)，能够以高准确性快速预测生物样品中的器官移植排斥。因此，一方面，本发明涉及通过二代测序(ngs)或数字碱基扩增预测获自从供体接受器官的受体的生物样品中器官移植排斥的方法，所述方法包括如下步骤：从自供体接受器官的受体非侵入性获得生物样品，所述生物样品含有源于供体和源于受体的无细胞核酸分子；扩增自所述生物样品分离的无细胞核酸分子中的三种或更多种标志物序列，所述标志物序列选自表1至10所示的标志物序列；通过二代测序(ngs)或数字碱基扩增分析所扩增的序列；基于所述序列的分析，测定各所述源于供体的标志物序列和各所述源于受体的标志物序列之间的比率；以及将所述比率与一个或多个截断值进行比较。在本发明中，表1至10中所列的标志物序列可用作单核苷酸多态性(snp)标志物，其为双等位基因，与哈迪-温伯格(hardy-weinberg)分布一致，具有0.4或更大的次要等位基因频率。在本发明中，表1至10中所列的标志物编号(rs编号)可具有能够在ncbi的dbsnp数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)检索到的参考snp编号。表1：本发明使用的标志物表2：本发明使用的标志物表3：本发明使用的标志物表4：本发明使用的标志物表5：本发明使用的标志物表6：本发明使用的标志物表7：本发明使用的标志物表8：本发明使用的标志物表9：本发明使用的标志物表10：本发明使用的标志物在本发明中，生物样品可以是血液、血浆、血清、尿液或唾液。在本发明中，标志物序列可以具有下列表11中所示的各snp位点的基因型，由此一些snp组合(红色)不能提供可用于预测器官移植排斥的信息，一些snp组合(黄色和绿色)能够提供根据供体特异性和受体特异性snp基因的随机分布全部确定的有用信息。表11：通过使用所选标志物组分析所预测的供体/受体snp组合例如，当分析中使用具有45％次要等位基因频率的snp标志物组合时，通过哈迪-温伯格平衡所计算的各供体特异性等位基因和各受体特异性等位基因之间的比率体现在下表12中。表12：通过使用具有45％次要等位基因频率的snp标志物组合分析而预测的等位基因比率在本发明中，扩增标志物序列的步骤可进一步包括扩增表1至10中所示的所有标志物。在本发明中，标志物序列之间的比率可指各源于供体的标志物序列的量与各源于受体的标志物序列的量之间的比率，所述标志物选自表1至10所示的标志物列表。对于本发明中所使用的ngs平台进行优化以分析具有100bp尺寸的序列片段。当对于ngs平台做选择时要考虑的基本因素包括在相同时间可读的阅读长度、基础误差率、分析速率以及反应效率。在本发明中，显示当扩增表1至10中所列的标志物以优化上述因素时，所需的snp位点位于自测序起始点的35bp内，所扩增的标志物序列的平均长度是70bp(图2)。因此，在本发明中，所扩增的生物样品中的标志物序列的长度可以小于200bp。本发明中所使用的标志物是双等位基因snp位点，是其位置和预期核苷酸序列均已知的标志物。因此，当在任何位置的核苷酸不同于已知核苷酸(例如，a代替正确的核苷酸g/t被读取)时，可被计为一个错误。通过分析图3所示的2023种标志物时，推断可以容易计算出误差率。在本发明中，可以将标志物序列之间的比率连同测序误差率一起计算。在本发明中，截断值可以是从正常生物样品确立的参考值。同时，发现可以通过观察接受器官的受体中源于供体的dna量的时间依赖性变化而预测器官移植排斥。在本发明的另一个实例中，在器官移植前和紧接其后从接受器官的受体获得生物样品，然后在器官移植之后的特定时间间隔获得生物样品。分析所获得的生物样品，结果，观察到当发生器官移植排斥时，源于供体的snp标志物的比率增加。因此，另一方面，本发明涉及通过二代测序(ngs)或数字碱基扩增来预测获自从供体接受器官的受体的生物样品中器官移植排斥的方法，所述方法包括如下步骤：从自供体接受器官的受体非侵入性获得生物样品，所述生物样品含有源于供体和源于受体的无细胞核酸分子；扩增自所述生物样品分离的无细胞核酸分子中的三种或更多种标志物序列，所述标志物序列选自表1至10所示的标志物序列；通过二代测序(ngs)或数字碱基扩增分析所扩增的序列；基于所述序列的分析，测定各所述源于供体的标志物序列和各所述源于受体的标志物序列之间的比率；以及随着时间测定所述比率，当各所述源于供体的标志物序列的比率增加时预测所述受体是否将具有移植排斥、移植物功能障碍或器官衰竭。在本发明中，生物样品可以是血液、血浆、血清、尿液或唾液。在本发明中，扩增标志物序列的步骤进一步包括扩增表1至10所列的所有标志物。在本发明中，标志物序列之间的比率可指各源于供体的标志物序列的量与各源于受体的标志物序列的量之间的比率，所述标志物选自表1至10所示的标志物系列。在本发明中，可以将标志物序列之间的比率连同测序误差率一起计算。在本发明中，所扩增的生物样品中的标志物序列的长度可小于200bp。在本发明中，比率测定时间可选自下组：器官移植前、紧接着器官移植后、以及器官移植后1天、2天、1周、1个月、2个月、3个月、1年、2年以及10年。本发明还涉及一种计算机系统，其包括以多个控制计算系统的指令编码的计算机可读介质，以通过使用二代测序(ngs)或数字碱基扩增对于获自从供体接受器官的受体的生物样品中的器官移植排斥进行预测操作，其中所述生物样品含有自供体接受器官的受体的源于供体的和源于受体的无细胞核酸分子，所述操作包括如下步骤：接收通过使用二代测序(ngs)或数字碱基扩增分析自所述生物样品分离的无细胞核酸分子中的三种或更多种标志物序列而获得的数据，所述标志物序列选自表1至10所示的标志物；基于所述序列的分析，测定各所述源于供体的标志物序列和各所述源于受体的标志物序列之间的比率；将所述比率与一个或多个截断值进行比较；以及基于所述比较，预测所述受体中是否将存在器官移植。实施例以下，将参考实施例进一步详细地描述本发明。对于本领域普通技术人员显而易见的是这些实施例仅用于说明目的，并且不应被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围将由所附权利要求及其等同物来限定。实施例1：预测人工生成的器官移植受体中的器官移植排斥1.1：对于来自器官移植受体的人工dna样品制备和分析的预处理将雄性dna(供体)与雌性dna(受体)混合，使得雌性dna中的雄性dna百分比为0％、0.625％、1.25％、2.5％、5％或10％，由此制备人工器官移植患者基因组dna样品。为使用100ng各gdna进行truseq定制扩增子(tsca)测定(illumina,usa)，制备定制扩增子。将微量恒温仪(heatblock)调整至95℃，将dna和cat(customampliconoligotube)各5μl添加至1.7-ml试管。还制备acd1和acp1各5μl作为对照试剂。将40μlohs1(用于测序的寡核苷酸杂交试剂1)添加至各试管，使用移液枪充分混合，将各试管维持在95℃1分钟，接下来在40℃使其经过寡核苷酸杂交80分钟。之后，降低温度，添加45μlsw1(严格洗液1)试剂至fpu(过滤板单位)板膜，然后，在20℃以2,400×g离心10分钟。使样品试管经过杂交、快速离心(spun-down)，使用移液管将样品转移至fpu板，然后在20℃以2,400×g离心2分钟。之后，使用45μlsw1试剂洗涤样品两次，添加45μlub1(通用缓冲液1)试剂。接下来，在相同条件下进行离心以去除未反应的未结合的寡核苷酸。为了杂交寡核苷酸的延伸连接，将45μlelm3(延伸-连接混合液3)添加至箔纸覆盖的样品中，在保温箱中于37℃温育45分钟。在完成温育之后，去除箔纸，样品以2,400×g离心2分钟。然后，将25μl50mmnaoh添加至样品，然后使用移液管吸吹5至6次，在室温下温育5分钟。在温育过程中，将pmm2/tdp1(pcrmastermix2/truseqdna聚合酶1)混合物添加至含有p5和p7索引序列(index)的pcr试管中。完成温育之后，添加20μl于naoh中稀释的dna，由此制备总量50μl的pcr扩增样品。在如下条件下使所制备的样品经过pcr反应：<pcr条件>-95℃，3分钟-28个循环95℃，30秒66℃，30秒72℃，60秒-72℃，5分钟-保持在10℃在完成pcr循环之后，使用qiaxcel系统分析样品用于确认。然后使用60μl微珠纯化样品，并将其悬浮于30μl重悬浮缓冲液(rs)中。1.2：分析来自器官移植受体的人工dna样品观察到，样品可以使用测序系统来测序，相应的标志物可以被计数，使得能够通过算法和管道监测器官移植排斥(图3和4)。以图形方式显示了使用二代测序鉴定的snp标志物相应的等位基因计数。参考等位基因或主要等位基因的计数表现在x轴上，交互等位基因(alternateallele)或次要等位基因的计数在y轴上表现为log2值(图3)。特别地，因为所选snp标志物为位于染色体13、18以及21的snp，这些标志物分别通过蓝色(●)、绿色(■)以及红色(×)来表示。如下列表13所示，混合dna显示了总共9种表型。表13：混合(器官移植患者)dna的表型mfaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa人工制备的dna的表型可以表现为aa、aa、aa以及aa，由此具有8种分布的可能性(aaaa和aaaa被认为是相同表型)。可以看到，随着源于供体的dna增加，aaaa和aaaa分布以相同速率增加(图3)。如图3所示，源于供体的生物标志物的分布变化取决于生物标志物的混合程度。当对此分布进行定量检测和计算时，可以检测或测定到存在于受体血液中的少量源于供体的基因，当测定和观察源于供体的基因突变量时，可以预测或观察受体中的器官移植排斥。另外，如下列表14所示，当以不同量混合两种dna和通过二代测序实际测定时，可以通过使用二代测序定量分析生物标志物来准确测定甚至微量存在的混合dna的量。表14：混合dna的实验比率和基于snp计数的比率背景(0％)10％5％2.50％1.25％0.63％同源分数0.0013959830.2214430.1237860.0636880.0350090.015802异源分数0.0014956450.1101120.0609440.0324250.0175510.010921实际分数22.08％12.28％6.43％3.51％1.88％在本文中，当对于人工混合的源于供体的dna的对应于aa和aa的碱基进行计数时，可以获得上述表14中所列的数值。尽管在混合dna的实验数值和通过分析所测定的数值之间具有大约2倍的差异，此差异可以出现，这是因为所检测的dna量并非绝对量。如图4所示，尽管标志物相互之间不同，数种标志物的使用使得能够准确测定或观察器官移植排斥。当将本发明的方法实际应用于患者时，可以将源于供体的dna表示为在不同时间点的数值，能够监测器官移植排斥。尽管参考特定特征详细描述了本发明，但是对于本领域技术人员显而易见的是，本说明书仅仅是优选的实施方式，并不限制本发明的范围此。因此，本发明的实际范围将由所附权利要求及其等同物来限定。工业适用性本发明的方法可用于非侵入性预测和监测器官移植排斥，因此，其具有高工业适用性。当前第1页12