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本申请要求2015年4月7日提交的美国临时申请序列号62/143,821和2015年6月4日提交的美国临时申请序列号62/170,717的优先权，其都以其整体在此引入作为参考。
本发明，在其一些实施方案中，涉及治疗和/或预防细胞坏死的组合物和方法，更具体地(但不限于)，通过下调细胞内组织蛋白酶c和/或cela3a和/或cela1和/或与其结构相关的靶标的表达和/或抑制其活性来预防或治疗细胞坏死。
背景技术：
坏死被认为是细胞和活组织死亡的独特过程，与凋亡程序性细胞死亡不同。坏死的特征是细胞肿胀，染色质消化以及血浆和细胞器膜的破坏。晚期坏死的特征在于广泛的dna水解，内质网的空泡化，细胞器分解和细胞裂解。质膜破裂后细胞内内容物的释放是坏死所见的炎症的原因。长期以来，坏死一直被认为是一种意外的细胞死亡病理模式；然而，最近的研究已经提出了几条证据表明坏死是一个控制的过程。
与坏死不同，细胞凋亡是能量依赖性的。细胞凋亡以半胱天冬酶活化和dna裂解的特定模式为特征，然而，这两个过程都不存在于坏死中。
细胞死亡是一个导致不归路的过程。例如，对于全部缺血的肝细胞，细胞死亡大约在150分钟，此时在组织切片中几乎没有观察到任何变化。仅在12至24小时后坏死是完全的。换句话说，细胞在光学显微镜观察到任何坏死变化很久之前就已经死亡。
存在许多坏死的原因，包括例如长时间暴露于损伤、缺血、缺氧、梗塞、感染、癌症、毒物、毒液和炎症。例如，由于缺乏对伤口部位的适当护理而可能引起坏死。
坏死还在包括心肌梗塞、脑中风、肝硬化和其他潜在致命疾病的几种严重疾病的病理学中起作用。心脏衰竭是西方世界最大的杀手之一，其特征在于心肌细胞(心肌细胞)的缺失。众所周知，由坏死导致的细胞死亡在伴随心力衰竭的心肌细胞损失中起重要作用。
目前有几种现有的坏死疗法，包括早期和积极的手术清创和坏死组织探查、高压氧疗法、高压氧疗法、抗生素的施用、抗炎药物的施用和静脉内免疫球蛋白的施用。然而，这些都是成败参半，并且显著的发病率和死亡率可归因于坏死的并发症。
有许多坏死的原因，包括例如长时间暴露于损伤、缺血、缺氧、梗塞、感染、癌症、毒物、毒液和炎症。例如，由于缺乏对伤口部位的适当护理，可能会引起坏死。坏死也在包括心肌梗塞、脑中风、肝硬化和其他潜在致命疾病在内的几种严重疾病的病理学中起作用。心脏衰竭是西方世界最大的杀手之一，其特征在于心肌细胞(心肌细胞)的缺失。众所周知，由坏死导致的细胞死亡在伴随心力衰竭的心肌细胞损失中起重要作用。
此外，坏死过程造成在移植前与保存采集的器官和组织相关的问题。特别地，该过程涉及心脏组织在供体心脏储存过程中的恶化，导致其质量差。其他例子是皮瓣、肾、肝和其他组织的保存和移植。在化疗期间，坏死也涉及对健康组织的细胞毒性。
目前唯一治疗坏死的方法是高压氧治疗。但是，这些不是坏死本身的药物治疗。这就是为什么显著的发病率和死亡率可归因于坏死的并发症。
已经初步显示了催化蛋白质降解的一些弹性蛋白酶涉及坏死性细胞死亡，并且当一些(嗜中性粒细胞弹性蛋白酶)抑制剂化合物以几百微摩尔浓度使用时，用这些抑制剂化合物处理受影响的细胞在体外阻止/治疗细胞坏死(wo2003079969)。
虽然这些初步发现是令人鼓舞的，但考虑到家族成员的广泛性，预先定义有效预防/治疗坏死的高亲和力抑制剂的困难性，以及对哪种弹性蛋白酶家族成员为治疗和预防坏死的有效靶点缺乏了解，其理想的治疗迄今仍然是难以捉摸的。
技术实现要素：
本发明提供了令人惊讶的发现，即抑制一些弹性蛋白酶样蛋白水解酶的表达和/或活性能够高度有效地预防和治疗细胞和组织坏死。令人惊讶的是，组织蛋白酶c、cela1、cela3a或其他结构相关分子的特异性抑制预防和/或治疗细胞和/或组织坏死。
特别地，本发明尤其提供了鉴定非常特定系列的靶标，其在一些方面是蛋白水解酶，并且在一些方面也可以表现出弹性蛋白酶活性，它们的抑制可用本发明描述的化合物、试剂和组合物实现。在一些方面，使用比以前的弹性蛋白酶抑制剂低几个数量级的浓度的本发明所述化合物的特异性体外抑制在预防和/或治疗和/或终止/消除坏死方面出人意料地有效。
在一些方面，这种增强的亲和力涉及鉴定更具体的靶标，以用于本发明所述的组合物，方法、用途、试剂和化合物中的应用。
在一些方面，这种增强的亲和力在一些实施方案中可以反映作为高效治疗性靶标的坏死途径中活性酶的不同子集的鉴定。
在一些方面，这种增强的亲和力涉及鉴定具有不同于先前鉴定的靶标的活性的一类靶标，用于减少细胞和组织坏死的应用。
本发明因此尤其提供，治疗和预防细胞和组织坏死和与其相关的疾病的方法，其通过向需要的受试者给药有效量的特异性抑制组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶的表达和/或活性的药物。
如本发明进一步描述的，特异性抑制组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶的表达和/或活性的此类试剂可以是多核苷酸或多肽抑制剂以及限定的化合物，如本发明进一步所述。
在一些实施方案中，本发明提供一种化合物，其由式i的结构表征：
式i
其中g1为取代或未取代的吡咯烷、取代或未取代的哌啶、取代或未取代的哌嗪、取代或未取代的咪唑烷、或取代或未取代的吡唑烷；且
g3通过以下结构表征：
其中g2为取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环；或
一种化合物，其由式ii的结构表征：
式ii
其中g1为取代或未取代的吡咯烷、取代或未取代的吡啶、取代或未取代的芳基、取代或未取代的哌啶、取代或未取代的哌嗪、取代或未取代的咪唑烷、或取代或未取代的吡唑烷；且
g3通过以下结构表征：
其中g2为取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环；或
一种化合物，其由式iii的结构表征：
式iii
其中g1为取代或未取代的吡咯烷、取代或未取代的吡啶、取代或未取代的芳基、取代或未取代的哌啶、取代或未取代的哌嗪、取代或未取代的咪唑烷、或取代或未取代的吡唑烷；且
g3通过以下结构表征：
其中g2为取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环；或
选自以下的化合物：
3,4-二((2-(吡咯烷-1-基)乙基)氨基)-1,2,5-噻二唑1,1-二氧化物；
环丙基(2-(5-异丙基异噁唑-3-基)吡咯烷-1-基)甲酮；
6-溴-2-(3,5-二甲氧基苯基)-4苯并[d][1,3]噁嗪-4-酮
6-甲基-5-((2-甲基哌啶-1-基)磺酰基)嘧啶-2,4(1h,3h)-二酮；
n-甲基-4,5,6,7,8,9-六氢-1h-环辛四烯并[c]吡唑-3-甲酰胺；
2-(5-(吡啶-4-基)-2h-四唑-2-基)乙酸；
2-(呋喃-2-基)-5,6,7,8-四氢-4h-苯并[4,5]噻吩并[2,3-d][1,3]噁嗪-4-酮；
3-((5-乙酰氨基-1h-1,2,4-三唑-3-基)硫基)丙酸；
n,n'-(氧基二(4,1-亚苯基))二(2-甲基丙酰胺)；
7-(4-乙基哌嗪-1-基)-5,6-二甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶；
7-氟-10-(2-(4-异丙基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)-2,3-二氢-1h-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
特戊酸2-(叔丁基)-3-(1-甲基-1h-苯并[d]咪唑-2-基)-4-氧代-4h-色烯-7-基酯；
3-甲基-8-(哌啶-1-基)-1h-嘌呤-2,6(3h,7h)-二酮；
乙酸2-(3-溴苯基)-4-氧代-4h-苯并[d][1,3]噁嗪-6-基酯；
n-(1-乙基-3,5-二甲基-1h-吡唑-4-基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺；
5-乙基-n-(吡啶-2-基甲基)-5h-[1,2,4]三嗪并[5,6-b]吲哚-3-胺；
3-((4-氯-1h-吡唑-1-基)甲基)-n-(2-(3-氟苯甲酰胺基)乙基)-1,2,4-噁二唑-5-甲酰胺；
1-(4-(甲基硫基)苄基)-4-甲苯磺酰基哌嗪；
2-(2-乙基苯基磺酰氨基)-5-(4-乙基哌嗪-1-基)苯甲酸；
4((2-甲基二氢吲哚-1-基)磺酰基)苯甲酸；
6-溴-2-(3,5-二甲氧基苯基)-4h-苯并[d][1,3]噁嗪-4-酮；
2-氨基-n-(2,4-二氟苯基)嘧啶-5-磺酰胺；
3-甲基-8-(哌啶-1-基)-1h-嘌呤-2,6(3h,7h)-二酮；
5-氯-n-(2-氧代-1-苯基吡咯烷-3-基)噻吩-2-磺酰胺；
3-(吡咯烷-1-基磺酰基)苯甲酸；
(3,5-二甲基-1h-吡唑-1-基)(3,4,5-三甲氧基苯基)甲酮；
n-(3,4-二氟苯基)-2-(8-氟-5,11-二氧代-2,3,11,11a-四氢-1h-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
5-(环己基甲基)-3-(吡啶-2-基)-1,2,4-噁二唑；
5-甲基-4-(2-((4-甲基苄基)氨基)-2-氧代乙基)-7-苯基-4,7-二氢-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-6-甲酸乙酯；
[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-甲酸；
1-(2-(哌啶-1-基)-4,5-二氢-1h-咪唑-1-基)丁-1-酮；
(4-(6-氯-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-3-基)哌嗪-1-基)(1-苯基环丙基)甲酮；
n-(2,4-二氟苯基)-2-(5,11-二氧代-2,3,11,11a-四氢-1h-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂
2,3-二氢-3-氧代-1,2-苯并异噻唑-2-乙酸乙酯-1,1-二氧化物；或它们的药物盐，或它们的任意组合，其用于治疗或预防细胞或组织坏死或与其相关的疾病。
包含如上文所定义的化合物的药物组合物也应理解为也构成本发明的具体方面。
本发明描述了上文刚刚定义的化合物的第一医药用途，所述用途应理解为也构成本发明的具体方面。
本发明进一步提供了治疗细胞或组织坏死或与之相关的疾病或病症的方法，所述方法包括将有效量的如上文所定义的化合物或包含其的药物组合物给予有需要的受试者，或使受影响的细胞或组织与其接触，从而治疗细胞或组织坏死或与其有关的病症。
本发明还提供有效量的上文限定的化合物、或包含其的药物组合物在制备用于治疗在受试者中发生的与细胞或组织坏死相关的疾病或病症的药物中的用途。
在一些方面，其为本发明所述的具体化合物的首次证实的医疗用途，且本发明涉及该化合物。在一些方面，具有特异性抑制组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶的活性的限定活性的本发明所述的化合物或与其结构相关的化合物，为本发明考虑的方面。
在一些实施方案中，本发明的化合物通过以下定义：其选择性结合至组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶或其组合，其最小亲和力为kd10-7m或更小。在一些实施方案中，本发明的化合物通过以下定义：其较少地选择性结合至cela2a、cela3b、或组织蛋白酶a、b、d、e、g、h、k、l1、l2、o、s、w或z或其组合，其在一些实施方案中显示最小亲和力为kd10-6m或更高。
在一些实施方案中，本发明提供包含本发明所述的化合物的任何组合的组合物。在一些实施方案中，该组合物包含有效量的本发明所述的化合物的任何组合，或本发明所述的任何单一化合物。在一些实施方案中，该组合物将包含进一步包含药学可接受的载体或赋形剂。
根据本发明一些实施方案，该药物组合物被配制用于渗透细胞膜。
根据本发明一些实施方案，该药物组合物包含脂质囊泡。
在一些实施方案中，该组合物将进一步包含抗凋亡剂或抗衰老剂。根据本发明一些实施方案，该抗衰老剂选自抗氧化剂、植物化学物质、激素、二甲双胍和脂肪酸。
在一些实施方案中，本发明提供组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶的抑制剂，其中所述抑制剂为选自以下的多核苷酸：反义多核苷酸(antisense)、sirna、微rna、核酶和dna酶，其靶向选自以下的核酸区：seqidno：24、seqidno：25、seqidno：26、seqidno：27、seqidno：28、seqidno：29、seqidno：30、seqidno：31、seqidno：32、seqidno：33、seqidno：34、seqidno：35和seqidno：36。
在一些实施方案中，该cela3a、cela1或组织蛋白酶c抑制剂，为多核苷酸，该多核苷酸试剂与seqidno：1，seqidno：2或seqidno：3的核酸序列的多核苷酸共享至少95％同一性。
在一些实施方案中，该cela3a、cela1或组织蛋白酶c抑制剂，为多核苷酸，该多核苷酸试剂在适中至严格的杂交条件下特异性杂交至cela1或cela3a序列或其组合且不杂交至cela2a或cela3b序列。
在一些实施方案中，该cela3a、cela1或组织蛋白酶c抑制剂，为多核苷酸，该多核苷酸试剂在适中至严格的杂交条件下特异性杂交至组织蛋白酶c且不杂交至组织蛋白酶a、b、d、e、g、h、k、l1、l2、o、s、w或z。
在一些实施方案中，该cela3a、cela1或组织蛋白酶c抑制剂，为多核苷酸，该多核苷酸试剂与seqidno：1中的核酸序列的多核苷酸共享至少95％同一性。在一些实施方案中，该cela3a、cela1或组织蛋白酶c抑制剂，为多核苷酸，该多核苷酸试剂与seqidno：2中的核酸序列的多核苷酸共享至少95％同一性。在一些实施方案中，该cela3a、cela1或组织蛋白酶c抑制剂，为多核苷酸，该多核苷酸试剂与seqidno：3的核酸序列的多核苷酸共享至少95％同一性。
在一些实施方案中，本发明提供包含本发明所述的任何多核苷酸抑制剂的核酸构造体。
在一些实施方案中，本发明提供cela3a、cela1或组织蛋白酶c抑制剂，其中所述试剂为特异性结合且抑制或预防包含选自以下的序列的多肽的功能的抗体：seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13、seqidno：14、seqidno：15、seqidno：16、seqidno：17、seqidno：18、seqidno：19、seqidno：20、seqidno：21、seqidno：22和seqidno：23。
根据本发明一些实施方案，该高亲和力结合分子为抗体或其抗原结合片段，包括fab或scfv片段，这是本领域技术人员理解的。
本发明提供治疗和预防细胞坏死和与其相关的疾病的组合物和方法。
在另外的实施方案中，本发明涉及特异性抑制性小分子预防和治疗坏死的用途，所述特异性抑制性小分子被发现在特别低的浓度下抑制细胞坏死。分子列表包括属于多种化学家族的小分子抑制性化合物，例如2-氨基咪唑啉、2-氨基噻唑啉和异噁唑。本发明还提供多种小分子抑制剂，其用于治疗和/或预防与细胞坏死相关的疾病或医疗病症。在另一实施方案中提供小分子抑制剂在制备用于治疗和/或预防与细胞坏死相关的疾病或医疗病症的药物中的用途。
在一些实施方案中，本发明涉及本发明所述的任何化合物、或任何组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶用于治疗、终止、抑制或预防细胞坏死的用途。在一些实施方案中，经历坏死的细胞选自脑细胞、神经元细胞、浦肯野细胞、海马锥体细胞、神经胶质细胞、心肌细胞、肌肉细胞、角质化细胞、表皮细胞、骨或软骨细胞、胰腺细胞、心肌细胞、肌肉细胞、肝细胞、呼吸道细胞或肺细胞、肝细胞、肾细胞、胃肠细胞、脾细胞、造血细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、胸腺细胞、成纤维细胞、上皮细胞、实质细胞、支气管上皮细胞、肾小管细胞、肾小球毛细管细胞、和肺上皮细胞，和干细胞、生殖细胞、精子、卵子、受精卵、胚细胞、干细胞和视网膜细胞。
在一些实施方案中，本发明涉及本发明所述的任何化合物、或任何cela3a、cela1或组织蛋白酶c抑制剂用于治疗、终止、抑制或预防与细胞或组织坏死相关的疾病或病症的用途。在一些实施方案中，所述疾病或医疗病症选自神经退行性疾病，例如痴呆、帕金森病、阿尔茨海默疾病，亨廷顿疾病，多发性硬化肌萎缩侧索硬化(als)、黄斑变性、年龄相关的黄斑变性(amd)、急性视网膜坏死(arn)、进行性外层视网膜坏死、肌肉萎缩症、白血病、淋巴瘤、新生儿呼吸窘迫、窒息、嵌顿性疝、糖尿病、结核病、子宫内膜异位、血管营养不良、牛皮癣、冻伤、铁负荷并发症、类固醇治疗的并发症、缺血性心脏疾病，心肌梗塞、再灌注损伤、脑血管疾病或损伤(例如中风或外伤性脑损伤)、坏疽、褥疮、胰腺炎、严重急性胰腺炎、肝炎、慢性肝炎、肝硬化、血红蛋白尿、细菌性脓毒病、病毒性脓毒病、烧伤、高热症、克罗恩氏病、腹部疾病、筋膜间隙综合征、坏死性直肠炎、斯-约二氏综合征(sjs)、中毒性表皮坏死(ten)、囊性纤维化、类风湿性关节炎、骨髓炎、坏死性筋膜炎、肾毒性、脊髓损伤、肾小球性肾炎、急性肾小管坏死、肾皮质坏死、退行性关节炎、酪氨酸血症(tyrosemia)、多发性硬化、先天性线粒体疾病、代谢遗传性疾病、支原体疾病、炭疽感染、细菌感染、病毒感染、埃博拉感染、安德森病、先天性线粒体疾病、苯丙酮尿症、胎盘梗塞、梅毒、无菌性坏死、无血管性坏死、酒精中毒、与给予和/或自我给予和/或暴露于可卡因、药物(例如扑热息痛或多柔比星)、化学毒素、农用化学品、重金属、军用有机磷酸酯(warfareorganophosphate)、或蜘蛛或蛇毒相关的坏死；与皮肤填充物施用相关的坏死；与异位药物给药相关的坏死(如葡萄糖溶液、化疗药物的外渗)；化疗诱导的坏死、辐射诱导的坏死、移植组织的维持和衰老。
在一些实施方案中，本发明涉及如本发明所述的任何化合物、或组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关酶的任何抑制剂来改善皮肤的外观或质量的用途，并且在一些实施方案中，涉及如本发明所述的化合物和试剂的化妆品用途。
还提供药物组合物，其包含至少一种药学可接受的载体和治疗有效量的本发明所述的化合物或组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶的任何抑制剂。
在一些实施方案中，本发明的组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶的任何抑制剂将结合至cela3a、cela1或组织蛋白酶c或其组合，其最小亲和力为kd10-7m或更小，且将结合至cela2a和/或cela3b，和/或组织蛋白酶a、b、d、e、g、h、k、l1、l2、o、s、w或z，且相比于cela3a、cela1或组织蛋白酶c的最小结合亲和力，其具有的最小亲和力kd为至少10倍。
在一些实施方案中，该抑制剂可结合cela3b和/或ociad1，其最小亲和力为kd10-7m或更小。在一些实施方案中，根据该方面，该抑制剂具有的序列与seqidno：3的序列共享至少95％同一性。
在一些实施方案中，这样的抑制剂可以比结合cela2a和/或组织蛋白酶a、b、d、e、g、h、k、l1、l2、o、s、w或z更高的亲和力结合cela3b和/或ociad1，且具有如上所述的最小亲和力。在一些实施方案中，根据该方面，抑制剂将具有与seqidno：3的序列具有至少95％同一性的序列。
在一些方面，本发明涉及本发明所述的多核苷酸的保守取代，如本领域技术人员将理解的。
在一些其它实施方案中，提供了在有需要的受试者中治疗与细胞坏死相关的医学疾病或病症的方法。该方法包括向该受试者给药治疗有效量的任何本发明所述的试剂或化合物，视情况包括其类似物、衍生物、片段、异构体或盐。在其它优选实施方案中所述受试者为人或非人哺乳动物。
在一些实施方案中，当细胞处于坏死的早期时，本发明所述的试剂或化合物是有效的。在一些进一步的实施方案中，当细胞已经经历坏死信号时，本发明所述的试剂或化合物是有活性的。
根据另一个实施方案，本发明提供了一种治疗和/或预防有需要的受试者的衰老的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用如本发明所述的任何试剂或化合物或其任何组合；和(b)向受试者施用抗衰老剂，由此治疗和/或预防衰老。
根据本发明的一些实施方案，所述细胞为坏死性细胞。
根据本发明的一些实施方案，该方法进一步包括向受试者施用抗凋亡剂如半胱天冬酶抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，抗凋亡剂在施用如本发明所述的试剂或化合物之前、同时或之后施用。根据本发明的一些实施方案，该方法在体内进行。
根据本发明的一些实施方案，该药物组合物配制用于渗透细胞膜。根据本发明的一些实施方案，该药物组合物包含脂质囊泡。
根据本发明的一些实施方案，所述抗衰老剂选自抗氧化剂、植物化学物质、激素、二甲双胍和脂肪酸。
根据本发明的另一方面，提供了用于通过预防和/或抑制其中对坏死的诱导来存储和保存器官、组织和细胞的功能完整性的方法和组合物。
在一些方面，本发明提供了用于在植入之前保存需要保存的人类、人类相容的或非人类的收获的器官、组织或细胞的方法，包括移植或再植入心脏、肾脏、肝、皮肤、肺和其他器官和组织。此外，本发明提供了复苏后改善收获的器官的保存的方法。本发明进一步允许在保存期间更有效地运送它们以更换地理位置。此外，本发明提供了在保存之外(例如解冻后)在细胞恢复过程中改善细胞活力的方法，以及对植入前时期的评估。此外，本发明提供了在维持、保存和植入期间保存和维持生殖相关细胞，即生殖细胞、精子、卵子、受精卵和/或胚胎细胞的方法。
在一个实施方案中，用于保存生物组织的组合物包含生理盐溶液、用于产生atp的底物和如本发明所公开的抑制剂之一，从而预防或抑制细胞的坏死。任选地，用于产生atp的底物是磷酸肌酸、肌酸乙酯、苹果酸二肌酸、葡萄糖酸肌酸、果糖、蔗糖、核糖、己糖或戊糖。或者，用于产生atp的底物是肌酸乳清酸盐、肌酸一水合物、腺苷或右旋糖/葡萄糖。
在一些实施方案中本发明所述的试剂或化合物为小分子，如本领域所理解的。
在一些实施方案中，本发明所述的试剂或化合物为多核苷酸试剂，其选自反义多核苷酸、sirna、微rna、核酶和dna酶。根据本发明提供的一个实施方案为预防或抑制细胞坏死的方法，该方法包括向经历坏死信号的细胞施用治疗有效量的特异性下调细胞内cela3、cela1和/或组织蛋白酶c的至少一种的表达和/或抑制其活性的试剂，从而预防或抑制细胞坏死。
在一些实施方案中，如本发明所述的试剂或化合物对cela3a具有比对cela3b更高的特异性，但技术人员将会理解，抑制任一种或两种靶标被认为构成本发明的一部分，包括定义为特异性地与其相互作用的试剂和/或定义为特异性抑制其活性的试剂。
在一个特别优选的实施方案中，提供了预防或抑制细胞坏死的方法，该方法包括向经历坏死信号的细胞施用治疗有效量的试剂，其特异性下调包括cela3a和cela3b的cela3的表达且替代地或额外地抑制其活性。
根据本发明另一实施方案，提供了在有需要的受试者中治疗与细胞坏死相关的医学疾病或病症的方法，该方法包括向受试者和/或该受试者细胞中给药治疗有效量的试剂，其特异性下调细胞内组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶至少之一的表达且替代地或额外的抑制其活性，其在一些实施方案中可提供相比抑制cela3a不那么好的活性，但是对表达和/或活性的作用仍是有用的，例如和在一些实施方案中的cela3b，由此治疗与细胞坏死相关的病症。
在另一优选实施方案中，本发明还涉及在适中至严格的杂交条件下特异性杂交至cela3a和/或cela1但不杂交至cela2a或较少杂交至cela3b的分离的多核苷酸的用途。
在一个特别优选的实施方案中，该分离的多核苷酸特异性杂交至cela3a。
在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及特异抑制细胞内组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶至少之一的小分子的用途。
根据本发明一些实施方案的一个方面，所述小分子以kd10-7m以下的最小亲和力特异性结合细胞内组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶的至少之一，并以至少10倍kd的最小亲和力结合至cela2a和/或cela3b和/或结合至组织蛋白酶a、b、d、e、g、h、k、l1、l2、o、s、w或z。
在一些实施方案中，如本发明所述的试剂或化合物与cela3b结合的亲和力低于与cela3a的亲和力，但是如本发明所述的试剂或化合物在适中至严格的杂交条件下以比结合至cela2a和/或组织蛋白酶a、b、d、e、g、h、k、l1、l2、o、s、w或z更大的亲和力结合cela3b。
根据本发明的另一个实施方案，本发明提供高亲和力分子，其结合至少一种由细胞内组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶至少之一的折叠氨基酸序列构成的结构域。
根据本发明一些实施方案的一个方面提供抗体，其以kd10-7m以下的最小亲和力结合至cela3a和cela1，但以至少10倍kd的最小亲和力结合至cela2a或cela3b。
根据本发明一些实施方案的一个方面提供抗体，其以kd10-7m以下的最小亲和力结合至组织蛋白酶c，但以至少10倍kd的最小亲和力结合至组织蛋白酶a、b、d、e、g、h、k、l1、l2、o、s、w或z。
根据本发明一些实施方案的一个方面提供药物组合物，其包含本发明的分离的多核苷酸、本发明的高亲和力分子、或本发明的抗体和药学可接受的载体。
根据本发明一些实施方案的一个方面提供药物组合物，其包含本发明的分离的多核苷酸、抗凋亡剂和药学可接受的载体。
在一些实施方案中，本发明提供包含本发明所述的多核苷酸或多肽的媒介、缀合物、脂质体或载体以及包含其的组合物。
根据本发明一些实施方案的一个方面提供在有需要的受试者中治疗和/或预防衰老的方法，该方法包括：(a)向受试者施用在受试者细胞中特异性下调细胞内组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶至少之一的表达且替代地或额外地抑制其活性的试剂；和(b)向受试者施用抗衰老剂，从而治疗和/或预防衰老。
根据本发明一些实施方案的一个方面提供药物组合物，其包含本发明的分离的多核苷酸、抗衰老剂和药学可接受的载体。
根据本发明一些实施方案，本发明的化合物、试剂、组合物、用途和方法可施用至已经历坏死信号的任何细胞。
根据本发明一些实施方案，选择所述试剂的量以引起细胞坏死至细胞凋亡的转化。
根据本发明一些实施方案，该方法还包括向受试者给药抗凋亡剂。
根据本发明一些实施方案，所述抗凋亡剂选自-[r]-n-[2-庚基]-甲基炔丙基胺(r-2hmp)、维生素e、维生素d、半胱天冬酶抑制剂、下调抗凋亡蛋白质的试剂和亲水性胆盐熊去氧胆酸。
根据本发明一些实施方案，所述抗凋亡剂在施用特异性下调组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶的表达且替代地或额外地抑制其活性的试剂之前、同时或之后施用，其中在一些实施方案中，所述活性更优选cela3a而非cela3b。
根据本发明一些实施方案，所述方法在体内实现。
本发明还涉及抑制细胞内cela3a或结构上相似的酶、cela1和/或组织蛋白酶c中的至少一种以便在体外提供针对坏死的保护的方法。
在一些实施方案中，本发明提供一种化合物，其由式vi的结构表征：
式vi
其中：
g1为任选取代的nh-吡咯烷、任选取代的nh-哌啶、任选取代的nh-哌嗪、任选取代的nh-咪唑烷、任选取代的nh-吡唑烷、任选取代的nh-芳基、任选取代的nh-环烷基、任选取代的吡咯烷、任选取代的哌啶、任选取代的哌啶类(piperidin)、任选取代的哌嗪、任选取代的咪唑烷，或任选取代的吡唑烷；
g2为任选取代的烷基、任选取代的芳基、任选取代的环烷基或任选取代的杂环；
其中：
如果g1为未取代的吡咯烷，则g2不为烷基、环戊基、烷基环戊基或呋喃；或
如果g1为哌啶则g2不为烷基；且
如果g1为哌嗪，则g2不为烷基或呋喃。
在一些实施方案中，g1为吡咯烷且g2为乙基或呋喃。在一些实施方案中，g1为取代的哌嗪且g2为呋喃或苯基且在一些实施方案中，g1为哌啶且g2为环戊基、呋喃或苯基。在一些实施方案中，g1为任选取代的咪唑烷或任选取代的吡唑烷。
在一些实施方案中，本发明提供一种化合物，其由式vii的结构表征：
式vii
其中：
g1为任选取代的nh-吡咯烷、任选取代的nh-哌啶、任选取代的nh-哌嗪、任选取代的nh-咪唑烷、任选取代的nh-吡唑烷、任选取代的nh-吡啶、任选取代的nh-芳基、任选取代的nh-环烷基、任选取代的吡咯烷、任选取代的哌啶、任选取代的哌啶、任选取代的哌嗪、任选取代的咪唑烷、任选取代的吡唑烷或任选取代的芳基；
g2为
g4为任选取代的吡咯烷、任选取代的哌啶、任选取代的哌嗪、任选取代的咪唑烷或任选取代的吡唑烷；
其中：
如果g1为哌啶则g4不为吡咯烷或g2不为任选取代的芳基；或
如果g1为咪唑烷，则g2不为任选取代的芳基；或
如果g1为任选取代的nh-吡啶，则g2不为任选取代的芳基；或
如果g1为任选取代的nh-芳基，则g2不为任选取代的芳基；或
如果g1为任选取代的吡啶，则g2不为任选取代的芳基。
在一些实施方案中，根据该方面，g1为任选取代的nh-吡啶，g2is
g1为取代的nh-芳基且g2为
除非另外定义，否则本发明使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然在本发明的实施方案的实践或测试中可以使用与本发明所述的方法和材料类似或等同的方法和材料，但是在下面描述示例性的方法和/或材料。如果发生冲突，将以包括定义在内的专利说明书为主。另外，这些材料、方法和实例仅是说明性的，并非意在限制。
附图简述
这里仅通过举例的方式参照附图来描述本发明的一些实施方案。现在具体参照附图详细说明，强调的是，所示出的细节是作为示例并且出于对本发明的实施方案的说明性讨论的目的。就这一点，对于本领域技术人员而言，对附图进行的描述使得本领域技术人员明白可以如何实践本发明的实施方案。
在附图中：
图1是描绘u-937细胞中kcn诱导的细胞死亡的动力学的线图。图1说明了kcn诱导的坏死的时间和剂量反应。用吖啶橙和溴化乙锭双重染色确定核形态。
图2是描绘通过酶分析评估的由10mmkcn处理诱导蛋白水解活性的线图。用kcn以不同的时间间隔处理u-937细胞。使用特异性底物测定细胞裂解物中的组织蛋白酶c和弹性蛋白酶样活性(如下文实施例部分中详细描述的)。
图3显示弹性蛋白酶抑制剂iii对细胞中kcn诱导的弹性蛋白酶样活性的剂量依赖性抑制。用10mmkcn处理30分钟后制备细胞裂解物。使用底物maapv测量弹性蛋白酶样活性。组织蛋白酶l抑制剂和e-64d对弹性蛋白酶样蛋白水解活性没有影响。数据未显示。
图4a-b说明sirna对cela1和cela3a的沉默对经历由不同浓度的kcn诱导的坏死的u-937细胞的ldh释放的影响。图4a是说明细胞的条线图，该细胞用对照sirna或针对特定酶的sirna转染并用或不用kcn处理7小时，然后测定ldh从细胞的释放。用对照sirna转染本身没有作用。*p<0.001；图4b描绘了说明蛋白质印迹的照片，证明了由于用合适的sirna处理而导致的特定蛋白的下调。
图4c说明sirna对组织蛋白酶c、cela1和cela3a的沉默对经历由kcn诱导的坏死的pc12细胞的ldh释放的影响。用对照sirna或针对特定酶的sirna转染的pc12细胞在无葡萄糖培养基中预培养1小时，并用或不用kcn处理5小时。此后确定ldh从细胞的释放。*p<0.001。
图5a-b是描绘sirna对弹性蛋白酶活性(图5a)和组织蛋白酶c活性(图5b)的影响的条线图。用对照sirna或针对组织蛋白酶c、cela1或cela3a的sirna处理的细胞被暴露于kcn10mm达30分钟。然后裂解细胞，用特异性比色底物测量裂解物中的组织蛋白酶c或弹性蛋白酶样活性。
图6显示特异性组织蛋白酶c抑制剂对经受由kcn诱导的坏死的pc12细胞的ldh释放的作用。在存在或不存在不同浓度的组织蛋白酶c抑制剂下，将细胞用或不用不同浓度的kcn处理5小时，然后确定确定ldh从细胞的释放。使用弹性蛋白酶抑制剂作为阳性对照。*p<0.01。
图7a-b是描绘不同弹性蛋白酶抑制剂对经历坏死的pc12细胞的保护作用的条线图。图7a-b显示pc12细胞，其分别在存在或不存在不同浓度的弹性蛋白酶抑制剂ii或iii的情况下用或不用kcn处理5小时。然后确定ldh从细胞中的释放；*p<0.05。图7c是描绘弹性蛋白酶抑制剂ii在拯救kcn处理的细胞中长达48小时的保护作用的条线图。将维持在缺乏葡萄糖的培养基中的细胞与或不与弹性蛋白酶抑制剂ii一起温育30分钟。然后将细胞用kcn或不用kcn处理5小时。此后，将培养基更换为完全dmem并孵育24或48小时。弹性蛋白酶抑制剂本身对对照细胞的存活没有影响。使用xtt方法在每个规定时间测量细胞活力，并将结果与它们各自的对照进行比较。
图8a-b是说明弹性蛋白酶抑制剂ii和iii在体内保护小鼠大脑免于闭合性头部损伤的条线图。显示了弹性蛋白酶抑制剂ii和iii对(图8a)神经学严重性评分(nss)的影响的定量，并在图8b上显示了对创伤小鼠脑中坏死区域的发展的定量。*p<0.01。
图9显示化合物z601-4253(2-(哌啶-1-基)噻唑-4-基)(吡咯烷-1-基)甲酮的体内保护作用，该化合物属于针对由扑热息痛(apap)给药引起的肝毒性的2-氨基噻唑类活性化合物。基于cela3a酶的3d结构相似性和拓扑类似物，通过筛选cela3a抑制剂文库发现该化合物。值得注意的是该化合物在施用apap后4小时施用是有活性的。
图10显示化合物1-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4,5-二氢-1h-咪唑-1-基)丙-1-酮(m059-0891)的保护作用，该化合物属于如上所述通过筛选cela3抑制剂文库而发现活性的2-氨基咪唑啉系列。结果显示，在小鼠心肌梗塞/再灌注模型中，通过该抑制剂，坏死和梗塞尺寸显著减少。
图11是弹性蛋白酶蛋白质cela1(seqidno：8)、cela2a(seqidno：27)、cela3a(seqidno：10)和cela3b(seqidno：25)的氨基酸序列的序列比对，其指示氨基酸靶位(对cela1指示黄色，对cela3a指示绿色)，通过欧洲bioinformaticsinstitute(ebi)的clustalw2软件测定。
发明详述
本发明，在一些实施方案中，涉及用于治疗和/或预防细胞或组织坏死和/或与其相关的疾病和病症的组合物和方法，更具体地，但不限于，涉及预防或治疗细胞或组织坏死的组合物和方法，其通过下调以下酶的表达和/或抑制其活性：至少一种细胞内cela3(其在一些实施方案中优选为cela3a或结构相关的酶)，或在一些实施方案中，cela1，或在一些实施方案中，组织蛋白酶c，或在一些实施方案中，其任何组合。
出人意料地是，在此已经发现，一些蛋白水解酶特异性地参与了坏死的早期阶段，并且可以用作确定下调该酶的表达或抑制其活性或下调和抑制二者的化合物或试剂的靶标，该化合物或试剂导致预防坏死、治疗坏死或其组合。
组织蛋白酶c(ctsc)也称为二肽基肽酶i(dpp-1)，是溶酶体外半胱氨酸(exocysteine)蛋白酶。在人类中，它由ctsc基因编码。组织蛋白酶c催化从蛋白质的n-末端切除二肽。已知组织蛋白酶c是弹性蛋白酶的活化剂[turkd.等人，theembojournal(2001)20(23)：6570–6582]。
cela1是糜蛋白酶样弹性蛋白酶家族的成员1。其基因位于染色体12位置12q13。其例如在胰腺、胃、肠、肾、肺、胚胎组织、肝、肌肉、关节、脑、乳腺、脾脏、血液、舌头、骨和膀胱中表达。cela3a是糜蛋白酶样弹性蛋白酶家族的成员3a。其基因位于第一染色体上，位置1p36.12。其例如在胰腺、膀胱、肝脏、前列腺、皮肤、胸腺、结缔组织、脑和血液中表达。
令人惊讶的是，本发明已经显示组织蛋白酶c或cela1或cela3特别是cela3a或与其结构相关的酶的特异性靶向，其用于确定下调该酶的表达或抑制其活性或下调和抑制二者的化合物或试剂，该化合物或试剂导致预防坏死、治疗坏死或其组合。出人意料地是，本发明已经描述了可用于本发明的组合物和用途/方法的新型试剂和新化合物。
还出人意料地是，本发明已经定义了一类试剂和化合物，其可以下调所述酶的表达或抑制其活性或下调和抑制二者，导致预防坏死，治疗坏死或其组合，该化合物的存在可能此前已知，但没有描述其治疗用途。
还出人意料地是，本发明已经定义了一类试剂和化合物，其可以下调所述酶的表达或抑制其活性或下调和抑制二者，从而导致预防坏死，治疗坏死或其组合，其中化合物的存在可能此前已知或治疗用途本身可能以前是已知的，但是在预防、终止细胞或组织坏死或与其相关的疾病、降低其发病率或治疗该疾病方面的具体用途是未知的。
参考附图和所附描述可以更好地理解本发明的原理和操作。
在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应理解本发明的应用不必局限于以下描述中所陈述或通过实施例所列举的细节。本发明能够有其他实施方式，或能够以多种方式实施或实现。而且，应该理解的是，这里使用的措辞和术语是为了描述的目的，而不应该被认为是限制性的。
心肌梗塞，脑损伤，脑中风，肝硬化和许多其他疾病和病症与细胞死亡的坏死形式有关。
尽管将本发明归结为实践，但是本发明人已经发现组织蛋白酶c、cela1、特别是cela3a或结构相关的一种或多种酶是调节坏死细胞应答的细胞靶标，特别是上述酶的下调或抑制可用于保护细胞免受坏死诱导的细胞死亡。
如下文和下文的实施例部分所示，本发明人已经揭示细胞坏死诱导细胞内弹性蛋白酶的活化(参见图2a-b和3)。此外，特异性下调细胞内cela3a、cela1和/或组织蛋白酶c中的至少一种的表达的rna沉默剂防止细胞死亡的坏死形式(参见图4a-b)。此外，通过特异性sirna(分别为seqidno：1-3)抑制这些靶标导致以特异性方式抑制靶细胞中的组织蛋白酶c酶活性或cela1/cela3a弹性蛋白酶样活性(参见图5a-b)。此外，使用小鼠和大鼠的闭合性头部损伤(外伤)模型(参见图8a-b)、小鼠中的apap诱导的肝毒性模型(图9)、和小鼠心肌缺血/再灌注模型(图10)，显示弹性蛋白酶抑制剂在体内预防脑细胞坏死损伤的能力。总之，这些结果证实了对细胞内cela3a或结构相关酶、cela1和/或组织蛋白酶c中的至少一种的下调剂或抑制剂用于治疗或预防坏死诱导的细胞死亡的用途。此外，鉴定cela3a或结构相关的酶和任选的cela1作为坏死过程的主要靶标使得能够设计不干扰其它弹性蛋白酶的酶活性的特异性弹性蛋白酶抑制剂。
因此，根据本发明一方面，提供预防或抑制细胞坏死的方法，该方法包括向经历坏死信号的细胞施用治疗有效量的试剂，该试剂特异性下调细胞内cela3a或结构相关的酶、cela1和/或组织蛋白酶c中至少一种的表达且替代地或额外的抑制其活性。
如本发明所用，短语“坏死”是指细胞在活组织中过早死亡。坏死是一种病理过程，其典型特征在于细胞膜和细胞器破裂，细胞肿胀，线粒体损伤，随后细胞裂解并最终细胞死亡。另外，细胞裂解通常伴有炎症反应，炎症会增加坏死。
坏死诱导的细胞死亡可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法测定，包括例如通过cytotox
根据本发明的一些实施方案，坏死可以与多种医疗病症/疾病相关联，其中每一种都是根据本发明的一些实施方案所考虑的治疗靶标。此类医疗病症/疾病的实例包括但不限于感染、毒素、毒物、放射线、物理创伤、炎症、缺乏营养或氧气供应、化学失衡、血液供应中断、导致细胞或组织死亡的其他状况、或者上述两种或更多种的组合。在一个具体的实施方案中，组织坏死可以与移植和/或在移植期间对组织的不良保存相关联。例如，细胞或组织坏死可以与以下任何一个或多个状况相关联：脓肿、疟疾、贫血、强直、缺氧、呼吸暂停、关节炎、窒息、哮喘、共济失调、萎缩、背痛、流血、blennorhea、恶病质、龋齿、绞痛、便秘、惊厥、咳嗽、紫绀、腹泻、头晕、水肿、干性坏疽、痢疾、消化不良、呼吸困难、肿胀、消瘦、昏厥、疲劳、发烧、纤颤、气性坏疽、遗传病、高血压、浮肿、高血压、低血压、黄疸、消化不良、炎症、失眠、瘙痒、黄疸、低血压、腰痛、消瘦、湿性坏疽、坏疽性口炎、疼痛、麻痹、瘙痒、皮疹、感冒、硬化、癫痫发作、休克、皮疹、溃疡、痉挛、坏疽形成、脊髓痨、心动过速、蛀牙、肿瘤、胃部不适、眩晕或呕吐。
应该理解，坏死可以定位于一组活细胞或者可以散布在一个或多个组织区域(例如坏死组织)上。
术语“组织”是指由设计用于执行一种或多种功能的细胞组成的生物体的一部分。典型地，实体组织被血管化。实例包括但不限于脑组织、视网膜、皮肤组织、肝组织、胰腺组织、骨组织、软骨组织、结缔组织、血液组织、肌肉组织、心脏组织、脑组织、血管组织、肾组织、肺组织、性腺组织、造血组织。
典型地，细胞在从其细胞外环境接收坏死信号之后经历坏死，但不限于此。上述任何条件，例如氧气缺乏、毒物、毒素等，都可引发导致细胞坏死的过程。
如本发明所用，术语“坏死细胞”或“坏死的细胞”涵盖已经接收坏死信号且展现至少一种与坏死相关的表型的任何类型的细胞(如上所述)。
根据本发明教导的细胞可包括例如脑细胞、神经元、心肌细胞、肌肉细胞、皮肤细胞、骨细胞、胰腺细胞、肝细胞、肾细胞、肠细胞、脾细胞、呼吸道细胞、肺细胞、淋巴细胞或单核细胞或本发明所述任何受影响的细胞。
如本发明所用，术语“坏死细胞”进一步涉及任何坏死阶段的细胞。因此，细胞可处于坏死的初始阶段(例如经历细胞肿胀或线粒体损伤)或可处于细胞死亡的最后阶段(例如经历细胞裂解)。
如本发明所用，短语“抑制”或“治疗”是指减少、治愈、逆转、减轻、缓解、最小化、抑制或阻止坏死的有害作用。
在一些方面，当提及预防与细胞或组织坏死相关的疾病时，这是关于在群体水平上减少疾病的发病率。在一些方面，这可以是关于患有重复或复发性疾病的患者，其中无法如以前一样在这样的患者中发展出疾病完全的症状、发病机理或严重性可以用作真实预防的指征。
在一些方面，当提及预防细胞或组织水平上的坏死时，其可以是指经典标志物或组织病理学证据或通常与坏死相关的分泌信号的明显减少。
根据一个实施方案，与没有用本发明的试剂处理但与处理的细胞/组织经历了相同的坏死信号的相同类型的对照坏死细胞/组织相比，治疗或抑制细胞坏死或组织可减少坏死达至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。
如上所述，本发明的这一方面的方法受到对遭受坏死信号的细胞施用特异性下调细胞内cela3a或结构相关的酶、cela1和/或组织蛋白酶c中至少之一的表达且替代地或额外的抑制其活性的试剂。
如本发明所用，“特异性地”是指下调细胞内cela3a或结构相似的酶、cela1和/或组织蛋白酶c中至少之一的表达和/或抑制其活性，但基本上不干扰任何细胞中的其他蛋白质的活性或表达(即非细胞内cela3a、cela1和/或组织蛋白酶c中至少之一的细胞组分的活性或表达的减少少于10％、15％、20％、25％、30％)。具体来说，本发明的教导还提及单一试剂下调细胞内cela3a、cela1和/或组织蛋白酶c至少之一、它们中两者(例如，cela3a和cela1c)或它们全部的表达和/或抑制其活性的能力。
如本发明所用，“下调”或“抑制”可互换使用，指降低、减少、减弱、减轻、最小化、抑制或停止细胞内组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶蛋白质至少之一的表达或活性。根据一个实施方案，与没有用本发明的试剂处理但经历了相同条件的相同类型的细胞内cela3a、cela1和/或组织蛋白酶c蛋白质中至少之一相比，下调细胞内组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶的蛋白质至少之一的表达被下调和/或其活性被抑制了至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。
如本发明所用，术语“表达”是指蛋白质表达或mrna表达。
如本发明所用，短语“细胞内组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶至少之一的活性”是指其生物学活性，例如酶活性。根据一个实施方案，cela3a和/或cela1的活性是指其丝氨酸蛋白酶活性(例如水解蛋白质例如水解弹性蛋白的弹性蛋白酶活性)。根据另一个实施方案，组织蛋白酶c的活性是指其溶酶体半胱氨酸蛋白酶活性(例如活化丝氨酸蛋白酶)。
评估组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶表达或活性的水平(例如其下调)可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法进行。因此，例如，确定细胞内组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶至少之一的蛋白质水平，可例如使用酶联免疫吸附(elisa)测定、免疫荧光(if)测定或化学发光免疫测试(clia)(例如，获自uscn，origene或sigma-aldrich)进行。其可以与酶测定相结合。mrna表达水平可以使用例如，northern印迹分析或rt-qpcr进行。根据本发明的教导可以使用的cela1和/或cela3a活性测定包括例如，ellman酯酶测定(参见ellman，gl等，biochem.pharmacol.7,88-95,1961)或通过流动注射分析(fia)进行酯酶活性测定[参见joga等，biotechnologyletters(2201)23(12)：943-948]。可根据本发明的教导使用的组织蛋白酶c活性测定包括例如可获自uscnlifescienceinc.的ctsc测定试剂盒。
因此，例如，并且如下文实施例3中进一步详细描述的，弹性蛋白酶样活性可通过elisa测量，将n-甲氧基琥珀酰-ala-ala-pro-val对硝基苯胺(maapv)作为底物，而组织蛋白酶c样活性可以通过elisa测量，将gly-phe对硝基苯胺用作底物。
如本发明所用，术语“组织蛋白酶c”涉及属于肽酶c1家族的溶酶体外半胱氨酸蛋白酶，也称为二肽基肽酶i(dpp-1)或组织蛋白酶c(ctsc)，例如np_001107645.1(seqidno：6)所述。
如本发明所述，术语"cela1"涉及糜蛋白酶-样弹性蛋白酶家族成员1(cela1)，也称为弹性蛋白酶-1(ela1)，例如np_001962.3(seqidno：8)所述。
如本发明所述，术语"cela3a"涉及糜蛋白酶-样弹性蛋白酶家族成员3a，也称为弹性蛋白酶家族成员3a，例如np_005738.4(seqidno：10)所述。
可以使用干扰转录和/或翻译的各种分子[例如，rna沉默剂(例如，反义、sirna、shrna、micro-rna)、核酶和dna酶]在基因组和/或转录水平上实现组织蛋白酶c、cela1和cela3a表达的下调。对细胞内cela3a、cela1和/或组织蛋白酶c活性中的至少一种的抑制可以在蛋白质水平上实现，即，使用例如抗体、拮抗剂、切割多肽的酶、小分子、天然抑制剂等抑制蛋白质的活性或引起其降解。
根据一个实施方案，能抑制细胞内cela3a、cela1和/或组织蛋白酶c中至少之一的试剂是高亲和力结合分子，其结合至由组织蛋白酶c、cela3a和cela1的折叠氨基酸序列构成的至少一个结构域。
例如，所述高亲和力结合分子可为能特异结合组织蛋白酶c、cela3a和cela1的适体、抗体或抗体片段。根据一个具体实施方案，所述高亲和力分子包括抗原识别域，例如，特异结合组织蛋白酶c、cela3a和cela1至少一个表位的抗体。如本发明所述，术语“表位”是指与抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。
表位决定簇通常由化学活性表面组的分子如氨基酸或碳水化合物侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
根据本发明的教导可被靶向的cela1和cela3a的示例性表位包括seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13、seqidno：14、seqidno：15、seqidno：16、seqidno：17、seqidno：18、seqidno：19、seqidno：20、seqidno：21、seqidno：22和seqidno：23所示的氨基酸序列。这些示例性氨基酸序列被认为是cela1和cela3a的表位区域，其可被靶向用于其下调。应该理解的是，对于产生的每种抗体，需要进一步使用本领域公知的方法(如elisa或蛋白印迹分析)进行抗体特异性和酶抑制的鉴定试验。
如本发明中使用的术语“抗体”包括完整分子以及其功能片段，如能够结合到巨噬细胞上的fab、f(ab′)2、和fv。功能性抗体片段定义如下：(1)fab，该片段含有抗体分子的单价抗原结合片段，可通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体从而产生完整的轻链和一条重链的一部分而制得；(2)fab′，该抗体分子片段可通过用胃蛋白酶处理完整抗体、接着进行还原从而产生完整的轻链和一条重链的一部分而获得；每个抗体分子均获得两个fab′片段；(3)f(ab′)2，该抗体片段可通过用胃蛋白酶处理完整抗体、随后不进行还原而获得；f(ab′)2为通过两个二硫键保持在一起的两个fab′片段的二聚体；(4)fv，定义为含有表示为两条链的轻链可变区和重链可变区的基因改造片段；和(5)单链抗体(“sca”)，该单链抗体为基因改造分子，其含有轻链可变区和重链可变区，其由合适的多肽接头连接成基因融合的单链分子。
制备多克隆和单克隆抗体及其片段的方法是本领域众所周知的(参见例如，harlow和lane,antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork,1988，其通过引用合并于此)。
根据本发明一些实施方案的抗体片段可通过该抗体的蛋白水解，或通过大肠杆菌(e.coli)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞培养物或其它蛋白表达系统)中编码该片段的dna表达来制备。抗体片段可以通过用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶经常规方法消化完整抗体获得。例如，抗体片段可通过用胃蛋白酶对抗体进行从而提供表示f(ab′)2的5s片段而制得。这个片段可利用硫醇还原剂和任选地利用二硫连键断裂所形成的巯基的封端基团进行进一步的切割，从而产生3.5sfab′单价片段。可替换地，利用胃蛋白酶酶切直接产生两个单价fab′片段和fc片段。这些方法描述在例如goldenberg的美国专利4,036,945和4,331,647以及其中包含的引用文献中，该专利通过引用完整地合并在此。还可参见porter，r.r.[biochem.j.73：119-126(1959)]。也可利用切割抗体的其它方法，如将重链分离从而形成单价轻-重链片段，并进一步对片段进行切割，或其它酶、化学或基因技术，只要该片段能结合到可被完整抗体识别的抗原上。
fv片段包含vh和vl链的缔合体(association)。这种缔合可以是非共价的，如inbar等人所描述的[proc.nat'lacad.sci.usa69：2659-62(19720]。可替换地，该可变链可通过分子间二硫键连接或通过化学物如戊二醛交联。优选地，该fv片段包含通过肽接头连接的vh和vl链。这些单链抗原结合蛋白(sfv)是通过构建结构基因而制备的，该结构基因包含通过寡核苷酸连接的编码vh和vl结构域的dna序列。将结构基因插入到表达载体中，随后将该载体引入到宿主细胞如大肠杆菌中。该重组宿主细胞合成以接头肽桥连该两个v结构域的单一多肽链。制造sfv的方法描述在如[whitlow和filpula,methods2:97-105(1991)；bird等人,science242:423-426(1988)；pack等人,bio/technology11:1271-77(1993)；和美国专利4,946,778中，其以其整体在此引入作为参考。
另一形式的抗体片段是对单一互补决定区(cdr)编码的肽。cdr肽(“最小识别单位”)可通过构建编码感兴趣抗体的cdr的基因获得。此类基因例如通过利用聚合酶链反应制备，从而从产生抗体的细胞的rna合成该可变区。参见，如larrick和fry[methods,2:106-10(1991)]。
非人(如鼠类)抗体的人源化形式(humanizedform)为免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如fv、fab、fab'、f(ab')2或其它抗体的抗原结合序列)的嵌合分子，其包含极小的衍生自非人免疫球蛋白的序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中形成受体互补决定区(cdr)的残基被来自非人物种如小鼠、大鼠或家兔的cdr(供体抗体)、具有期望特异性、亲和性和接受力(capacity)的残基所替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv框架残基被相应的非人类残基替代。人源化抗体还可包含既不能在受体抗体中找到又不能在所输入的cdr或框架序列中找到的残基。一般而言，该人源化抗体包含至少一个、典型地为两个可变结构域的基本全部序列，其中cdr区对应于全部或基本全部的非人免疫球蛋白cdr区，以及全部或基本全部的fr区是人免疫球蛋白共有序列的那些。该人源化抗体还最佳地包含免疫球蛋白恒定区(fc)、典型地为人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分[jones等人，nature，321：522-525(1986)；riechmann等人，nature，332：323-329(1988)；和presta，curr.op.struct.biol.，2：593-596(1992)]。
用于人源化非人抗体的方法是本领域熟知的。一般地，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为输入残基(importresidues)，其典型地取自输入的可变结构域。基本可按winter和同事[jones等人,nature,321:522-525(1986)；riechmann等人,nature332:323-327(1988)；verhoeyen等人,science,239:1534-1536(1988)]的方法，通过用啮齿动物cdr或cdr序列替换人抗体的相应序列进行人源化。因此，此种人源化抗体为嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中不足一个完整的人可变结构域基本上已被来自于非人物种的相应序列所替代。实际上，人源化抗体典型地为这样的人抗体，其中一些cdr残基和可能的一些fr残基被来自于啮齿动物抗体相似位点的残基所替代。
人抗体还可利用多种本领域已知的技术生产，包括噬菌体展示文库(phagedisplaylibraries)[hoogenboom和winter，j.mol.biol.，227：381(1991)；marks等人，j.mol.biol.，222：581(1991)]。cole等人和boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体[(cole等人,monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,p.77(1985)和boerner等人,j.immunol.,147(1):86-95(1991)]。类似地，人抗体可通过将人免疫球蛋白基因座引入到转基因动物中，如内源免疫球蛋白基因被部分或全部灭活的小鼠来生产。挑战(challenge)后，观察到人抗体的产生在各个方面都非常类似于在人中看到的抗体，包括基因重排、组装、和抗体组库(antibodyrepertoire)。该方法描述在如美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，和下列科学出版物中：marks等人,bio/technology10,：779-783(1992)；lonberg等人，nature368：856-859(1994)；morrison，nature368812-13(1994)；fishwild等人,naturebiotechnology14,845-51(1996)；neuberger,naturebiotechnology14:826(1996)；和lonberg和huszar,intern.rev.immunol.13,65-93(1995)。
因此，使用通过识别例如所述酶的构象变化而特异性结合活性酶的抗体，可以影响对细胞内cela3a、cela1和/或组织蛋白酶c酶活性中的至少一种的抑制。或者，抗体可以通过结合酶底物来抑制酶活性。
根据本发明的一个实施方案，提供了一种抗体，其以kd10-7m或更小的最小亲和力与cela3a和cela1结合，但以小至少10倍的最小亲和力(例如，10-6m)结合cela2a或cela3b。根据具体的实施方案，抗体以(10-8–10-10m或10-9-10-10m)范围内的kd结合靶标。
根据本发明的一个实施方案，提供了一种抗体，其以kd10-7m或更小的最小亲和力与组织蛋白酶c结合，但以小至少10倍的最小亲和力(例如，10-6m)结合组织蛋白酶a、b、d、e、g、h、k、l1、l2、o、s、w或z。根据具体的实施方案，抗体以(10-8–10-10m或10-9-10-10m)范围内的kd结合靶标。
根据本发明的教导可以使用的示例性抗体包括但不限于，抗cela1抗体，例如可获自emdmillipore、sigma-aldrich和santacruzbiotechnology；抗cela3a抗体，例如可获自abcam、sigma-aldrich和santacruzbiotechnology；抗组织蛋白酶c/ctsc抗体，例如可获自sigma-aldrich和r&dsystems。如下文进一步描述的，这样的抗体因其特异性是合格的。
其它能抑制组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶的试剂为结合和/或裂解组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶的分子。这样的分子可为组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶拮抗剂，或组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶抑制性肽。
应当理解，组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶的至少一个催化或结合部分的非功能性类似物也可用作抑制组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶的试剂。
可以与本发明的一些实施方案一起使用以抑制组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶的其它试剂是防止组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶活化或或底物结合的分子。
可以与本发明的一些实施方案一起使用以抑制组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶的其它试剂是显性阴性分子，即与组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶的效应子竞争的肽或其变体的一部分。
可以与本发明的一些实施方案一起使用以抑制细胞内组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶至少之一的另一种试剂是在其活化途径中的天然抑制剂。根据本发明的教导可以使用的组织蛋白酶c的示例性天然抑制剂包括但不限于胱抑素f、人蛋白酶抑制剂9(pi-9/serpinb9)、胱抑素c和stefinsa和b。
因此，任何可以穿透或可以被修饰以穿透(如下文进一步详细讨论的)细胞膜并且特异性抑制细胞内组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶至少之一的催化活性的特异性抑制剂可以按照本发明的教导使用。在特别优选的实施方案中，本发明涉及特异性抑制细胞内cela3a或结构上相似的酶cela1和/或组织蛋白酶c中的至少一种的小分子的用途。根据本发明一些实施方案的一个方面，该小分子以kd10-7m或更小的最小亲和力特异性结合细胞内cela3a、cela1和/或组织蛋白酶c的至少一种，且以至少10倍kd的最小亲和力结合至cela2a或cela3b或组织蛋白酶a、b、d、e、g、h、k、l1、l2、o、s、w或z。
在其它方面，本发明涉及特异性弹性蛋白酶抑制剂，例如可获自calbiochem-novabiochem，usa的弹性蛋白酶抑制剂ii(meosuc-aapa-cmk)的用途。
根据本发明可使用的示例性弹性蛋白酶抑制剂还包括非肽小分子。
在一些方面，这样的弹性蛋白酶抑制剂还可以代表本发明的下调cela1、cela3且特别是cela3a和/或组织蛋白酶c的表达和/或抑制其活性的化合物/试剂。在一些方面，基于3d结构相似性和拓扑类似物，这样的小分子cela3或结构上相关的抑制剂可以针对cela3a特异性设计。一些小分子可属于多种化学家族。可以选择性且特异性抑制cela3a或结构上类似的酶的示例性化合物包括本发明表1中列举的那些。
本发明还将被理解为包括下表1中列举的试剂的任何亚组或其衍生物、异构体、盐、氧化物、多晶型物或其它已知形式。
能够抑制坏死的试剂包括属于多种化学家族的其它小分子抑制性化合物，例如2-氨基咪唑啉、2-氨基噻唑和异噁唑。
在一些实施方案中，所述试剂是下表i所述的任何化合物，或者在一些实施方案中，所述试剂是其衍生物、类似物或药用盐或异构体。
在一些实施方案中，表1中描述的试剂的任何组合或亚组被认为是本发明的一部分，并且表示其一个实施方案。
表1：具体化合物和用于本发明的化合物：
可选择性和特异性抑制cela1的示例性化合物包括但不限于n-[4-[4-(异丁酰基氨基)苯氧基]苯基]-2-甲基-丙酰胺、2,3-二氢-3-氧代-1,2-苯并异噻唑-2-乙酸乙酯-1,1-二氧化物。
在一些实施方案中，本发明的化合物和/或本发明的组合物可包含和/或本发明的方法可提供以下试剂的用途和/或本发明的第一医药用途可包括下式表征的试剂：
或其任何组合。在一些方面，本发明的化合物和/或本发明的组合物可包含以下试剂和/或本发明的方法可提供以下试剂的用途和/或本发明的第一医药用途可包括由以下结构表征的试剂：m059-0032；m059-0055；m059-0082；m059-0053；m059-0335；m059-0891；m059-0891；m059-1012，m008-0111；4112-3656；z632-2266；或z601-4253或其任何子集。在一些方面，本发明的化合物和/或本发明的组合物可包含以下试剂和/或本发明的方法可提供以下试剂的用途和/或本发明的第一医药用途可包括由以下结构表征的试剂：m059-0032；m059-0055；m059-0082；m059-0053；m059-0335；m059-0891；m059-0891；m059-1012，或具有类似结构的化合物，该任一个化合物中的中心2-氨基咪唑啉在其2-氨基位置包括被以下基团的取代：取代或未取代的吡咯烷、取代或未取代的哌啶、取代或未取代的哌嗪、取代或未取代的咪唑烷、取代或未取代的吡唑烷、取代或未取代的芳基、取代或未取代的5或6元杂环、或取代或未取代的5或6元环烷基。在一些方面，本发明的化合物和/或本发明的组合物可包含以下试剂和/或本发明的方法可提供以下试剂的用途和/或本发明的第一医药用途可包括由以下结构表征的试剂：m059-0032；m059-0055；m059-0082；m059-0053；m059-0335；m059-0891；m059-0891；m059-1012，或具有类似结构的化合物，任一个化合物中的中心2-氨基咪唑啉在其2-氨基位置包括被以下基团的取代：未取代的吡咯烷、未取代的哌啶、未取代的哌嗪、未取代的咪唑烷、未取代的吡唑烷、未取代的芳基、未取代的5或6元杂环，或未取代的5或6元环烷基。在一些方面，本发明的化合物和/或本发明的组合物可包含以下试剂和/或本发明的方法可提供以下试剂的用途和/或本发明的第一医药用途可包括由以下结构表征的试剂：m059-0032；m059-0055；m059-0082；m059-0053；m059-0335；m059-0891；m059-0891；m059-1012，或具有类似结构的化合物，该任一个化合物中的中心2-氨基咪唑啉在其2-氨基位置包括被以下基团的取代：取代的吡咯烷、取代的哌啶、取代的哌嗪、取代的咪唑烷、取代的吡唑烷、取代的芳基、取代的5或6元杂环、取代的5或6元环烷基。在一些方面，本发明的化合物和/或本发明的组合物可包含以下试剂和/或本发明的方法可提供以下试剂的用途和/或本发明的第一医药用途可包括由以下结构表征的试剂：m059-0032；m059-0055；m059-0082；m059-0053；m059-0335；m059-0891；m059-0891；m059-1012，或具有类似结构的化合物，该任一个化合物中的中心2-氨基咪唑啉在其2-氨基位置包括被以下基团的取代：取代或未取代的吡咯烷、取代或未取代的哌啶、取代或未取代的哌嗪、取代或未取代的咪唑烷、取代或未取代的吡唑烷。
在一些方面，本发明的化合物和/或本发明的组合物可包含以下试剂和/或本发明的方法可提供以下试剂的用途和/或本发明的第一医药用途可包括由以下结构表征的试剂：m008-0111；4112-3656；或z632-2266或其任何子集。
在一些方面，本发明的化合物和/或本发明的组合物可包含以下试剂和/或本发明的方法可提供以下试剂的用途和/或本发明的第一医药用途可包括由以下结构表征的试剂：m008-0111；4112-3656或z632-2266或具有类似结构的化合物，该具有类似结构的化合物中的中心2-氨基噻唑啉在2-氨基位置包括被以下基团的取代：取代或未取代的吡咯烷、取代或未取代的哌啶、取代或未取代的哌嗪、取代或未取代的咪唑烷、取代或未取代的吡唑烷、取代或未取代的芳基、取代或未取代的5或6元杂环、或取代或未取代的5或6元环烷基。在一些方面，本发明的化合物和/或本发明的组合物可包含以下试剂和/或本发明的方法可提供以下试剂的用途和/或本发明的第一医药用途可包括由以下结构表征的试剂：m008-0111；4112-3656；或z632-2266或具有类似结构的化合物，该具有类似结构的化合物中的中心2-氨基噻唑啉或异噁唑在2-氨基位置包括被以下基团的取代：未取代的吡咯烷、未取代的哌啶、未取代的哌嗪、未取代的咪唑烷、未取代的吡唑烷、未取代的芳基、未取代的5或6元杂环，或未取代的5或6元环烷基。在一些方面，本发明的化合物和/或本发明的组合物可包含以下试剂和/或本发明的方法可提供以下试剂的用途和/或本发明的第一医药用途可包括由以下结构表征的试剂：m008-0111；4112-3656或z632-2266或具有类似结构的化合物，该具有类似结构的化合物中的中心2-氨基噻唑啉在2-氨基位置包括被以下基团的取代：取代的吡咯烷、取代的哌啶、取代的哌嗪、取代的咪唑烷、取代的吡唑烷、取代的芳基、取代的5或6元杂环、取代的5或6元环烷基。
在一些方面，本发明的化合物和/或本发明的组合物可包含以下试剂和/或本发明的方法可提供以下试剂的用途和/或本发明的第一医药用途可包括由以下结构表征的试剂：式i：
式i
其中g1为取代或未取代的吡咯烷、取代或未取代的哌啶、取代或未取代的哌嗪、取代或未取代的咪唑烷、或取代或未取代的吡唑烷；且
g3通过以下结构表征：
其中g2为取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环；或
式ii的结构表征的化合物：
式ii
其中g1为取代或未取代的吡咯烷、取代或未取代的吡啶、取代或未取代的芳基、取代或未取代的哌啶、取代或未取代的哌嗪、取代或未取代的咪唑烷、或取代或未取代的吡唑烷；且
g3通过以下结构表征：
其中g2为取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环；或
式iii的结构表征的化合物：
式iii
其中g1为取代或未取代的吡咯烷、取代或未取代的吡啶、取代或未取代的芳基、取代或未取代的哌啶、取代或未取代的哌嗪、取代或未取代的咪唑烷、或取代或未取代的吡唑烷；且
g3通过以下结构表征：
其中g2为取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环。
在一些方面，本发明涉及本发明所述的式i、ii、iii、iv、v或vi的化合物，或包含其的组合物，且包括其的第一医药用途，其中式中描述的环结构可进一步掺入额外的杂原子，例如，额外的氮或氧。
当提及基团：
在一些实施方案中，关于定义为吡咯烷、吡啶、哌啶、哌嗪、咪唑烷、吡唑烷或杂环的g1、g2或g3，应理解在一些实施方案中，所述基团与指示的原子的连接点可视情况经由该基团的氮或杂原子、或经由碳原子。
在一些实施方案中，关于式i的化合物，当g1为吡咯烷时，该连接点经由吡咯烷基团的氮原子，且在一些实施方案中，当g1为哌嗪时，该连接点经由哌嗪基团的氮原子，且在一些实施方案中，当g1为哌啶时，该连接点经由哌啶基团的氮原子。
在一些实施方案中，关于式ii的化合物，当g1为哌啶时，该连接点经由哌啶基团的氮原子，且在一些实施方案中，当g1为哌啶时，该连接点经由哌啶基团的碳原子，其中氮原子在相对连接点的邻位。
在一些实施方案中，本发明提供一种化合物，其由式vi的结构表征：
式vi
其中：
g1为任选取代的nh-吡咯烷、任选取代的nh-哌啶、任选取代的nh-哌嗪、任选取代的nh-咪唑烷、任选取代的nh-吡唑烷、任选取代的nh-芳基、任选取代的nh-环烷基、任选取代的吡咯烷、任选取代的哌啶、任选取代的哌啶类、任选取代的哌嗪、任选取代的咪唑烷，或任选取代的吡唑烷；
g2为任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环烷基或任选取代的杂环；
其中：
如果g1为未取代的吡咯烷，则g2不为烷基、环戊基、烷基环戊基或呋喃；或
如果g1为哌啶则g2不为烷基；且
如果g1为哌嗪，则g2不为烷基或呋喃。
在一些实施方案中，g1为吡咯烷且g2为乙基或呋喃。在一些实施方案中，g1为取代的哌嗪且g2为呋喃或苯基且在一些实施方案中，g1为哌啶且g2为环戊基、呋喃或苯基。在一些实施方案中，g1为任选取代的咪唑烷或任选取代的吡唑烷。
在一些方面，本发明的化合物和/或本发明的组合物可包含以下试剂和/或本发明的方法可提供以下试剂的用途和/或本发明的第一医药用途可包括由以下结构表征的试剂：式v：
式v
其中x为n或s；
g1为取代或未取代的吡咯烷、取代或未取代的吡啶、取代或未取代的芳基、取代或未取代的哌啶、取代或未取代的哌嗪、取代或未取代的咪唑烷、或取代或未取代的吡唑烷；
g3为
g3不存在，如果x为s；
g4或g5各自独立地为
g4或g5各自独立地为h、oh、卤素，如果x为n；且
g2为取代或未取代的烷基、烷氧基、酰基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环。
在一些实施方案中，本发明提供一种化合物，其由式vi的结构表征：
式vi
其中：
g1为任选取代的nh-吡咯烷、任选取代的nh-哌啶、任选取代的nh-哌嗪、任选取代的nh-咪唑烷、任选取代的nh-吡唑烷、任选取代的nh-芳基、任选取代的nh-环烷基、任选取代的吡咯烷、任选取代的哌啶、任选取代的哌啶类、任选取代的哌嗪、任选取代的咪唑烷，或任选取代的吡唑烷；
g2为任选取代的烷基、任选取代的芳基、任选取代的环烷基或任选取代的杂环；
其中：
如果g1为未取代的吡咯烷，则g2不为烷基、环戊基、烷基环戊基或呋喃；或
如果g1为哌啶则g2不为烷基；且
如果g1为哌嗪，则g2不为烷基或呋喃。
在一些实施方案中，g1为吡咯烷且g2为乙基或呋喃。在一些实施方案中，g1为取代的哌嗪且g2为呋喃或苯基且在一些实施方案中，g1为哌啶且g2为环戊基、呋喃或苯基。在一些实施方案中，g1为任选取代的咪唑烷或任选取代的吡唑烷。
在一些实施方案中，g1为任选取代的nh-吡咯烷、任选取代的nh-哌啶、任选取代的nh-哌嗪，且g2为任选取代的烷基；或在一些实施方案中，g1为任选取代的nh-吡咯烷、任选取代的nh-哌啶、任选取代的nh-哌嗪，且g2为任选取代的烯基；或在一些实施方案中，g1为任选取代的nh-吡咯烷、任选取代的nh-哌啶、任选取代的nh-哌嗪，且g2为任选取代的芳基；或在一些实施方案中，g1为任选取代的nh-吡咯烷、任选取代的nh-哌啶、任选取代的nh-哌嗪，且g2为任选取代的杂芳基；或在一些实施方案中，g2为任选取代的环烷基；或在一些实施方案中，g1为任选取代的nh-吡咯烷、任选取代的nh-哌啶、任选取代的nh-哌嗪，且g2为任选取代的杂环。
在一些实施方案中，g1为任选取代的nh-咪唑烷或任选取代的nh-吡唑烷，且g2为任选取代的烷基；或在一些实施方案中，g1为nh-咪唑烷或任选取代的nh-吡唑烷，且g2为任选取代的烯基；或在一些实施方案中，g1为nh-咪唑烷或任选取代的nh-吡唑烷，且g2为任选取代的芳基；或在一些实施方案中，g1为nh-咪唑烷或任选取代的nh-吡唑烷，且g2为任选取代的杂芳基；或在一些实施方案中，g2为任选取代的环烷基；或在一些实施方案中，g1为nh-咪唑烷或任选取代的nh-吡唑烷，且g2为任选取代的杂环。
在一些实施方案中，g1为任选取代的nh-芳基、任选取代的nh-环烷基，且g2为任选取代的烷基；或在一些实施方案中，g1为任选取代的nh-芳基、任选取代的nh-环烷基，且g2为任选取代的烯基；或在一些实施方案中，g1为任选取代的nh-芳基、任选取代的nh-环烷基，且g2为任选取代的芳基；或在一些实施方案中，g1为任选取代的nh-芳基、任选取代的nh-环烷基，且g2为任选取代的杂芳基；或在一些实施方案中，g2为任选取代的环烷基；或在一些实施方案中，g1为任选取代的nh-芳基、任选取代的nh-环烷基且g2为任选取代的杂环。
在一些实施方案中，g1为任选取代的吡咯烷、任选取代的哌啶、任选取代的哌啶类，且g2为任选取代的烷基；或在一些实施方案中，g1为任选取代的吡咯烷、任选取代的哌啶、任选取代的哌啶类，且g2为任选取代的烯基；或在一些实施方案中，g1为任选取代的吡咯烷、任选取代的哌啶、任选取代的哌啶类，且g2为任选取代的芳基；或在一些实施方案中，g1为任选取代的吡咯烷、任选取代的哌啶、任选取代的哌啶类，且g2为任选取代的杂芳基；或在一些实施方案中，g2为任选取代的环烷基；或在一些实施方案中，g1为任选取代的吡咯烷、任选取代的哌啶、任选取代的哌啶类，且g2为任选取代的杂环。
在一些实施方案中，g1为任选取代的哌嗪、任选取代的咪唑烷，或任选取代的吡唑烷且g2为任选取代的烷基；或在一些实施方案中，g1为任选取代的吡咯烷、任选取代的哌啶、任选取代的哌啶类，且g2为任选取代的烯基；或在一些实施方案中，g1为任选取代的哌嗪、任选取代的咪唑烷，或任选取代的吡唑烷且g2为任选取代的芳基；或在一些实施方案中，g1为任选取代的哌嗪、任选取代的咪唑烷，或任选取代的吡唑烷且g2为任选取代的杂芳基；或在一些实施方案中，g2为任选取代的环烷基；或在一些实施方案中，g1为任选取代的哌嗪、任选取代的咪唑烷，或任选取代的吡唑烷且g2为任选取代的杂环。
在一些实施方案中，本发明提供一种化合物，其由式vii的结构表征：
式vii
其中：
g1为任选取代的nh-吡咯烷、任选取代的nh-哌啶、任选取代的nh-哌嗪、任选取代的nh-咪唑烷、任选取代的nh-吡唑烷、任选取代的nh-吡啶、任选取代的nh-芳基、任选取代的nh-环烷基、任选取代的吡咯烷、任选取代的哌啶、任选取代的哌啶类、任选取代的哌嗪、任选取代的咪唑烷、任选取代的吡唑烷或任选取代的芳基；
g2为
g4为任选取代的吡咯烷、任选取代的哌啶、任选取代的哌嗪、任选取代的咪唑烷或任选取代的吡唑烷；
其中：
如果g1为哌啶则g4不为吡咯烷或g2不为任选取代的芳基；或
如果g1为咪唑烷，则g2不为任选取代的芳基；或
如果g1为任选取代的nh-吡啶，则g2不为任选取代的芳基；或
如果g1为任选取代的nh-芳基，则g2不为任选取代的芳基；或
如果g1为任选取代的吡啶，则g2不为任选取代的芳基。
在一些实施方案中，根据该方面，g1为任选取代的nh-吡啶，g2为
g1为取代的nh-芳基且g2为
在一些方面，关于烷基、烯基、吡咯烷、哌啶、哌嗪、咪唑烷、吡唑烷、芳基、杂芳基、杂环、或环烷基基团的术语“取代的”可包括卤素、羟基、c1-c6直链或支链的链烷基、硝基、cn、腈酰胺基(nitrileamido)、酰胺基硫化物(amidosulfide)、氨基、醛、取代的酮、-cooh、酯、三氟甲基、酰胺、烷氧基或卤代烷基基团或其任何亚组合。
在一些方面，关于烷基、烯基、吡咯烷、哌啶、哌嗪、咪唑烷、吡唑烷、芳基、杂芳基、杂环、或环烷基基团的术语“取代的”可包括：卤素、羟基、c1-c6直链或支链的链烷基、硝基、cn、腈酰胺基、酰胺基硫化物、氨基、醛、或其任何亚组合，或在一些实施方案中、取代的酮、-cooh、酯、三氟甲基、酰胺、烷氧基或卤代烷基基团或其任何亚组合，或在一些实施方案中，卤素、羟基、c1-c6直链或支链的链烷基、或其任何亚组合，或在一些实施方案中，硝基、cn、腈酰胺基、酰胺基硫化物、氨基、醛、或其任何亚组合。
在一些方面，术语“烷基”应理解包括直链或支链c1-c6烷基。在一些方面，术语“环烷基”应理解包括3-、4-、5-或6-元不饱和环。
在一些方面，术语"烃基(alkyl)"预期包括直链、支链或环状烃结构及其组合。烷基基团的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基和叔丁基等。在一些实施方案中，烷基基团为c20或更少c的基团。在一些实施方案中，烷基基团为c7或更少c的基团。在一些实施方案中，烷基基团为c6或更少c的基团。环烷基为烷基的子集且包括3至13个碳原子的环状烃基。环烷基基团的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、降冰片基、金刚烷基等。在本申请中，烃基是指烷基、烯基和炔基残基；其预期包括环己基甲基、乙烯基、烯丙基、异戊二烯基等。亚烷基为烷基的另一子集，是指与烷基相同的残基，但具有两个连接点。亚烷基的实例包括亚乙基(-ch2ch2-)、亚丙基(-ch2ch2ch2-)、二甲基亚丙基(-ch2c(ch3)2ch2-)和环己基亚丙基(-ch2ch2ch(c6h13)-)。当具有指定数量的碳的烷基残基被命名时，预期包括所有具有该碳数的几何异构体；因此，例如，"丁基"意味着包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基；"丙基"包括正丙基和异丙基。
本发明的术语"烷氧基(alkoxy)"或"烷氧基(alkoxyl)"可意指基团-o-烷基，优选包含1至8个碳原子的直链、支链、环状构型及其组合，其通过氧连接至母体结构。实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、环丙基氧基、环己基氧基等。
术语"取代的烷氧基"可在本发明表示基团-o-(取代的烷基)。
术语"酰基"可在本发明表示1至10个碳原子的直链、支链、环状构型的饱和、不饱和以及芳族的基团及其组合，其通过羰基官能团连接至母体结构。酰基残基中的一个或多个碳可被氮、氧或硫代替，只要与母体的连接点保留在羰基上。实例包括乙酰基、苯甲酰基、丙酰基、异丁酰基、叔丁氧基羰基、苄基氧基羰基等。
术语"芳基"可在本发明表示5-或6-元芳环、双环9-或10-元芳环体系或三环12-至14-元芳环体系。实例包括环戊-1,3-二烯、苯基、萘基、茚满、四氢化萘、芴、环戊二烯并[b]萘和蒽。
术语"杂环"或"杂环基"可在本发明表示其中1至4个碳被杂原子如氧、氮或硫代替的环烷基残基。包含1-4个杂原子的4-、5-、6-或7-元非芳香环，包含1-4个(或更多)杂原子的双环8-，9-或10-元非芳香环体系，或包含1-4个(或更多)杂原子的三环11-至14-元非芳香环体系；所述杂原子选自o、n或s。实例包括吡咯烷、四氢呋喃、四氢-噻吩、噻唑烷、哌啶、四氢-吡喃、四氢-噻喃、哌嗪、吗啉、硫吗啉和二噁烷。
术语"杂环"或"杂环基"可在本发明表示包含不饱和键的环体系，条件是不饱和的数量和排列不使得基团为芳香族的。实例包括咪唑啉、噁唑啉、四氢异喹啉、苯并二噁烷、苯并二氧杂环戊烯和3,5-二氢苯并噁嗪基。取代的杂环基的实例包括4-甲基-1-哌嗪基和4-苄基-l-哌啶基。
在一些方面，术语“芳基烷基”应理解为提供本发明关于芳基和烷基两者所提供的定义，并且类似地，任何组合的官能团术语也应理解为包括独立的各个基团的描述。
术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况以及不发生的情况。
例如，“任选取代的烷基”是指如下所定义的“烷基”或“取代的烷基”。本领域技术人员将会理解，对于包含一个或多个取代基的任何基团，该基团预期不引入任何空间上不可行、合成上不可行和/或本身不稳定的取代或取代模式(例如，取代的烷基包括任选取代的环烷基，其又定义为包括任选取代的烷基，可能是无限的)。术语“取代或未取代的”将被理解为在所指示的基团是否含有一个或多个取代基方面包括相同的选择。
术语“取代的”指在所指定原子上的一个或多个氢被选自所示的基团代替，条件是不超过现有情况下指定原子的正常价态，且该取代产生稳定化合物。取代基和/或变量的组合仅在此种组合产生稳定化合物时才是允许的。术语“稳定化合物”或“稳定结构”指足够稳固(robust)以经受住从反应混合物分离为有用纯度且配制成有效治疗剂的化合物。术语“任选取代的”意指与指定的基团、原子团或部分的任选取代。
还应当注意，在本发明的文本、方案、实施例和表格中的任何具有不饱和化合价的碳和杂原子具有足够数量的氢原子以满足化合价。
如本发明所述，本发明涵盖如本发明所述的化合物的任何异构体或药学上可接受的盐、n-氧化物、水合物、前药、溶剂化物或衍生物，包含如本发明所述的化合物的任何异构体或药学上可接受的盐、n-氧化物、溶剂化物、水合物或衍生物的组合物，以及使用本发明所述的化合物的任何异构体或药学上可接受的盐、n-氧化物、溶剂合物、水合物或衍生物的治疗的第一医疗用途和/或治疗方法。
术语“药学上可接受的盐”在本发明中可以指保留本发明化合物的生物有效性和性质并且在生物学上或其他方面不是不希望的盐。在许多情况下，本发明化合物由于存在氨基和/或羧基或与其类似的基团而能够形成酸和/或碱盐。药学上可接受的酸加成盐可以用无机酸和有机酸形成。可以衍生盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。可以衍生盐的有机酸包括例如、乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙烷磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
药学上可接受的碱加成盐可以与无机碱和有机碱形成。可以衍生盐的无机碱包括例如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝等；特别优选的是铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。可以衍生盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺(包括天然存在的取代的胺)、环胺、碱性离子交换树脂等，具体地例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。
本发明中的术语“溶剂合物”可以指与一种或多种药学上可接受的溶剂分子物理缔合的化合物。术语“溶剂合物”应理解为包括所述化合物、所述化合物的药学上可接受的盐、所述化合物的溶剂合物和所述化合物的药学上可接受的盐的溶剂合物。
应理解短语如“本发明所述的化合物”或“如所述使用的化合物”被认为包括式i-vii的化合物或任何其药学可接受的盐、异构体、n-氧化物、异构体或溶剂合物。
本发明的化合物的前药和溶剂合物也在本发明中考虑。前药的讨论在t.higuchi和v.stella，pro-drugsasnoveldeliverysystems(1987)14ofa.c.s.symposiumseries，andbioreversiblecarriersindrugdesign，(1987)edwardb.roche，ed.，americanpharmaceuticalassociationandpergamonpress中提供。术语“前药”是指体内转化产生式(i)-(iv)化合物或该化合物的药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物的化合物(例如，药物前体)。转化可以通过各种机制(例如通过代谢或化学过程)发生，例如通过血液中的水解。前药使用的讨论在以下提供：t.higuchi和w.stella,"pro-drugsasnoveldeliverysystems,"vol.14ofthea.c.s.symposiumseries,andinbioreversiblecarriersindrugdesign,ed.edwardb.roche,americanpharmaceuticalassociationandpergamonpress,1987。
可以根据本发明使用的示例性组织蛋白酶c抑制剂包括gly-phe-重氮基甲基酮(gly-phe-dmk)，例如可获自mpbiomedicals，usa。
根据本发明的一些实施方案，可使用任何生物信息学方法来设计和合成细胞内cela3a或结构相关的酶、cela1和/或组织蛋白酶c中至少一种的特异性抑制剂(例如生物信息学技术如vigyaan，dnalinuxvirtualdesktop(vd)或bioclipse)。
如上所述，能够下调组织蛋白酶c、cela3a和cela1的活性或表达的另一种试剂是适于以靶向方式沉默表达的多核苷酸试剂。这种试剂的例子在下面列出。
细胞内cela3a、cela1和/或组织蛋白酶c中的至少一种的下调可以通过rna沉默来实现。如本发明所用，短语“rna沉默”是指rna分子介导的一组调节机制[例如，rna干扰(rnai)、转录基因沉默(tgs)、转录后基因沉默(ptgs)、遏制、共抑制和翻译抑制)，其导致相应的蛋白质编码基因的表达的抑制或“沉默”。在许多类型的生物体中已经观察到rna沉默，包括植物、动物和真菌。
本发明所用术语“rna沉默剂”是指能够特异性地抑制或“沉默”靶基因的表达的rna。在某种实施方案中，rna沉默剂能够通过转录后沉默机制防止mrna分子的完整加工(例如整个翻译和/或表达)。rna沉默剂包括非编码rna分子，例如包含配对链的rna双链体，以及可从中产生这类小的非编码rna的前体rna。示例性rna沉默剂包括dsrna例如sirna、mirna和shrna。在一个实施方案中，rna沉默剂能够诱导rna干扰。在另一个实施方案中，rna沉默剂能够介导翻译抑制。
按照本发明的一个实施方案，rna沉默剂对靶rna(例如组织蛋白酶c、cela3a和cela1)有特异性，不交叉抑制或沉默与靶基因显示99％或更小整体同源性、例如与靶基因小于98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％整体同源性的基因或剪接变体。
rna干扰是指由短干扰rna(sirna)介导的动物中的序列特异性转录后基因沉默的方法。植物中的相应方法通常称为转录后基因沉默或rna沉默，在真菌中亦称为压抑。转录后基因沉默的方法被认为是用于防止外源基因表达的进化保守的细胞防御机制，并且被不同的植物区系和种系(phyla)共有。在响应双链rna(dsrna)产生时，可产生对外源基因表达的这种防止，所述双链rna来源于病毒感染或来源于通过特异性破坏同源单链rna或病毒基因组rna的细胞反应转座子元件随机整合到宿主基因组。
细胞中长的dsrna的存在刺激称为切酶的核糖核酸酶iii的活性。切酶参与将dsrna加工成短dsrna段(称为短干扰rna(sirna))的过程。来源于切酶活性的短干扰rna通常长约21-约23个核苷酸，并包含约19个碱基对双链体。rnai反应的特征还在于内切核酸酶复合物，通常称为rna诱导沉默复合物(risc)，这介导单链rna的切割，该单链rna具有与sirna双链体的反义链互补的序列。靶rna的切割发生在与sirna双链体的反义链互补的区域中部。
因此，本发明的一些实施方案考虑使用dsrna以下调来自mrna的蛋白质表达。
按照一个实施方案，dsrna大于30bp。由于认为双链rna的这些较长区域将导致诱导干扰素和pkr反应，因此长dsrna(即大于30bp的dsrna)的应用是非常有限的。然而，长dsrna的使用可提供多个优势，因为细胞可选择最适沉默序列，这减少了对测试多种sirna的需要；长dsrna可允许沉默文库具有较少的复杂性，这对于sirna将是必需的；或许最重要的是，长dsrna当用作疗法时，可防止病毒逃逸突变。
不同的研究表明，长dsrna可用于使基因表达沉默而不诱导应激反应或引起显著的脱靶作用(off-targeteffect)—参见例如[strat等,nucleicacidsresearch,2006,第34卷,第13期3803-3810；bhargavaa等,brainres.protoc.2004；13:115-125；diallom.等,oligonucleotides.2003；13:381-392；paddisonp.j.等,proc.natlacad.sci.usa.2002；99:1443-1448；trann.等,febslett.2004；573:127-134]。
特别是，本发明根据其一些实施方式考虑在干扰素途径未被激活的细胞(例如胚胎细胞和卵母细胞)中引入用于基因沉默的长dsrna(超过30个碱基转录物)，参见例如billy等人,pnas2001,vol98,14428-14433页和diallo等人,oligonucleotides,october1,2003,13(5):381-392.doi:10.1089/154545703322617069。
按照一些实施方案，本发明还考虑了经特别设计不诱导用于下调基因表达的干扰素和pkr途径的长dsrna的引入。例如，shinagwa和ishii[genes&dev.17(11):1340-1345,2003]开发了名为pdecap的载体以由rna聚合酶ii(polii)启动子表达长双链rna。因为pdecap的转录物没有促进ds-rna输出到胞质的5'-帽结构和3'-聚(a)尾两者，所以pdecap的长ds-rna不诱导干扰素反应。
在哺乳动物系统中避开干扰素和pkr途径的另一种方法是通过转染或内源表达的小抑制rna(sirna)的引入。
术语“sirna”是指诱导rna干扰(rnai)途径的小抑制rna双链体(一般介于18-30个碱基对)。通常，sirna作为21聚体经化学合成，具有中央19bp双链体区和末端的不对称2-碱基3'-突出端，然而最近披露，长25-30个碱基的化学合成的rna双链体可具有较之于相同位置的21聚体的效能的差不多100倍。据推理，观察到的在靶向rnai时使用较长rna获得的效能提高产生于为底物(27聚体)而非产生(21聚体)提供切酶，并且这改进sirna双链体进入risc的速率或效率。
已发现3'-突出端的位置影响sirna的效能，并且在反义链上具有3'-突出端的不对称双链体一般比有义链上具有3'-突出端的双链体更有效(rose等，2005)。这可归因于加载到risc中的不对称链，因为当靶向反义转录物时，观察到相反的功效模式。
双链干扰rna(例如sirna)的链可连接形成发夹或茎环结构(例如shrna)。因此，如所述，本发明的一些实施方案的rna沉默剂也可以是短发夹rna(shrna)。
本发明所用术语“shrna”是指是这样的rna分子：具有茎环结构，包含互补序列的第一区和第二区，互补程度和区域方向足够使得碱基配对发生在区域之间，第一区和第二区通过环区连接，环产生于环区内核苷酸(或核苷酸类似物)间缺乏碱基配对。环中核苷酸的数目是且包括3-23、或5-15、或7-13、或4-9、或9-11之间的数目。环的一些核苷酸可参与与环中其它核苷酸的碱基对相互作用。可用于形成环的寡核苷酸序列的实例包括5'-uucaagaga-3'(brummelkamp，t.r.等人(2002)science296：550)和5'-uuuguguag-3'(castanotto，d.等人(2002)rna8：1454)。本领域技术人员应认识到，所得单链寡核苷酸形成包含能够与rnai机器相互作用的双链区的茎环或发夹结构。
适用于本发明的一些实施方案的rna沉默剂的合成可如下实现。首先，在aa二核苷酸序列的aug起始密码子下游扫描组织蛋白酶c、cela3a和cela1mrna序列。记录各aa和3’邻接19个核苷酸的出现为潜在的sirna靶位点。优选从可读框选择sirna靶位点，因为非翻译区(utr)在调节蛋白质结合位点中更丰富。utr结合蛋白和/或翻译起始复合物可干预sirna内切核酸酶复合物的结合[tuschlchembiochem.2:239-245]。然而应认识到，指向非翻译区的sirna也可有是有效的，如gapdh所显示的，其中指向5’utr的sirna介导细胞gapdhmrna的约90％降低，并且完全消除蛋白质水平(www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html)。
其次，应用任何序列比对软件，例如可获自ncbi服务器的blast软件(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)，将潜在靶位点与合适的基因组数据库(例如人、小鼠、大鼠等)进行比较。过滤出显示与其它编码序列有显著同源性的推定靶位点。
选择合格的靶序列作为sirna合成的模板。优选的序列包括低g/c含量的序列，因为这些已被证实与g/c含量高于55％的序列相比，在介导基因沉默中更有效。优选沿靶基因的长度选出若干靶位点用于评价。为了更好地评价选出的sirna，优选联合使用阴性对照。阴性对照sirna优选包括与sirna相同的核苷酸组成，但与基因组没有明显的同源性。因此，优选使用sirna的混杂核苷酸序列，条件是不显示与任何其它基因有任何显著同源性。
例如，用于组织蛋白酶c的合适的sirna分子可包括seqidno：1所述的核酸序列。
用于组织蛋白酶c沉默的示例性sirna分子、mirna分子或shrna分子可商购自例如sigma-aldrich，qiagen或origene。
例如，用于cela1的合适的sirna分子包括seqidno：2所述的核酸序列。
用于cela1沉默的示例性sirna分子、mirna分子或shrna分子可购自例如sigma-aldrich、qiagen或origene。
例如，用于cela3a的合适的sirna分子可包括seqidno：3所述的核酸序列。
用于cela3a沉默的示例性sirna分子、mirna分子或shrna分子可购自例如sigma-aldrich、qiagen或origene。
本发明进一步提供分离的多核苷酸，其包括的核酸序列与seqidno：1或seqidno：1的序列共享至少95％至99％同一性。
本发明进一步提供分离的多核苷酸，其包括的核酸序列与seqidno：2或seqidno：2的序列共享至少95％至99％同一性。
本发明进一步提供分离的多核苷酸，其包括的核酸序列与seqidno：3或seqidno：3的序列共享至少95％至99％同一性。
应认识到，本发明的一些实施方案的rna沉默剂不必限于只含有rna的分子，而且另包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。
待使用rna沉默剂靶向的mrna包括但不限于其表达与不需要的表型性状有关的mrna。可靶向的示例性mrna是编码截短蛋白即包含缺失的mrna。因此可使本发明的一些实施方案的rna沉默剂靶向缺失任一侧的桥接区。将这类rna沉默剂导入细胞可引起突变蛋白质的下调，同时留下非突变蛋白质不受影响。
根据另一实施方案所述rna沉默试剂可为mirna。
术语“微rna”、“mirna”和“mir”是同义的并且是指长度约19-28个核苷酸的非编码单链rna分子的集合，其调节基因表达。mirna在许多生物体(病毒，人类)中都有发现，并且显示在发育、体内稳态和疾病病因学中发挥着重要作用。
应该注意的是，在任何一对mirna和mirna*的5'和3'末端可能存在可变性。这种可变性可能是由于drosha和dicer酶切加工相对于切割位点的可变性。mirna和mirna*的5'和3'末端的可变性也可能是由于pri-mirna和pre-mirna的茎结构错配造成的。茎链的错配可能导致不同发夹结构的种群。茎结构的变异性也可能导致drosha和dicer裂解产物的变异性。
能够下调组织蛋白酶c、cela3a和cela1的另一种试剂是能够特异性切割mrna转录物或组织蛋白酶c、cela3a和cela1的dna序列的dna酶分子。dna核酶是能够切割单链和双链靶序列两者的单链多核苷酸(breaker,r.r.和joyce,g.chemistryandbiology1995；2:655；santoro,s.w.和joyce,g.f.proc.natl,acad.sci.usa1997；943:4262)。提出了dna核酶的通用模型(“10-23”模型)。“10-23”dna核酶15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，其两侧是各为7-9个脱氧核糖核苷酸的2个底物识别结构域。这种dna核酶类型可在嘌呤:嘧啶连接处有效切割其底物rna(snatoro,s.w.和joyce,g.f.proc.natl,acad.sci.usa199；有关dna核酶的综述参见khachigian，lm[curropinmolther4:119-21(2002)]。
识别单链和双链靶切割位点的合成的工程改造的dna核酶的构建和扩增的实例公开于joyce等人的美国专利号6,326,174。最近观察到针对人尿激酶受体的类似设计的dna核酶抑制尿激酶受体表达，并在体内成功地抑制结肠癌细胞转移(itoh等,2002,abstract409,annmeetingamsocgentherwww.asgt.org)。在另一个应用中，与bcr-ab1癌基因互补的dna核酶在白血病细胞中抑制癌基因表达，并在cml和all的情况下在自体骨髓移植时降低复发率。
通过使用能够与编码组织蛋白酶c、cela3a和cela1的mrna转录物特异性杂交的反义多核苷酸，也可实现组织蛋白酶c、cela3a和cela1的下调。
必须实施可用来有效下调细胞内cela3a、cela1和/或组织蛋白酶c中至少之一的反义分子的设计，同时考虑对反义方法是重要的两个方面。第一方面是将寡核苷酸递送到合适细胞的胞质中，而第二方面是以抑制其翻译的方式、在细胞内与指定mrna特异性结合的寡核苷酸的设计。
现有技术教导了许多递送策略可用于将寡核苷酸有效递送到多种细胞类型[参见，例如，luftjmolmed76：75-6(1998)；kronenwett等人blood91：852-62(1998)；rajur等人bioconjugchem8：935-40(1997)；lavigne等人biochembiophysrescommun237：566-71(1997)和aoki等人(1997)biochembiophysrescommun231：540-5(1997)]。
此外，基于考虑到靶mrna和寡核苷酸二者中的结构改变的能量的热力学循环，用于鉴定对其靶mrna具有最高预测结合亲和力的那些序列的算法也是可用的[参见例如，沃尔顿(walton)等人biotechnolbioeng65：1-9(1999)]。
另外，可获得识别对它们的靶mrna具有最高预测结合亲和力的那些序列的算法，其基于说明靶mrna和寡核苷酸二者中结构变化热力学的热力学循环[见，例如，walton等biotechnolbioeng65：1-9(1999)]。
这种算法已经成功地在细胞中用于执行反义方法。例如，walton等开发的算法使得科学家能够成功地为兔β-球蛋白(rbg)和小鼠肿瘤坏死因子-α(tnfα)转录体设计反义寡核苷酸。该同一研究组最近已报道，在细胞培养中合理选择的寡核苷酸抗三种模型靶mrna(人乳酸脱氢酶a和b以及大鼠gp130)的反义活性，如通过动力学pcr技术评价，证实在几乎所有情况下有效，包括用磷酸二酯和硫代膦酸酯寡核苷酸化学在两种细胞类型中抗三种不同靶的测试。
另外，也公开了使用体外系统的设计和预测具体寡核苷酸效率的几种方法(matveeva等，naturebiotechnology16：1374-1375(1998)]。
能够下调组织蛋白酶c、cela3a和cela1的另一种试剂是能够特异性切割编码组织蛋白酶c、cela3a和cela1的mrna转录物的核酶分子。核酶通过切割编码目标蛋白质的mrna，被越来越多地用于基因表达的序列特异性抑制[welch等,curropinbiotechnol.9:486-96(1998)]。设计核酶切割任何特定靶rna的可能性使其在基础研究和治疗应用中成为有价值的工具。在治疗领域，已利用核酶以在感染性疾病、癌症中的显性癌基因和遗传紊乱中的特异性体细胞突变中靶向病毒rna[welch等,clindiagnvirol.10:163-71(1998)]。更值注意的是，用于hiv患者的若干核酶基因疗法方案已处于1期试验。最近，核酶已用于转基因动物研究、基因靶向验证和途径阐释。若干核酶处于临床试验的不同阶段。angiozyme是在人临床试验中研究的第1个化学合成的核酶。angiozyme特异性地抑制vegf-r(血管内皮生长因子受体)(血管生成途径中的一个关键组分)的形成。ribozymepharmaceuticals,inc.以及其它公司表明抗血管生成疗法在动物模型中的重要性。发现heptazyme(一种被设计成选择性破坏丙型肝炎病毒(hcv)rna的核酶)，在细胞培养测定法中在降低丙型肝炎病毒rna中是有效的(ribozymepharmaceuticals,incorporated-web主页)。
因此，对于组织蛋白酶c、cela3a和cela1调节区中的任何给定序列，可以设计三链体形成序列。形成三链体的寡核苷酸的长度优选为至少15个，更优选25个，还更优选30个或更多个核苷酸，最多50或100bp。
用tfo转染(例如经由阳离子脂质体)细胞并与靶dna形成三股螺旋结构诱导空间和功能的改变，这阻断转录起始和延伸，允许在内源性dna中引入期望的序列改变，并导致基因表达的特异性下调。这种用tfo处理的细胞中基因表达抑制的实例包括：在哺乳动物细胞中游离型supfg1和内源性hprt基因的敲除(vasquez等,nuclacidsres.1999；27:1176-81和puri等，jbiolchem,2001；276:28991-98)；序列和靶特异性下调前列腺癌病因学中重要的ets2转录因子(carbone等,nuclacidres.2003；31:833-43)和促炎症反应icam-1基因(besch等，jbiolchem，2002；277:32473-79)的表达。另外，vuyisich和beal近期表明序列特异性tfo可以结合dsrna，这抑制dsrna-依赖性酶例如rna-依赖性激酶的活性(vuyisich和beal，nuc.acidsres2000；28:2369-74)。
此外，按照上述原理设计的tfo可以诱导能导致dna修复的定向诱变，因此提供内源基因表达的下调和上调(seidman和glazer，jclininvest2003；112:487-94)。有效tfo的设计、合成和给予的详述可参见：froehler等的美国专利申请号2003017068和20030096980；emanuele等的20020128218和20020123476；和lawn的美国专利号5,721,138。
可被本发明教导的多核苷酸试剂靶向的cela1和cela3a的示例性核酸区包括seqidno：24、seqidno：25、seqidno：26、seqidno：27、seqidno：28、seqidno：29、seqidno：30、seqidno：31、seqidno：32、seqidno：33、seqidno：34、seqidno：35和seqidno：36所述的核酸序列。然而，应理解的是，根据本发明的教导可以使用以靶向方式沉默其表达的组织蛋白酶c、cela1和/或cela3a的任何核酸区域。
本发明进一步提供在适中至严格的杂交条件下特异性杂交至cela1和/或cela3a但不杂交至cela2a或cela3b的分离的多核苷酸。本发明的严格杂交条件可以通过以下来影响：例如在65℃下通过含有10％硫酸葡聚糖、1mnacl、1％sds和5x106cpm32p标记探针的杂交溶液，最终洗涤溶液为0.2×ssc和0.1％sds，最后在65℃洗涤；而中等杂交条件可以通过以下来影响：例如，在65℃下，通过含有10％硫酸葡聚糖、1mnacl、1％sds和5x106cpm32p标记探针的杂交溶液，最终洗涤溶液为1×ssc和0.1％sds，最后在50℃洗涤。
本发明进一步提供分离的多核苷酸，其在适中至严格的杂交条件下特异性杂交至组织蛋白酶c但不杂交至组织蛋白酶a、b、d、e、g、h、k、l1、l2、o、s、w或z。
用于在坏死细胞中下调组织蛋白酶c、cela1和/或cela3a表达的分离的多核苷酸试剂可提供至细胞本身。通常将所述多核苷酸试剂作为表达构建体的一部分给予细。在这种情况下，多核苷酸试剂在能够在以组成型或诱导型方式指导多核苷酸试剂在细胞中表达的顺式作用调节元件(例如启动子)控制下连接在核酸构建体中。
本发明的表达构建体还可包括使其适于在真核生物中复制和整合的其它序列(例如穿梭载体)。典型的克隆载体含有转录和翻译起始序列(例如启动子、增强子)和转录和翻译终止子(例如多腺苷酸化信号)。本发明的表达构建体可进一步包括可与启动子序列相邻或远离并且可在从其转录中起上调作用的增强子。
除了已描述的实施方案以外，本发明的表达构建体通常可含有欲提高克隆核酸的表达水平或有利于携带重组dna的细胞的鉴定的其它专门元件。例如，多种动物病毒含有促进病毒基因组在允许细胞类型中的染色体外复制的dna序列。携带这些病毒复制子的质粒以附加体形式复制，只要质粒所携带的基因或宿主细胞基因组提供合适的因子。
本发明的表达构建体可包括或不包括真核复制子。如果真核复制子存在，则载体能够利用合适的选择标记在真核细胞中扩增。如果构建体不包含真核复制子，则附加型扩增是不可能的。相反，重组dna整合至工程改造细胞的基因组中，在其中启动子指导所需核酸表达。
可使用合适的基因递送载体/方法(转染、转导等)和合适的表达系统，将核酸构建体导入本发明的坏死细胞中。
哺乳动物表达载体的实例包括但不限于可获自invitrogen的pcdna3、pcdna3.1(+/-)、pgl3、pzeosv2(+/-)、psectag2、pdisplay、pef/myc/cyto、pcmv/myc/cyto、pcr3.1、psinrep5、dh26s、dhbb、pnmt1、pnmt41、和pnmt81；可获自promega的pci；可获自strategene的pmbac、ppbac、pbk-rsv和pbk-cmv；可获自clontech的ptres；及其衍生物。
可采用各种方法将本发明的表达载体导入人细胞中。所述方法一般描述于，例如：sambrook,j.和russell,d.w.(1989,1992,2001),molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringsharborlaboratory,newyork；ausubel,r.m.等人,eds.(1994,1989).currentprotocolsinmolecularbiology,johnwileyandsons,baltimore,md.(1989)；chang,p.l.,ed.(1995).somaticgenetherapy,crcpress,bocaraton,fla.；vega,m.a.(1995).genetargeting,crcpress,bocaraton,fla.；rodriguez,r.l.anddenhardt,d.h.(1987).vectors:asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses,butterworth-heinemann,boston,mass；andgilboa,e.等人(1986)，transferandexpressionofclonedgenesusingretro-viralvectors.biotechniques4(6),504-512；且包括例如用重组病毒载体稳定转染或瞬时转染、脂转染、电穿孔和感染。另外，有关阳性-阴性选择方法参见美国专利号5,464,764和5,487,992。
由于细胞内cela3a、cela1和/或组织蛋白酶c中至少之一的每一种为细胞内靶点，本发明的试剂可配制用于细胞内递送。例如，本发明的高亲和力结合分子(例如抗体)可以进一步设计用于细胞内递送。
在一些实施方案中，本发明提供的rna沉默剂可与细胞穿透肽功能性缔合。本发明所用的“细胞穿透肽”是包含短的(约12-30个残基)氨基酸序列或功能基序(其赋予与跨越细胞的质膜和/或核膜的透膜复合物转运有关的不依赖于能量的(即非胞吞)易位性质)的肽。用于本发明的一些实施方案的透膜复合物的细胞穿透肽优选包含至少一个非功能性半胱氨酸残基，其是游离的或被衍化形成与双链核糖核酸(其已因此连接被修饰)的二硫键。赋予所述性质的代表性氨基酸基序列于美国专利号6,348,185，其内容通过引用明确结合到本发明中。本发明的一些实施方案的细胞穿透肽优选包括但不限于penetratin、transportan、pisl、tat(48-60)、pvec、mts和map。
因此，例如，可使用基于脂质的系统将这些抗体递送至本发明的靶细胞(例如坏死细胞)中。
脂质体包括由脂质双层组成的包封一定体积的任何合成的(即非天然存在的)结构。脂质体包括乳液、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、片层等。脂质体可通过本领域的任何已知方法制备[monkkonen,j.等,1994,j.drugtarget,2:299-308；monkkonen,j.等,1993,calcif.tissueint.,53:139-145；lasicdd.,liposomestechnologyinc.,elsevier,1993,63-105.(第3章)；winterhalterm,lasicdd,chemphyslipids,1993年9月；64(1-3):35-43]。脂质体可以是带正电荷的、中性的或带负电荷的。对于单核吞噬细胞系统(mps)摄取，脂质体可以是疏水的，因为脂质体膜的亲水掩蔽(例如通过使用聚乙二醇连接的脂质和亲水颗粒)可能较不易于mps摄取。优选脂质体不包含空间上被屏蔽的脂质，例如神经节苷脂-gm1和磷脂酰肌醇，因为这些脂质防止mps摄取。
脂质体可以是单一脂质层或可以是多层。如果治疗剂是亲水的，由于其较大的内体积所致可使用大的单层囊泡进一步改进治疗剂的递送。相反地，如果治疗剂是疏水的，则可使用多层泡囊进一步改进其递送。或者，治疗剂(例如抗体)不能够渗入脂质双层，因此可保持吸附在脂质体表面。在这种情况下，增加脂质体的表面积可进一步改进治疗剂的递送。本发明的合适的脂质体是无毒脂质体，例如由磷脂酰-胆碱磷酸甘油和胆固醇制备的那些。所使用的脂质体的直径范围可为0.1-1.0微米。然而，还可使用适于被吞噬细胞吞噬的其它大小范围。对于确定脂质体的大小，可利用匀浆化，这取决于使大的脂质体片段化成较小的脂质体的剪切能。可方便地使用的匀浆器包括由boston，ma的microfluidics生产的微流化器(microfluidizer)。在典型的匀浆化方法中，使脂质体通过标准乳液匀浆器再循环直到观察到所选择的脂质体大小。可通过常规激光束粒度识别，监测粒度分布。使脂质体通过小孔聚碳酸酯膜或非对称陶瓷膜压出是用于使脂质体大小减小到相对十分明确的大小分布的有效方法。通常，将混悬液通过膜循环一次或多次直到达到所需脂质体大小分布。可将脂质体从较小的孔膜中成功地压出以达到脂质体大小的逐步减小。
可采用本领域已知的任何方法将本发明的一些实施方案的治疗剂掺入脂质体中。例如，可将高亲和力分子(例如抗体)包封在脂质体内。或者，可使其吸附在脂质体的表面。可用于将试剂掺入本发明的脂质体中的其它方法是描述于以下文献的那些：alfonso等[thescienceandpracticeofpharmacy,mackpublishing,eastonpa,第19版,(1995)]和kulkarni等[j.microencapsul.1995,12(3)229-46]。
用于本发明方法的脂质体优选可跨越血液屏障。因此，本发明的脂质体优选在其膜部分中不包含血液屏障靶向多糖(例如甘露糖)。优选地，本发明的脂质体在其使脂质体靶向血液屏障上的受体的膜部分中不包含肽。所述肽的实例包括但不限于转铁蛋白、胰岛素、igf-1、igf-2抗转铁蛋白受体抗体、抗胰岛素受体抗体、抗igf-1受体抗体和抗igf-2受体抗体。
为了确定特别适宜本发明的脂质体，可进行筛选测定法，例如美国专利申请号20040266734和美国专利申请号20040266734以及danenberg等，journalofcardiovascularpharmacology2003，42:671-9；circulation2002，106:599-605；circulation2003，108:2798-804的测定法。
根据一个实施方案，预防或抑制细胞坏死的方法在体外、体内或离体实现。
调节细胞内cela3a、cela1和/或组织蛋白酶c至少之一的能力可用作治疗坏死诱导的细胞死亡的新的治疗方式。
因此，根据本发明另一方面提供在有需要的受试者中治疗与细胞坏死相关的医学疾病或病症的方法，该方法包括向该受试者给药治疗有效量的在受试者细胞中特异性下调组织蛋白酶c、cela3a和cela1的表达且替代地或额外的抑制其活性的的试剂。
术语“治疗”是指抑制或制止疾病、障碍或病症的发展和/或引起疾病、障碍或病症减轻、缓解或消退或防止在可能有疾病、障碍或病症的风险但尚未诊断出患有疾病、障碍或病症的受试者发生疾病、障碍或医学病况。本领域技术人员应了解，各种方法和测定法可用来评价疾病、障碍或病症的发展，同样地，各种方法和测定法可用来评价疾病、障碍或病症的减轻、缓解或消退。
如本发明所述，术语“受试者”是指动物，优选哺乳动物，最优选人，包括年轻人和老年人，其都患有或易患坏死相关疾病或病症。
与细胞坏死相关的疾病或病症包括，但不限于，神经退行性疾病、痴呆、帕金森疾病、阿尔茨海默疾病、肌肉萎缩症、白血病、淋巴瘤、新生儿呼吸窘迫、窒息、嵌顿性疝、糖尿病、结核病、子宫内膜异位、血管营养不良、牛皮癣、冻伤、铁负荷并发症、类固醇治疗的并发症、缺血性心脏疾病、再灌注损伤、脑血管疾病或损伤、坏疽、褥疮、胰腺炎、肝炎、血红蛋白尿、脑膜炎、坏疽、缺血性坏死、无血管性坏死(例如、骨的)、细菌性败血症、病毒性败血症、烧伤、高热、克罗恩氏病、乳糜泻、筋膜间隙综合征、坏死性直肠炎、囊性纤维化、类风湿性关节炎、肾毒性、多发性硬化症、螺旋性脊髓损伤、肾小球肾炎、退行性关节炎、酪氨酸血症、代谢遗传性疾病、支原体疾病、炭疽感染、细菌感染、病毒感染、anderson病、先天性线粒体病、苯丙酮尿症、胎盘梗塞、梅毒、无菌性坏死、无血管性坏死、酒精中毒和与给药和/或与自身给药相关的坏死、和/或与暴露于可卡因、药物、化学毒素、农用化学品和重金属相关的坏死、与皮肤填充物施用有关的坏死；与异位给药相关的坏死、如葡萄糖溶液的外渗、化学治疗药物；化疗诱导的坏死、辐射诱导的坏死、移植组织的维持和衰老。
根据一个实施方案，与细胞坏死相关的疾病或病症为脑损伤(例如外伤性脑损伤)。
因此，本发明方法可用于治疗与任何急性或慢性中枢神经系统(cns)损伤相关的坏死。这种疾病或病症可以包括但不限于中风(由血栓形成、栓塞或血管收缩引起)、闭合性头部损伤、全脑缺血(例如由于任何原因形成的全身性低血压引起的缺血，包括心肌梗塞形成、心律失常、失血性休克和冠状动脉旁路移植术后脑损伤)、局部缺血和颅内出血。缺血性中枢神经系统损害可能来自总体或局部缺血性条件。全脑缺血发生在流向整个大脑的血液停止一段时间的时候，如在心脏骤停期间。局部缺血发生在一部分脑被剥夺正常血流时，例如在脑血管血栓栓塞闭塞期间、创伤性头部损伤、水肿和脑肿瘤。脑缺血导致的大部分cns损伤发生在缺血状态之后的数小时甚至数天内，并且继发于受损组织释放的细胞毒性产物。
在一些方面，本发明具体考虑了治疗或预防由任何已知原因引起的肝脏毒性，例如，基于感染的或有毒的物质暴露，或本领域技术人员将会理解的其他方法。
在一些方面，如技术人员将理解的，本发明具体考虑了心脏疾病的治疗或预防，所述心脏疾病在一些方面包括心肌梗塞，心功能不全，心力衰竭等。
根据本发明的教导，为了治疗与细胞坏死相关的医学疾病或病症，向受试者施用特异性下调组织蛋白酶c、cela1和/或cela3a或结构相关的酶的表达且替代地或额外的抑制组织蛋白酶c、cela1和/或cela3a或结构相关的酶的活性的试剂，如上文进一步详述的。
应当理解，上文所述的每种下调试剂或编码下调试剂的表达载体可以对个体本身或作为还包括生理上可接受的载体的药物组合物的一部分给药，或者在一些方面，作为本领域中的缀合物、带电粒子、脂质体或任何已知的载体的一部分，其在一些方面可以进一步配制为药物组合物的一部分。药物组合物的目的是促进活性成分给予生物体。
如本发明使用的“药物组合物”是指本发明所述的一种或多种活性成分及其它化学组分如生理上适合的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是为了使化合物容易给予有机体。
本发明的术语"活性成分"是指细胞内cela3a、cela1和/或组织蛋白酶c的至少一种的下调或抑制剂，其承担生物作用。
下文中，可互换使用的术语“生理上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不会给有机体造成显著刺激而且不会消除所给予化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。佐剂(adjuvant)包含在这些术语中。
本发明的术语“赋形剂”是指加入到药物组合物中从而进一步使活性成分容易给予的惰性物质。赋形剂的实施例包括，但不局限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖类和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、和聚乙二醇。
药物的配制和给予技术可在“remington’spharmaceuticalsciences,”mackpublishingco.，easton，pa最新版中找到，其在此引入作为参考。
合适的给予途径可包括，例如口服、直肠、经粘膜尤其是经鼻、肠道、或肠道外递送包括肌内、皮下和髓内注射及鞘内、直接心室内、心脏内注射，如注射到右或左心室腔中、注射到常见冠状动脉中，以及静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
用于将药物递送到中枢神经系统(cns)的常规方法包括：神经外科策略(例如，大脑内注射或脑室内输注)；试图利用bbb的其中一个内源性转运通路的试剂分子操作(例如，生产嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含对内皮细胞表面分子具有亲和力的转运肽(transportpeptide)，以及与其结合的自身不能穿过bbb的试剂)；设计用于增加试剂脂溶性的药物学策略(例如，将水溶性试剂结合到脂质或胆固醇载体上)；和通过高渗性破坏(通过将甘露醇溶液输注到颈动脉中或使用生物活性剂如血管紧缩素肽引起)暂时破坏bbb完整性。
根据本发明一个实施方案，该药物组合物配制用于渗透细胞膜。因此，例如，该药物组合物可包括脂质囊泡。
可替换地，可以局部方式而不是全身方式给予该药物组合物，例如，通过将该药物组合物直接注射到患者的组织区域(例如坏死组织)内进行。
本发明的一些实施方案的药物组合物可通过本领域熟知的工艺制造，如通过常规的混合、溶解、造粒、包糖衣、研粉、乳化、制成胶囊、包埋(entrapping)或冻干工艺制造。
因此，根据本发明一些实施方案使用的药物组合物可用常规方法，使用一种或多种使活性成分容易加工成可以药用的制剂的生理可接受载体(包括赋形剂和助剂)而制造。合适的制剂取决于所选的给予途径。
对于注射，该药物组合物的活性成分可配制在水溶液中，优选配制在生理上相容的缓冲液如汉克溶液(hank’ssolution)、林格溶液(ringer’ssolution)或生理盐缓冲液中。对于经粘膜给予，可以在配方中使用适合于透过屏障的穿透剂(penetrant)。此种穿透剂在本领域一般是已知的。
对于口服给予，该药物组合物可容易地通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受载体结合而调配。此种载体能够使该药物组合物调配成供患者口服的片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆液、混悬剂等。口服使用的药物制剂可利用固体赋形剂制造，可选地研磨所得混合物，需要时可加入合适的辅助物并在此后对颗粒混合物进行加工，从而获得片剂或糖衣核。合适的赋形剂为，特别是填充剂如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制品，如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮(pvp)。如果需要，可加入崩解剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂，或海藻酸或其盐如海藻酸钠。
糖衣丸核(drageecore)具有合适的包衣。为此目的，可使用浓的糖溶液，该溶液可选地包含阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶(carbopolgel)、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素加入到片剂或糖衣丸包衣(drageecoating)中，以便鉴定不同的活性化合物剂量的组合或赋予其特征。
可口服使用的药物组合物，包括明胶制成的推入配合胶囊(push-fitcapsule)，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。推入配合胶囊可包含与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉、润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁，和可选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分可以溶解于或悬浮于合适的液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。另外，可加入稳定剂。所有口服给予的制剂的剂量应适合于所选的给予途径。
对于含剂给予，该组合物可采用通过常规方法调配的片剂或锭剂的形式。
对于通过鼻吸入给予，根据本发明一些实施方案使用的活性成分可以喷雾剂(aerosolspray)形式，从利用适合的推进剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷，或二氧化碳的加压包装或喷雾器中方便地递送。在加压喷雾剂的情况下，剂量单位可通过提供阀门确定从而递送计量的量。可将用在分配器中的如明胶的胶囊和药筒，调配成包含该化合物与合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本发明描述的药物组合物可调配用于肠胃外给予，如通过推注和连续输注给予。注射用制剂可以单位剂量的形式呈现，如，在安瓿或多剂量容器中，在其中可选地加入防腐剂。该组合物可以是油性或水性媒剂(vehicles)中的悬浮液、溶液，或乳液，并可含有调配剂如悬浮剂、稳定剂，和/或分散剂。
肠胃外给予的药物组合物包括水溶性形式活性制剂的水溶液。另外，可将该活性成分的悬浮液配制成适当的油性或水基的注射悬浮液。合适的亲脂溶剂或媒剂包括脂肪油如芝麻油，或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射悬浮液可包含增大悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇，或葡聚糖。可选地，该悬浮液还可包含合适的稳定剂或增大活性成分的溶解度从而允许制备高度浓缩的溶液的试剂。
或者，该活性成分可以是粉末形式，在使用前用合适的媒剂如无菌的基于无热源的水基溶液进行复溶(constitution)。
本发明一些实施方案的药物组合物还可利用如常规栓剂基质如可可油或其它甘油酯，调配成直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂(retentionenemas)。
适用于本发明一些实施方案的药物组合物包括其中活性成分的含量对达到预期目的有效的组合物。更具体地，治疗有效量是指对预防、缓和或改善疾病(如，细胞坏死)的症状或延长受治疗受验者的存活时间有效的活性成分(例如细胞内cela3a、cela1和/或组织蛋白酶c至少之一的下调或抑制试剂)的量。
根据本发明的一个实施方式，本发明的试剂的作用量是选择为使细胞坏死转化为细胞凋亡的量。
如本发明所用的术语“细胞凋亡”是指程序性细胞死亡的细胞过程。细胞凋亡的特点是在细胞质和细胞核中有明显的形态学改变，在规则间隔处的染色质断裂，以及在核小体内位点的基因组dna的内源性核苷酸裂解。这些变化包括起泡、细胞收缩、核碎裂、染色质凝聚和染色体dna片段化。然而，与坏死不同的是，细胞凋亡产生被称为凋亡小体的细胞碎片，吞噬细胞能够在细胞内容物溢出到周围细胞和造成损伤之前吞没并迅速除去。
治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是在阅读本发明详细公开的内容之后。
对于用于本发明方法中的任何制剂，治疗有效量或剂量最初可根据体外和细胞培养物分析进行估计(参见例如以下实施例部分的实施例1-3)。而且，可以在动物模型中调配剂量，以获得期望的浓度或滴定度。此类信息可用来更准确地确定对于人有用的剂量。
本发明描述的活性成分的毒性和治疗功效可通过体外、细胞培养物或实验动物中的标准制药程序来确定。可利用从这些体外和细胞培养物分析及动物研究中获得的数据，调配用于人的剂量范围。该剂量可随着采用的剂型和所利用的给予途径而改变。个人医生可根据病人的情况，选择确切的制剂、给予途径和剂量(参见如fingl等人,1975,"thepharmacologicalbasisoftherapeutics",ch.1p.1)。
坏死疾病和病症的动物模型包括无菌性坏死的猪模型[参见例如müller-vahlh和pabstr.，intjtissuereact.(1984)6(3):251-4]、股骨头坏死的羊模型[参见例如j.manggold等人,laboratoryanimals(2002)36,173–180]。
可以单独地调整剂量和时间间隔，从而提供足够量的活性成分以诱导或抑制生物学效应(最低有效浓度，mec)。对于每种制剂，mec有所不同，但可根据体外数据进行估计。达到mec所需的剂量取决于个体特征和给予途径。可利用检测试验测定血浆浓度。
根据受治疗病况的严重性和反应性，可进行单次或多次剂量给予，疗程持续几天至几周，或直到治愈或病情减轻。
当然，该组合物的给予量将取决于治疗的受验者、疼痛严重性、给予方式，处方医生的判断等。
本发明一些实施方案的组合物在需要时可放置在包装或分配装置，如fda批准的试剂盒中，该包装或分配装置可包含含有活性成分的一个或多个单位剂型。该包装可包含，例如，金属或塑料箔，如泡罩包装(blisterpack)。该包装或分配装置还可附有给予说明。该包装或分配器还可提供与包含物相关的由管理药物制造、使用或销售的政府部门所规定的形式的公告，该公告反映该部门批准了该组合物或人用或兽用的形式。此公告，例如，可以是美国食品和药品管理局对于处方药批准的标志或者是已批准的产品说明书。如上面进一步详细说明的，还可以制备包含本发明制备品、调配在相容性药物载体中的组合物，将其放置在合适的容器中，并标记用于治疗指示的病况。
本发明的试剂可以适当地配制成药物组合物，其可以作为制造物品适当包装。这种制品包含用于治疗坏死相关疾病的标签、包装药物有效量的下调剂的包装材料。
应该理解，本发明的每种试剂或组合物可以与其它已知的治疗(包括但不限于抗凋亡剂或抗炎剂)组合施用。
本发明的试剂或组合物可在其它治疗之前、同时或之后施用。
根据本发明的教导可使用的抗凋亡剂包括，但不限于，-[r]-n-[2-庚基]-甲基炔丙基胺(r-2hmp)、维生素e、维生素d、半胱天冬酶抑制剂和亲水性胆盐熊去氧胆酸。
根据本发明的教导可使用的抗炎剂包括，但不限于，阿氯芬酸(alclofenac)，二丙酸阿氯米松(alclometasonedipropionate)，醋苯阿尔孕酮(algestoneacetonide)，阿尔法淀粉酶，阿西纳发(amcinafal)，安西非特(amcinafide)，氨芬酸钠(amfenacsodium)，盐酸氨普立糖(amiprilosehydrochloride)，阿那白滞素(anakinra)，艾利洛克(anirolac)，阿尼扎芬(anitrazafen)，阿扎丙酮(apazone)，巴柳氮二钠(balsalazidedisodium)，苄达酸(bendazac)，苯噁洛芬(benoxaprofen)，盐酸苄达明(benzydaminehydrochloride)，菠萝蛋白酶(bromelains)，溴四拉莫(broperamole)，布地缩松(budesonide)，卡洛芬(carprofen)，环洛芬(cicloprofen)，西诺戊宗(cintazone)，氯噻托酸(cliprofen)，丙酸氯倍他索(clobetasolpropionate)，丁酸氯倍氟松(clobetasonebutyrate)，氯苯吡乙酸(clopirac)，丙酸氯替卡松(cloticasonepropionate)，醋酸可美萨松(cormethasoneacetate)，去氧可的松(cortodoxone)，去氟可特(deflazacort)，待索利德(desonide)，去氧米松(desoximetasone)，二丙酸地塞米松(dexamethasonedipropionate)，双氯芬酸钾，双氯芬酸钠，双醋二氟松(diflorasonediacetate)，二氟米酮钠(diflumidonesodium)，双氟尼酸(diflunisal)，双氟泼龙酯(difluprednate)，双酞嗪酮(diftalone)，二甲基亚砜，丙缩氢炎松(drocinonide)，因甲羟松(endrysone)，恩莫单抗(enlimomab)，艾洛利康钠(enolicamsodium)，甲氧嘧唑(epirizole)，依托度酸(etodolac)，依托芬那酯(etofenamate)，非必拉克(felbinac)，非那莫(fenamole)，芬布芬(fenbufen)，二氯苯氧苯乙酸(fenclofenac)，氯环苯乙酸(fenclorac)，芬度柳(fendosal)，苯吡噁二酮(fenpipalone)，芬噻唑酸(fentiazac)，氟苯哌酮(flazalone)，氟扎可松(fluazacort)，氟芬那酸(flufenamicacid)，氟咪唑(flumizole)，醋酸氟尼缩松(flunisolideacetate)，氟尼克辛(flunixin)，氟苄烟酸(flunixinmeglumine)，氟可丁酯(fluocortinbutyl)，氟氢缩松醋酸酯(fluorometholoneacetate)，苯氟喹酮(fluquazone)，氟比洛芬(flurbiprofen)，氟瑞托芬(fluretofen)，丙酸氟地松(fluticasonepropionate)，呋拉布洛芬(furaprofen)，丁酸酰氧芴(furobufen)，哈西奈德(halcinonide)，丙酸卤倍他索(halobetasolpropionate)，醋酸卤泼尼松(halopredoneacetate)，布芬酸(ibufenac)，布洛芬(ibuprofen)，布洛芬铝，皮考布洛芬，伊洛达普(ilonidap)，吲哚美辛(indomethacin)，吲哚美辛钠，吲哚布洛芬(indoprofen)，吲哚克索(indoxole)，吲四唑(intrazole)，醋酸异氟泼尼松(isoflupredoneacetate)，伊索克酸(isoxepac)，伊索昔康(isoxicam)，基布洛芬(ketoprofen)，盐酸罗非咪唑(lofemizolehydrochloride)，氯诺昔康(lornoxicam)，依碳氯替泼诺(loteprednoletabonate)，甲氯芬那酸钠(meclofenamatesodium)，甲氯芬那酸，甲氯松二丁酯(meclorisonedibutyrate)，甲芬那酸(mefenamicacid)，美沙拉秦(mesalamine)，甲塞克那唑(meseclazone)，磺庚甲泼尼松龙(methylprednisolonesuleptanate)，莫尼氟酯(morniflumate)，萘丁美酮(nabumetone)，萘普生(naproxen)，萘普生钠，萘普醇，尼马宗(nimazone)，奥沙拉秦钠(olsalazinesodium)，奥古蛋白(orgotein)，欧哌洛星(orpanoxin)，奥沙普秦(oxaprozin)，氧苯丁唑(oxyphenbutazone)，盐酸雷尼托林(paranylinehydrochloride)，戊聚糖多硫酸钠(pentosanpolysulfatesodium)，保泰松甘油酸钠(phenbutazonesodiumglycerate)，哌非尼酮(pirfenidone)，吡罗昔康(piroxicam)，肉桂酸吡罗昔康，吡罗昔康乙醇胺(piroxicamolamine)，吡氯布洛芬(pirprofen)，泼那扎特(prednazate)，叔丁非隆(prifelone)，丙哚酸(prodolicacid)，丙喹酮(proquazone)，普咯沙唑(proxazole)，枸橼酸普咯沙唑，利美索龙(rimexolone)，诺马及特(romazarit)，柳胆立司(salcolex)，沙那西定(salnacedin)，水杨酰水杨酸(salsalate)，血根氯铵(sanguinariumchloride)，氯唑噁酮(seclazone)，丝炎痛(sermetacin)，噻氧噻嗪(sudoxicam)，舒林酸(sulindac)，舒洛芬(suprofen)，他美达辛(talmetacin)，他尼氟酯(talniflumate)，塔罗赛特(talosalate)，泰布芬隆(tebufelone)，替尼达普(tenidap)，替尼达普钠，替诺昔康(tenoxicam)，替昔康(tesicam)，苄叉异喹酮(tesimide)，四氢达明(tetrydamine)，噻匹莱克(tiopinac)，特戊酸硫氢可的松(tixocortolpivalate)，托美汀(tolmetin)，托美汀钠，三氯氟松(triclonide)，三氟米酯(triflumidate)，齐多美辛(zidometacin)或佐美酸钠(zomepiracsodium)。
为了测试治疗功效，可以通过身体检查以及使用本领域已知的用于评估细胞坏死的任何方法评估受试者。因此，例如，可以获得坏死的细胞或组织样品(例如从受试者)，并且可以通过光、荧光或电子显微镜技术或通过台盼蓝染色来鉴定坏死细胞，其中坏死细胞吸收染料，因此被染成蓝色。坏死细胞可以通过形态变化与健康细胞区分，包括膜完整性的损失，细胞器的分解和/或染色质的絮凝。
根据本发明另一方面，提供在有需要的受试者中治疗和/或预防衰老的方法，该方法包括：(a)向受试者施用在受试者细胞中特异性下调组织蛋白酶c、cela3a或结构相似的酶和cela1的表达且替代地或额外的抑制其活性的试剂；和(b)向受试者施用抗衰老剂，从而治疗和/或预防衰老。
根据本发明的教导可使用任何抗衰老剂，例如，抗氧化剂、植物化学物质、激素和脂肪酸。
根据本发明的教导可使用的示例性抗衰老剂包括，但不限于，维生素e、维生素c、辅酶q10、硫辛酸、叶酸、硒、类黄酮、胡萝卜素、维生素b和肉毒碱。
可以与本发明的教导一起使用的分子可以如下鉴定其特异性。
因此，根据本发明另一方面，提供鉴定能抑制细胞坏死的试剂的方法，该方法包括向经历坏死信号的细胞引入测试试剂且鉴定该测试试剂是否特异性下调细胞内cela3a、cela1和/或组织蛋白酶c中至少之一的表达且替代地或额外的抑制其活性，从而鉴定能抑制细胞坏死的试剂。通过测试其对其他细胞蛋白质例如其它cela蛋白质或途径中的蛋白质(如上文进一步定义，在“特异性”下)的作用来检测测试试剂的特异性。
在其它优选实施方案，本发明提供用于预防和治疗坏死和相关疾病和病症的具体小抑制性分子。分子的列表包括属于多种化学家族小分子抑制性化合物的，例如，属于2-氨基咪唑啉、氨基噻唑和异噁唑。本发明还提供用于治疗和/或预防与细胞坏死相关的疾病或医疗病症的多种小分子抑制剂。在其它实施方案，提供了小分子抑制剂在制备用于治疗和/或预防与细胞坏死相关的疾病或医疗病症的药物中的用途。
因此，根据一个实施方案该测试试剂可为弹性蛋白酶的小分子或天然抑制剂(例如吲哚-3-甲醇或黄烷醇(-)表没食子儿茶精-3-没食子酸酯)，且其对cela1或cela3的特异性抑制可使用本发明的教导评估。在该测试试剂被验证为特异性cela1/cela3a抑制剂后，进一步分析其对细胞坏死的抑制。该分子的列表示于表1。
例如，本发明的小分子可包括过渡态类似物(即化学结构类似于酶催化化学反应中底物分子的过渡态的化学结构，然而，它们通常不经历化学反应和作为酶抑制剂)，可逆抑制剂(即通常非共价结合酶、酶-底物复合物或两者的抑制剂)和不可逆抑制剂(即通常与酶反应并使其发生化学变化的抑制剂，例如通过共价键形成，并修饰酶活性所需的关键氨基酸残基)。
关于本发明所述的任何化合物，本发明还涉及任何异构体，药学可接受的盐、药物产品、水合物、n-氧化物、晶体或它们的任意组合，且它们认为是本发明的一部分。
根据一个实施方案该测试试剂可为高亲和力结合分子或多核苷酸，且其对组织蛋白酶c、cela1、cela3a或与其结构相关的酶的特异性抑制可使用本发明的教导评估。该测试试剂被验证为特异性后，进一步分析其对细胞坏死的抑制。
因此，根据本发明一些实施方案，提供了细胞-渗透性蛋白酶抑制剂，其用于治疗和/或预防与细胞坏死相关的疾病或医疗病症。所述蛋白酶抑制剂抑制经历坏死的细胞中的坏死细胞死亡涉及的至少一种细胞内蛋白酶的酶活性。所述细胞内蛋白酶选自cela3a、cela1和组织蛋白酶c。在优选的实施方案中，所述蛋白酶为cela3a。
如本发明所用，术语“约”是指±10％。
术语“包含”、“包括”、“具有”，和它们的结合词组(conjugate)是指“包括但不局限于”。
术语“由……组成"是指“包括且限于”。
术语“基本由……组成”是指组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部件，但仅当该另外的成分、步骤和/或部件不实质性地改变要求保护的组合物、方法或结构的基本和新特征时是这样。
如在此使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。
在整篇专利申请中，本发明的各种实施方式可以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅是为了方便和简洁，而不应该理解为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应视为已具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的各个数值。例如，如从1至6的范围描述应视为已具体地公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等的子范围，以及在此范围内的各个数值，例如，1、2、3、4、5和6。不论范围宽度如何，这都能适用。
当本发明中指出了数值范围时，其意在包括在所指范围内的任何提及数字(小数或整数)。本发明中的表达在第一个指定数和第二个指定数“之间”的“范围”与从第一个指定数“至”第二个指定数的“范围”可互换使用，意在包括第一和第二个指定数以及其间的所有小数和整数。
如本发明使用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、方法、技术和程序，包括但不限于，化学、药学、生物学、生物化学和医学领域技术人员已知，或易于从已知方式、方法、技术和程序开发出的那些方式、方法、技术和程序。
应理解，为清楚起见而在单独实施方式的上下文中描述的本发明一些特征，也可结合提供在单个实施方式中。相反，为简洁起见而在单个实施方式的上下文中描述的本发明的多种特征，也可单独地或以任何合适的子组合形式提供，或作为适合于本发明的任何其他被描述的实施方式提供。在各个实施方式的上下文中描述的一些特征不应被认为是这些实施方式的实质特征，除非这些实施方式没有这些元素时是无效的。
如上文所描绘的和如下面权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施方式和方面将在下面的实施例中找到实验支持。
实施例
现在参考下面的实施例，结合上面的描述以非限制方式说明本发明。
一般而言，本发明使用的术语和本发明利用的实验程序包括分子、生物化学、微生物学和重组dna技术。此类技术在文献中有详尽的解释。参见，例如，"molecularcloning:alaboratorymanual"sambrook等人,(1989)；"currentprotocolsinmolecularbiology"volumesi-iiiausubel,r.m.,ed.(1994)；ausubel等人,"currentprotocolsinmolecularbiology",johnwileyandsons,baltimore,maryland(1989)；perbal,"apracticalguidetomolecularcloning",johnwiley&sons,newyork(1988)；watson等人,"recombinantdna",scientificamericanbooks,newyork；birren等人(eds)"genomeanalysis:alaboratorymanualseries",vols.1-4,coldspringharborlaboratorypress,newyork(1998)；美国专利4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所述的方法；"cellbiology:alaboratoryhandbook",volumesi-iiicellis,j.e.,ed.(1994)；"currentprotocolsinimmunology"volumesi-iiicoliganj.e.,ed.(1994)；stites等人(eds),"basicandclinicalimmunology"(第8版),appleton&lange,norwalk,ct(1994)；mishell和shiigi(eds),"selectedmethodsincellularimmunology",w.h.freemanandco.,newyork(1980)；可用的免疫分析法在这些专利和科学文献中详述，参见，例如，美国专利3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"oligonucleotidesynthesis"gait,m.j.,ed.(1984)；“nucleicacidhybridization"hames,b.d.和higginss.j.,eds.(1985)；"transcriptionandtranslation"hames,b.d.和higginss.j.,eds.(1984)；"animalcellculture"freshney,r.i.,ed.(1986)；"immobilizedcellsandenzymes"irlpress,(1986)；"apracticalguidetomolecularcloning"perbal,b.,(1984)和"methodsinenzymology"vol.1-317,academicpress；"pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications",academicpress,sandiego,ca(1990)；marshak等人,"strategiesforproteinpurificationandcharacterization-alaboratorycoursemanual"cshlpress(1996)；所有这些文献都通过引用掺入如同全部在此列出。其它一般性参考文献提供在本发明各处。其中的程序被认为是本领域熟知的，仅为了便于读者阅读而提供。包含在其中的所有信息都通过引用在此掺入。
一般材料和实验程序
体外坏死的模型
kcn-诱导的坏死
在补充有10％热灭活的胎牛血清、2mm谷氨酰胺、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的rpmi-1640培养基中，将人原单核u-937细胞(p53-阴性原单核细胞系)悬浮繁殖。将对数期的细胞以4x105/ml的浓度接种(tsesinn等，chemistryandphysicsoflipids，2014,183：159-168)。
使大鼠嗜铬细胞瘤pc12细胞系在补充有5％热灭活小牛血清、10％热灭活马血清、2mml-谷氨酰胺、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem培养基(beithaemek，israel)中繁殖。将对数期的pc12细胞以1.2×105/孔的浓度接种在96孔板中并温育过夜。
此后，将细胞洗涤两次并保持在补充有2mm丙酮酸盐和10％透析的fcs的rpmi-1640(u-937细胞)和dmem(pc-12细胞)无葡萄糖培养基中保持1小时。然后将细胞用或不用指定浓度的kcn(merck，德国)处理7小时(u-937细胞)，或处理5小时(pc12细胞)。
抑制剂的测试
弹性蛋白酶抑制剂ii(meosuc-aapa-cmk)和弹性蛋白酶抑制剂iii(meosuc-aapv-cmk)购自calbiochem-novabiochem，usa。化合物gly-phe重氮基甲基酮购自mpbiomedicals，usa。上文中表1公开的所有化合物购自chemdiv，sandiego，ca。将化合物溶于dmso且在添加细胞死亡诱导剂之前30分钟给予。添加至所有样品中的dmso的终浓度为0.1％，其本身无作用。
sirna和细胞转染
将细胞用hiperfect转染试剂与sirna的复合物(用于抑制特定蛋白酶)或用合适的对照如下处理48小时。hiperfect转染试剂是阳离子脂质和中性脂质的混合物，其能够促使有效的sirna摄取并有效在细胞内释放sirna，导致完美的基因敲除。按照制造说明使用阴性和阳性死亡对照。用于组织蛋白酶c沉默的sirna序列是atgatctgcatcagttgtaaa(seqidno：1)。用于cela1的sirna序列是cggcaacatgctggtccttta(seqidno：2)，用于cela3a的sirna序列是ctgcctttggctgcaacttca(seqidno：3)。用于对照的sirna序列是aattctccgaacgtgtcacgt(seqidno：4)。所有sirna和hiperfecttm转染试剂购自qiagen。
此后，将正常或沉默的细胞洗涤两次并转移至无葡萄糖的培养基中达1小时，然后如上所述用氰化钾诱导坏死。通过promega'scytotox
cela1sirna序列完美匹配cela1转录物，但是它也不完美地匹配cela3a和cela3b。cela3asirna完美匹配cela3a。
坏死和凋亡的形态学定量
如前所述监测经历与凋亡或坏死细胞死亡相关的形态变化的细胞[mcgahonaj等人，methodscellbiol(1995)46：153-184]和[zeligu等人，biophysj.2009oct7；97(7)：2107-14.]。在处理后的给定时间点，收集1ml细胞悬液，离心并将沉淀重悬于在pbs中的20倍稀释的染料混合物(由100μg/ml吖啶橙和100μg/ml溴化乙锭组成)并放在载玻片上，以在荧光显微镜上观察。如果细胞核表现出正常的形态并且是绿色的，则将细胞评分为活的。显示正常形态且为橙色的细胞被评分为坏死。如果细胞核显示染色质凝聚和/或核碎裂，则将细胞评分为凋亡。每个样品至少有100个细胞被评分。
使用乳酸脱氢酶(ldh)释放来测试坏死
从裂解细胞释放的ldh的量是细胞死亡的敏感度量。使用promegacytotox96ldh测定试剂盒在96孔板中测量坏死性细胞死亡。使用在0.1％tritonx-100中裂解10分钟的细胞的ldh含量作为总ldh的指标。使用培养基中释放的ldh作为坏死细胞死亡的指标，且计算基于总ldh的百分比。基于在存在和不存在抑制剂的情况下比较ldh释放的百分比来计算抑制剂的保护。还将抑制剂添加到总样品、空白样品和对照样品中。通过elisa读取器(biotec)测量490nm处的吸光度。
弹性蛋白酶和组织蛋白酶c活性的测试
收集细胞，用冰冷的pbs洗涤两次并以2x108/ml重悬于冰冷的裂解缓冲液(50mmtris-hclph7.5，0.1％np-40，1mmdtt)中。用polytron使细胞破碎(3次，每次7秒)，通过在4℃以13,000g离心30分钟使碎片成团。立即使用上清液。使用牛血清白蛋白(bsa)作为标准，使用bradford蛋白质测定法(bio-rad)测定每个样品的蛋白质含量。所有测定均设定为总体积为100μl，并含有n-甲氧基琥珀酰-ala-ala-pro-val对硝基苯胺(maapv)(sigma)作为弹性蛋白酶底物(终浓度为5mm)、40μg样品蛋白质，存在或不存在特定浓度的蛋白酶抑制剂或溶剂(用于对照)，在平底微量滴定板中一式三份地进行。在37℃孵育1.5小时后，用平板elisa读数器(moleculardevices)测量405nm处的od。根据对硝基苯胺的校准曲线计算蛋白酶活性。用gly-phe对硝基苯胺(sigma)类似地测量组织蛋白酶c样活性。
外伤性脑损伤体内模型
使用闭合性头部损伤方法来确定弹性蛋白酶抑制剂对脑坏死发展以及神经状态的影响，使用神经学严重性评分(nss)评估。创伤后1小时进行nss测试。在nss测试期间，监测各种反射、移动能力、杠杆平衡、杠杆行走和其他行为参数，如监测寻找圆圈和离开圆圈。通过评估用2,3,5-三苯基-2h-四唑鎓氯化物(ttc)染色的脑切片中的坏死空间来测量坏死的发展。
在研究中使用重量为40±4g(平均值±sd)的c57bl/6j小鼠。使用重物下落装置给脑壳施以冲击，从而导致受控的脑损伤。冲击是通过使聚硅氧烷涂覆的5毫米金属尖从一个平台上挤出落在框架上而递送的。这种颅脑损伤模型已经用于以前的研究[feldmanz等人，jneurosurg(1995)83：1060–1066；shapiray等人，jneurosurganesthesiol(1995)7：17–25]。所有的动物手术和护理技术都得到了ben-gurionuniversity的negevcommitteefortheethicalcareanduseofanimalsinresearch的批准。
小鼠通过用异氟烷麻醉进行手术准备，并允许自主呼吸。通过角膜反射丧失，证实了对实验程序维持了适当麻醉。一旦角膜反射消失，做一个中线头皮切口，将头皮和下面的肌肉横向移动。闭合性头部创伤(cht)被传递到左侧大脑半球前部的颅骨上。创伤后1分钟，在其载体(dmso溶液)中的100μg弹性蛋白酶抑制剂ii或iii，通过直接递送到小脑延髓池内进行脑脊髓内注射。之前发现载体本身没有效果。没有受到创伤的小鼠的nss为0比1，染色的脑切片上没有坏死空间。
注射麻醉中断后，将动物放回笼中，随意供应食物和水。
除了野生型c57bl/6j小鼠之外，还检测了中性白细胞弹性蛋白酶敲除小鼠品系b6.129x1-elane。所有程序均由ben-gurionuniversityofnegev的ethicscommittee批准。
肝毒性体内模型
使用重23±3克的野生型c57bl/6j小鼠，每次处理6只小鼠。小鼠从harlan(以色列)获得。所有的动物手术和护理技术都得到了都得到了ben-gurionuniversity的negevcommitteefortheethicalcareanduseofanimalsinresearch的批准。在给予单次腹膜内(i.p.)剂量的扑热息痛(n-乙酰基-对氨基苯酚)apap(300mg/kg)之前，将小鼠禁食16小时。apap注射后4小时，使小鼠腹膜内注射溶于载体(pbs中的20％dmso)中的测试化合物。对照小鼠仅注射载体。apap注射后24h，将小鼠处死，从心脏收集血液。肝素被用作抗凝血添加剂以用于血浆收集。将血浆样品在室温下以4000g离心10分钟。收集上清液以测量alt和ast水平。使用soroka'sbiochemistrymedicalcenter的自动分析仪测定酶水平。
心脏坏死体内模型
将雄性balb/c小鼠(20-25g；charlesriver；milan；italy)饲养在受控环境中，并提供标准的啮齿动物饲料和水。
使用公开的方法使小鼠经历30分钟的心肌缺血和6小时的再灌注(yet等，2001)。研究组由假手术、载体对照和抑制剂组成(n＝8/组，见下文)。简而言之，用戊巴比妥钠(60mg/kg体重)麻醉小鼠，根据需要给予额外的剂量以维持麻醉。将小鼠插管并用100％氧气机械通气。小鼠接受第一iv剂量的活性抑制剂1-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4,5-二氢-1h-咪唑-1-基)丙-1-酮(m059-0891)(30mg/kg)，并打开胸部。在施用抑制剂iv20分钟之后，通过使用8-0丝线结扎左前降支冠状动脉(lad)，从而开始局部缺血，其中将一段pe-10管置于lad上方，离正常位置的左心房末端有1mm。闭塞30分钟后，通过释放结扎并移除pe-10管开始再灌注。动物在再灌注开始时接受第二iv剂量的抑制剂(30mg/kg)。然后关闭胸壁，将动物去掉管子，使用37℃的温热板维持体温。再灌注6小时后，将动物安乐死，收集心脏以确定形态损伤。定量坏死面积，其作为aar的％。
实验组：将总共24只小鼠分配到以下组：
-缺血/再灌注+载体：小鼠进行lad闭塞(30分钟)然后再灌注(6小时)(n＝8)；
-缺血/再灌注+化合物：小鼠进行上述外科手术并在缺血开始前20分钟和再灌注开始时用弹性蛋白酶抑制剂处理(经静脉快速推注剂量30mg/kg)(n＝8)；
-假手术+载体：小鼠经受相同的手术程序，而没有lad闭塞，且在实验期间保持在麻醉下(n＝8)；
在所有实验结束时，如下所述处理动物以评估梗塞区域。
梗塞大小的确定.
在再灌注期后，iv注射1ml/kg的4％硫黄素s溶液以描绘无回流区域。硫黄素s溶液是一种荧光黄绿色染料，其将灌注区域染色为荧光，而无回流区域呈现黑色。5分钟后，再次闭塞lad，通过iv注射给予0.6ml50％unisperse蓝(cibageigy，hawthorne，ny)以描绘aar(缺乏蓝色染料的组织)，并使小鼠在深度麻醉下用1mlkcl(150mg/mliv)安乐死。然后切除心脏并将lv切成4个等厚的横切片。使用紫外线(λ＝254nm)和黄色滤光片拍摄这些切片以确定无回流区(黑暗区)，然后在卤素灯照明下识别aar(未染色成蓝色)。然后将切片在1％氯化三苯基四氮唑鎓(ttc)中在37℃温育15分钟以描绘梗塞区。ttc将活的心肌组织染色为砖红色而梗塞组织显示白色。然后对心室切片进行再摄影。标记显示无回流区、aar和坏死区的心脏切片的数字照片，然后使用计算机化的平面系统进行数字化。计算缺血区和非缺血区的面积并将其表示为切片的百分比，坏死和非坏死组织的百分比也是如此。然后将每个切片中的％乘以切片的重量。对每个心脏总结重量。aar(不染蓝色的区域)表示为lv质量的百分比。坏死的程度以lv质量的百分比计算，梗塞尺寸表示为aar的百分比(梗塞尺寸＝坏死程度/aar的程度)。
数据分析
图和文本中的所有值均表示为n个观测值的平均值(sem)的平均值标准误差。通过单向anova分析数据，然后用bonferroni事后检验进行多重比较。用fisher精确检验分析非参数数据。小于0.05的p值被认为是显著的。*p<0.05相对假手术组。*p<0.05相对i/r。
统计分析
除非另有说明，每个实验进行3次；每个样品至少重复测试一次。结果表明平均值±se。统计分析使用student'st检验进行。使用microsoft
实施例1
坏死伴随着诱导细胞内弹性蛋白酶样蛋白水解活性
进行第一个实验以确定坏死是否伴随有细胞内蛋白水解活性的诱导。通过用造成化学缺氧(chemohypoxia)而杀死细胞的kcn处理以诱导u-937细胞的坏死。图1显示了kcn诱导的u-937细胞坏死的剂量和时间依赖性动力学。
为了进一步证实在坏死性细胞死亡过程中发生弹性蛋白酶样蛋白水解活性的活化，通过与对照相比，使用maapv(一种弹性蛋白酶特异性底物)，在由kcn处理的u-937细胞制备的细胞提取物测定其活性。为了看出弹性蛋白酶样酶在坏死的何种阶段被激活，在由kcn处理不同的时间间隔的u937细胞制备的裂解物中进行酶分析。图2显示了用10mmkcn处理诱导的蛋白水解活性的时间依赖性诱导。可以看出，弹性蛋白酶样活性在10分钟内也显著升高，且在15分钟内达到最大值，此时其活性提高7倍。在可观察到细胞死亡的形态学迹象之前检测到弹性蛋白酶活性的增加。
使用不同的蛋白酶抑制剂进一步表征弹性蛋白酶样诱导的活性。100μm浓度的eiiii对对照细胞的弹性蛋白酶活性影响不大；然而，它完全抑制了坏死诱导的活性。抑制作用呈剂量依赖性，ic50为2.735μm(图3)。这些结果表明，与u-937细胞中的坏死有关的诱导的蛋白水解活性与丝氨酸蛋白酶活性相容。
本发明人还希望看到在坏死的哪个阶段，组织蛋白酶c(弹性蛋白酶活化酶)被激活。为此目的，在用kcn10mm处理不同时间间隔的细胞的裂解物中进行酶测定。图2显示了用10mmkcn处理诱导的蛋白水解活性的时间依赖性诱导。可以看出，在10分钟的处理后，组织蛋白酶c样活性已经提高至4倍，达到其最大值。
弹性蛋白酶-样蛋白水解活性的诱导(分钟，图2)和坏死过程的进展(小时，图1)的时间标度差异非常大，导致蛋白水解活性是坏死途径的初始分子步骤的一部分的假说。为了检验这一假说，采用了不同的方法来抑制和下调弹性蛋白酶样酶的表达，并检查它们对坏死过程的影响(参见下文实施例2和3)。
实施例2
用组织蛋白酶c、cela3a和cela1的sirna转染防止坏死诱导的细胞死亡
为了表征在坏死过程的早期阶段被激活的酶，本发明人已经利用了针对不同蛋白酶的sirna文库。针对总共93种蛋白酶使用sirna进行转染。
图4a-b显示在与kcn温育7小时后，用cela1或cela3a的sirna转染u-937细胞使得ldh释放稳定且显著地降低。用cela1或cela3a单独转染引起部分保护，而用针对cela1和cela3a的sirna的组合转染提供了对抗坏死的完全保护。
除了cela1和cela3a的sirna之外，测试了其他蛋白酶的sirna。其中有组织蛋白酶a、b、c、d、e、g、h、k、l1、l2、o、s、w和z、丝氨酸蛋白酶hne、htra、糜蛋白酶c、cela2a和cela3b、基质金属肽酶7、11、12、21和25。结果显示组织蛋白酶c的sirna也表现出针对坏死的保护作用(图4a)。用针对总共90种蛋白酶的sirna转染不能对kcn诱导的细胞死亡赋予任何保护作用。
为确保指定的sirna对u-937细胞的作用不是特异性的，用pc12细胞重复这些实验(图4c)。
pc12细胞的对比实验显示组织蛋白酶c、cela3a和cela1的sirna均对u-937和pc12细胞的氰化物诱导的细胞死亡具有显著的保护作用。也可以看出，sirna和hiperfect转染试剂(对照处理)的混合物对细胞无毒性。此外，在坏死期间早期表现出组织蛋白酶c的激活以及小分子组织蛋白酶c抑制剂对坏死的抑制。结果还显示，抑制上述酶的活性与细胞死亡减少有关。结果表明，这些酶可以作为控制/调节坏死细胞死亡的靶标。
实施例3
用组织蛋白酶c、cela1和/或cela3a的sirna转染导致特异性抑制
为了确定特定sirna的保护作用是由于靶标酶转录的关闭而不是由于任何脱靶效应，本发明人已经进行了酶分析以显示组织蛋白酶c和弹性蛋白酶样活性在用特定sirna转染的细胞中被抑制。为了进一步支持有效的沉默，对指定的蛋白质进行蛋白质印迹分析，并且显示沉默的酶的表达确实被抑制。
图5a-b显示组织蛋白酶c、cela1和cela3a的sirna导致细胞裂解物的适当酶活性的稳定且显著的降低。此外用弹性蛋白酶cela1和cela3a的sirna转染对组织蛋白酶c活性没有影响，从而进一步支持该效应的特异性。该实验显示用特定的sirna处理的保护作用归因于酶的下调，而不是任何其他非靶效应。这些结果进一步表明组织蛋白酶c对程序性坏死细胞死亡是必需的。
此外，图4a和图5a-b的组合结果表明，在这些特定酶(cela3a和cela1)的活性被抑制的条件下(图5a-b)，坏死的过程被抑制(图4a)，这意味着阻断这些酶的活性引起细胞死亡的抑制。
因此，这些研究提供了酶代表抑制坏死的有效靶点的依据。综上所述，所述结果表明特异性cela3a和cela1抑制剂(而不是其它弹性蛋白酶的抑制剂)能够抑制坏死性细胞死亡。
实施例4
组织蛋白酶c、cela3a和cela1抑制剂导致抑制了坏死细胞死亡
图6显示组织蛋白酶c抑制剂(gly-phe-dmk，mpbiomedicals，usa)在pc12中能够抑制由kcn诱导的坏死。抑制剂的加入抑制了细胞坏死，这通过以剂量依赖性方式减少ldh释放所证实。同样，图5a-b和图6的结果暗示组织蛋白酶c可以提供抗坏死剂的靶标。
将弹性蛋白酶样活性与坏死性死亡途径联系起来的本假说的直接结果是抑制这种蛋白水解活性将延迟或阻止坏死性细胞死亡程序的执行。为了检验这个假设，研究了渗透性弹性蛋白酶抑制剂对坏死细胞死亡的影响。eiii和iii以剂量依赖性方式抑制kcn诱导的pc12细胞中的细胞死亡(通过ldh释放评估)(图7a和b)。非细胞渗透性弹性蛋白酶抑制剂(elastatinal)对经历kcn诱导的坏死的细胞没有保护作用(数据未显示)。
基于3d结构相似性和拓扑类比合成cela3a抑制剂。测试了它们产生抗坏死保护的能力。表2中列出了一些结果的代表性实例。在不同浓度(高达0.1nm)下观察到针对kcn诱导的坏死的保护作用(表2)。cela1的两种小分子抑制剂也能够抑制坏死，并且一些化合物，例如表中列出的最后三种化合物在更高的浓度下产生保护作用。
表2：
可以观察到，将pc-12细胞暴露于高浓度(高达300μm)的自身失活的非特异性弹性蛋白酶抑制剂eiii和iii，会显著抑制由kcn诱导的坏死。然而，同样可以容易地看出，小分子cela3a抑制剂在浓度降低几个数量级时是有效的。cela1-和cela3a-特异性抑制在预防/治疗坏死中出乎意料地增强的活性强调了这两个独特靶标以及因此在结构上与其相关的靶标的重要性。
实施例5
弹性蛋白酶抑制剂的保护作用表现在拯救kcn处理的细胞，而不仅仅是防止其膜破裂。
为了检查弹性蛋白酶抑制剂对细胞的保护作用是否在缺血性应激后长时间维持，我们进行动力学研究。kcn培养5小时后，将培养基更换为不含kcn或弹性蛋白酶抑制剂的常规dmem，孵育进行至多48小时。通过xtt方法评估细胞存活，其测量细胞代谢活性而不是膜完整性。结果表明，细胞在5小时的kcn处理中存活而没有不可逆的损伤。在kcn处理后48小时，它们显示完全恢复(图7c)。这些结果具有临床意义，因为它们证明了弹性蛋白酶抑制剂提供了持久的保护作用。例如，在缺血性应激如mi或中风后的治疗窗口期间用弹性蛋白酶抑制剂处理的组织可以被挽救。
实施例6
弹性蛋白酶抑制剂对坏死的体内作用
鉴于上述有希望的结果，研究了弹性蛋白酶抑制剂对体内坏死过程的效果的评估。第一个研究的体内模型是创伤性脑损伤(图8)。首先，检查弹性蛋白酶抑制剂ii和iii以及载体对对照小鼠的作用。发现小鼠健康且nss为0比1，没有坏死的脑组织。图8a-b显示与未处理的创伤动物相比，弹性蛋白酶抑制剂ii或iii处理的小鼠中，神经元损伤减少且坏死空间减少。使用神经学严重性评分评估神经状态。eisii和iii显著减少了损伤后1小时测量的神经损伤。图8b显示了通过ttc染色测量的创伤小鼠中的坏死空间量；用弹性蛋白酶抑制剂处理将坏死组织的空间明显地从受损半球的50％减少到25％。当测试抑制剂对中性白细胞弹性蛋白酶敲除的小鼠的作用时，获得了几乎相同的结果(图8b)。除了图8a-b中呈现的数据之外，对野生型spraguedawley大鼠进行相同的实验，并获得相似的结果(数据未显示)。
总之，图4a-c、7a-b和8a-b中呈现的结果支持使用弹性蛋白酶抑制剂来减弱坏死性损伤。有趣的是，正常小鼠和基因敲除小鼠的坏死发展和对治疗的反应没有差异，表明中性白细胞弹性蛋白酶在这两个过程中没有任何作用。
在另外的坏死模型中体内测试了cela3a或结构相关的酶的进一步选择的特异性有效抑制剂。先前描述的这种活性小分子抑制剂是通过基于cela3a酶的3d结构相似性和拓扑类似物筛选cela3a抑制剂文库而发现的。这些化合物的体外活性如下所示，参见实施例7。对属于2-氨基噻唑类的活性化合物的化合物z601-4253(2-(哌啶-1-基)噻唑-4-基)(吡咯烷-1-基)甲酮(methanonen)测试了针对肝毒性的保护作用。
我们评估了该化合物作为针对apap肝毒性的抗坏死剂的潜力。为此，我们检查了肝细胞死亡的血清生化标志物：alt和ast的水平的变化。
如图9所示，用300mg/kgapap处理小鼠产生了酶水平的显著增加，在给药扑热息痛(paracetamol)后24小时测量血液中的肝酶水平。仅apap处理的小鼠的alt水平为8220±413u/l，且它们的ast水平为3553±290u/l。单独的假手术、对照和化合物具有的alt低于2％，且ast低于4％。平行对照从相应的apap处理中减少。apap给药后4小时ip注射的化合物z601-4253以剂量依赖的方式显著降低血液中两种肝酶的水平，防止扑热息痛诱导的毒性。
所研究的另一模型为心肌缺血/再灌注损伤的鼠体内模型(图10)。研究了属于2-氨基咪唑啉系列的活性化合物1-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4,5-二氢-1h-咪唑-1-基)丙-1-酮(m059-0891)的效果。结果显示坏死和梗塞尺寸被抑制剂显著减少。
实施例7
根据本发明使用的具体化合物的一般合成方法
下文提供的方案1描述了制备2-氨基咪唑啉化合物的一般合成方法，表3提供了指示变量的具体取代基。
方案1：
表3：
一些2-氨基咪唑啉化合物的制备通过以下实现，制备2-硫基甲基-二氢咪唑氢碘酸盐(1.550gm，0.0063mol)和二异丙基乙基胺(2.2eq)在二氯甲烷(15ml)中的混合物，在室温搅拌且用丙酸酐处理。混合物在室温搅拌过夜。将反应混合物浓缩且用二氯甲烷和水(各20ml)稀释。分离二氯甲烷层，用硫酸钠干燥且浓缩以得到n-丙酰基-2-硫基甲基二氢咪唑(1.2gm)。将n-丙酰基-2-硫基甲基二氢咪唑(400mg)和1-甲基哌嗪(3eq)在叔丁醇(12ml)中的混合物回流3天，然后浓缩且在硅胶柱上使用20–30％甲醇–二氯甲烷纯化，以得到化合物1(50mg)以及起始材料(210mg)。1hnmr(dmso-d6)：0.99(t，j＝8hz，3h)，2.16(s，3h)，2.32(q，j＝8hz，2h)，2.49(m，4h)，3.04(m，4h)，3.39(t，j＝8hz，2h)，3.81(t，j＝8hz，2h)；lcmsm/z225.0[m+1]。该合成步骤按照以上示例的方法a。
一些2-氨基咪唑啉化合物的制备通过以下实现，制备2-硫基甲基二氢咪唑氢碘酸盐(1.1gm)和1-甲基哌嗪(1.5eq)在甲醇(15ml)中的混合物，回流直到反应完成(6-18小时)，然后浓缩且溶于二氯甲烷(20ml)且用三乙胺(2eq)和丙酸酐(1.25eq)处理。将混合物在室温搅拌1小时。然后将反应混合物浓缩且在硅胶柱上使用10-30％甲醇-二氯甲烷纯化以得到化合物1(780mg)。化合物1(0.5gm)进一步在c-18柱上使用0.1％tfa–水纯化以得到化合物1的tfa盐(280mg)。1hnmr(cdcl3)：1.17(t，j＝8hz，3h)，2.38(s，3h)，2.49(q，j＝8hz，2h)，2.54(m，4h)，3.32(m，4h)，3.61(t，j＝8hz，2h)，3.93(t，j＝8hz，2h)；lcmsm/z225.0[m+1]。该合成步骤按照以上示例的方法b。
也按照方法a的合成步骤来合成化合物2(m059-0851)，其具有以下特征：1hnmr(dmso-d6)：0.98(t，j＝8hz，3h)，1.50–1.83(m，8h)，2.30(q，j＝8hz，2h)，2.34–2.37(m，4h)，3.03–3.05(m，4h)，3.12–3.16(m，1h)，3.39(t，j＝8hz，2h)，3.84(t，j＝8hz，2h)；lcmsm/z279.1[m+1].
也按照方法a的合成步骤来合成化合物3tfa盐(m059-0032)然后通过c-18柱纯化，得到以下特征：1hnmr(dmso-d6)：1.82–1.90(m，2h)，1.96–2.03(m，2h)，3.33–3.37(m，2h)，3.50–3.54(m，2h)，3.71(t，j＝8hz，2h)，4.39(t，j＝8hz，2h)，6.81-6.82(m，1h)，7.50(d，j＝hz，1h)，8.11(m，1h)，9.84(s，1h)；lcmsm/z234.0[m+1].
也按照方法a的合成步骤来合成化合物4tfa盐(m059-0055)，得到以下特征：1hnmr(dmso-d6)：1.08–1.83(m，8h)，1.81–1.85(m，4h)，2.15–2.22(m，1h)，2.59(d，j＝8z，2h)，3.38–3.41(m，4h)，3.36(t，j＝8hz，2h)，4.17(t，j＝8hz，2h)，9.47(s，1h)；lcmsm/z250.1[m+1].
也按照方法a的合成步骤来合成化合物5(m059-0082)，也按照方法a的合成步骤来合成1hnmr(dmso-d6)：1.48–1.74(m，8h)，1.85–1.90(m，4h)，2.49–2.56(m，1h)，3.18–3.23(m，2h)，3.34–3.40(m，6h)；lcmsm/z236.1[m+1]。
化合物6(m059-0053)和化合物7(m059-0335)按照方法a以类似于化合物4的方案制备。
化合物8(z601-4253)在二氯甲烷中在dcc、三乙胺和dmap的存在下由2-哌啶子基-1,3-噻唑-4-甲酸和吡咯烷制备。
以下提供的方案2描述了制备2-氨基咪唑啉化合物的一般合成方法，表3提供指示的变量的具体取代基。
方案2：
化合物9(m008-0111)和10(4112-3656)以方案2所述的方法由相应的溴苯乙酮和胺制备。
以下提供的方案3描述了制备2-氨基咪唑啉化合物的一般合成方法。
方案3：
化合物11(z632-2266)由可商购的5-异丙基-3-吡咯烷-2-基异噁唑和环丙烷羧酸在二氯甲烷中在dcc、三乙胺和dmap的存在下根据方案3制备。
以下提供的方案4描述了具体化合物/如本发明所述使用的化合物的另外的一般合成步骤：
方案4：
以下提供的方案5描述了具体化合物/如本发明所述使用的化合物的另外的一般合成步骤：
方案5：
以下提供的方案6描述了具体化合物/如本发明所述使用的化合物的另外的一般合成步骤：
方案6：
以下提供的方案7描述了具体化合物/如本发明所述使用的化合物的另外的一般合成步骤：
方案7：
以下提供的方案8描述了具体化合物/如本发明所述使用的化合物的另外的一般合成步骤。所提供的参考文献也全部通过引用全部并入本发明。
方案8：
以下提供的方案9描述了具体化合物/如本发明所述使用的化合物的另外的一般合成步骤：
方案9：
简言之，pmr谱在300mhzbrukerdpx上注册并使用brukerxwinnmr软件处理。所有商业获得的试剂都被使用，而不用进一步纯化。
化合物3.将化合物1(0.1mol)添加至化合物2(0.1mol)和醚(100ml)的混合物中。将混合物在28-30℃搅拌12小时，然后冷却至5℃。形成的沉淀通过过滤收集，用水洗涤，干燥且从乙醇结晶以得到纯的反应产物3，70-75％产率。
化合物4.将化合物3(0.1mol)悬浮于naoh(0.25mol)和乙醇(5ml)在水(200ml)中的溶液中。将混合物在90℃搅拌直到固体完全溶解。所得溶液冷却至室温且小心用乙酸酸化。形成的沉淀通过过滤收集，用水洗涤，干燥且从二噁烷结晶以得到纯的反应产物4，75-80％产率。
化合物5.将1mmol酸4添加至cdi(0.95mmol)在5ml无水dmf中的溶液中。将混合物在80℃搅拌2小时，此时形成气体。然后将1mmol胺hnr2ar2b添加至反应混合物，将其回流3-4小时且在室温静置过夜。然后将混合物倒入水(10ml)中，形成的沉淀通过过滤收集且通过从丙醇-2结晶纯化以得到纯的反应产物5，40-85％产率。
也参考方案10：
在此提供的参考文献全部并入本发明。
本领域技术人员将理解如何修改上述合成方法来制备表1中的本发明所述或如本发明提供的任何式子所定义的化合物。
实施例8
根据3d结构相似性和拓扑类似物通过筛选cela3a和cela1抑制剂文库发现的活性小分子抑制剂列表
以下化合物由供应商chemdivinc.(sandiego，usa)和它们各自的chemdivi.d.制备。编号显示在下面的表4中。
表4：
坏死细胞死亡的抑制剂
在pc12细胞中测试了这些化合物抑制由kcn诱导的坏死的能力。如前所述，验证了该系统中的细胞死亡坏死模式。结果列于下表中。如上所述，pc12细胞用kcn挑战。在下表5中示出了使用ldh释放方法评估化合物对kcn诱导的坏死的保护性结果。这些抑制剂的ic50值在几十到一纳摩尔的范围内。
表5：
讨论
无法预防或治疗坏死性细胞死亡是一个未解决的问题。本发明人已经表明，通过sirna或通过特异性弹性蛋白酶小分子抑制剂降低弹性蛋白酶样活性，为经历坏死性细胞死亡的细胞带来了保护作用。该保护作用被不同的方法验证。弹性蛋白酶抑制剂保护细胞免受死亡的能力与细胞死亡触发剂无关，如在用kcn处理之后或预先用抗fas和星形孢菌素处理(各自在寡霉素a存在下)所观察到的。不同类别的肽和杂环弹性蛋白酶抑制剂能够以赋予保护，表明该效应不是化合物特异性的。通过坏死细胞的细胞提取物中的弹性蛋白酶样活性的早期增加，提供了对细胞内弹性蛋白酶在这一死亡过程中的作用的另外的支持，这在明显的坏死细胞死亡的任何迹象之前发生。通过使用特异性底物测量弹性蛋白酶样活性证实了活性的增加。另外用可渗透弹性蛋白酶抑制剂(eiii和eiiii)处理完整细胞消除了细胞中酶活性的诱导。在坏死过程中诱导弹性蛋白酶样活性所需的短时间表明该酶在坏死过程的早期阶段起作用，其作为分子事件级联中的早期蛋白水解活化剂，最终导致细胞死亡。弹性蛋白酶在坏死中的这种作用符合蛋白水解级联在细胞死亡过程中的已知的参与。因此，弹性蛋白酶样活性的早期显著诱导和弹性蛋白酶抑制剂防止细胞死亡的能力支持弹性蛋白酶样酶在坏死过程中的关键作用。
在小鼠和大鼠中使用闭合性头部损伤(创伤)模型显示了弹性蛋白酶抑制剂在体内防止脑细胞坏死性损伤的能力。施用弹性蛋白酶抑制剂后，神经功能(nss降低)的改善主要在创伤后1小时观察到，此时神经功能的降低最显著。ttc染色证实的对坏死区域发展的保护作用即使在创伤后24小时也是显著的。脑切片的ttc染色显示出令人印象深刻的图像：弹性蛋白酶抑制剂保护高达60％的脑组织，否则这些脑组织预期会发生坏死。
受影响的组织，例如来自心肌梗塞的，在事件发生后4-12小时内变得坏死。同样，在脑中风的情况下，坏死在(梗塞后)几小时到24小时内甚至更长的时间内发生，对脑组织造成不可修复的损伤。事件发生后立即用弹性蛋白酶抑制剂处理，可以防止坏死的发生。因此，本研究清楚地表示了一种治疗方法。
在本研究中，清楚地显示弹性蛋白酶抑制剂不依赖免疫细胞活性或贡献而减少坏死性细胞死亡。在该实验系统中，利用了没有能够释放hne的中性粒细胞或胶质细胞的细胞单一培养物。值得注意的是，在本研究中使用的pc12细胞系是来自神经元，且没有中性粒细胞弹性蛋白酶。此外，这些结果累积表明普遍存在的弹性蛋白酶样酶参与启动坏死性细胞死亡。因此，进行弹性蛋白酶抑制剂体内给药后，nss的改善可能是由于抑制了存在于神经元细胞中的细胞内弹性蛋白酶样酶的结果。这是由于在免疫优先部位中，在创伤后恢复的早期阶段，没有显著的中性粒细胞浸润，因此由中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制所致的混杂效应是最不可能的。这一观点得到了表明ne敲除小鼠对弹性蛋白酶抑制剂对抗坏死的保护作用有反应的结果的支持。
总之，本发明第一次证实了特异性细胞渗透性弹性蛋白酶抑制剂防止坏死性细胞死亡。这些抑制剂可用于在坏死性损伤发生之前预防细胞死亡，这是本发明所进行的研究令人惊讶地发现的保护作用。这种治疗方法对于中风或心肌梗塞高危患者的治疗可能特别有用。
弹性蛋白酶抑制剂保护细胞免受死亡的能力与细胞死亡触发物无关，并且在体外和体内被记录。此外，通过sirna沉默，更特异性地识别靶标是可行的。
所提供的示例性活性化合物列表包括与cela3a或类似酶具有结构相似性和拓扑学类似性的分子。所有这些化合物被发现在测定中抑制坏死。所有化合物均能够在1μm或更低的浓度下提供显著的保护。
已经观察到，将pc-12细胞暴露于高浓度(高达300μm)的非特异性弹性蛋白酶抑制剂eiii和iii(其自身失活)显著抑制了由kcn诱导的坏死。然而，同样可以容易地看出，公开的小分子抑制剂在低几个数量级的浓度下是有效的。特异性抑制剂相对于非特异性抑制剂的优越性的这种意想不到的发现证实了特异性靶向的重要性。
受影响的组织，例如来自心肌梗塞的组织，在事件发生后4-12小时内变得坏死。同样，在脑中风的情况下，坏死在(梗塞后)几小时到24小时内甚至更长时间内发生，对脑组织造成不可修复的损伤。事件发生后立即用弹性蛋白酶抑制剂处理，将防止坏死的发生。这通过特异性小分子抑制剂的注射即使在施用apap后4小时施用也能防止肝毒性的结果被进一步证实，该小分子抑制剂通过基于3d结构相似性和拓扑类似物筛选cela3a抑制剂文库而发现。mi的治疗还可以通过另一种小分子抑制剂显示梗塞尺寸减少约30％而得到支持，该抑制剂是通过筛查发现的。因此，本研究清楚地代表了治疗性治疗的潜力。
虽然本发明已结合其特定的实施方式进行描述，但显然，对于本领域技术人员而言，许多替换、修改和变更都是很明显的。因此，本发明旨在包括落在所附权利要求的精神和宽范围内的所有此类替换、修改和变更。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用完整地掺入在本说明书中，如同每篇单独的出版物、专利或专利申请单独地明确被指出通过引用合并在此。另外，本申请中任何参考文献的引用或列出不应该被解释为承认此类参考文献是本发明的现有技术。对于使用的章节标题，它们不应该被解释为必要的限制性的。
序列表
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