本发明的领域是诊断和治疗与冠状病毒感染特别是mers相关联的疾病和病症。
背景技术：
背景描述包括对理解本发明可能有用的信息。并非承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或承认具体或隐含引用的任何出版物是现有技术。
中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)是被认为起源于蝙蝠的β冠状病毒。顾名思义，人感染mers-cov可能导致伴有急性呼吸窘迫综合征(ards)的严重的人疾病。传播模式还不清楚。骆驼已知带有mers-cov，并且已经提出了骆驼-对-人和人-对-人传播。目前，诊断是通过用于两种特异性基因组靶序列的阳性分子诊断学(例如，rt-pcr)测试，或使用第二条的测序的单一靶序列的分子诊断学鉴定。
感染mers-cov也可能在人中导致多器官衰竭1-3，其中急性肾衰竭作为与此病毒相关联的高病死率的主要成因之一4-10。本文的所有出版物通过引用并入，如同每种单个出版物或专利申请被具体地或单独地指示通过引用并入的程度一样。在并入的参考文献中的术语的定义或用途与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，并且不适用该术语在参考文献中的定义。此肾衰竭是一般不与其它冠状病毒感染比如sars相关联的临床特征。不幸地，虽然分子诊断学方法对鉴定mers-cov病毒的存在是有用的，但是它们不对肾损害进行预测或预后。
已经尝试了用于mers-cov感染的多种治疗。已经尝试了使用干扰素和干扰素与利巴韦林(ribavarin)的组合的治疗，但是结果喜忧参半。也已经提出了抑制病毒蛋白酶。不幸地，与mers感染相关联的肾损伤——其是死亡率的显著促因——的致病机制未知并且因而不容易接受特异性治疗。
因而，对提供与mers-cov感染相关的肾衰竭的诊断和/或预后的方法和组合物以及这样的肾衰竭的治疗仍然存在需要。
技术实现要素：
本发明主题提供了用于治疗、诊断与mers-cov感染相关的肾病以及提供与mers-cov感染相关的肾病的预后信息的方法。fgf2、smad7、和/或fgf2上游序列的转录和翻译产物(例如，mrna或肽)可用作指示肾病和/或提供与肾病的进程相关的预后信息的标志物，所述肾病与mers-cov感染相关。通过减少和/或调控转录和通过使用大分子结合配偶体比如抗体隔绝相关的肽，可以通过降低fgf2、smad7、和/或fgf2上游序列的利用度治疗和/或减轻这样的肾病。
本发明构思的一个实施方式是诊断与mers-cov感染相关联的肾病的方法，其通过从怀疑感染mers-cov的个体获得样品，表征fgf2、smad7、和fgf2上游序列中的一种或多种中的至少一种的表达，并且鉴定这样的标志物(一种或多种)中的至少一种的过表达，其中这样的过表达指示与mers-cov感染相关联的肾病。在一些实施方式中，可以使用rna转录物——例如通过rt-pcr——测定过表达。在其它实施方式中，例如，使用免疫试验表征fgf2、smad7、和fgf2上游序列中的一种或多种的多肽。
本发明构思的另一个实施方式是获得与肾病——其与mers-cov感染相关联——相关的预后信息的方法，其通过从怀疑感染mers-cov的个体获得样品，表征fgf2、smad7、和fgf2上游序列中的一种或多种中的至少一种的表达，并且鉴定这样的标志物(一种或多种)中的至少一种的过表达，其中这样的过表达指示与mers-cov感染相关联的肾病。在一些实施方式中，可以使用rna转录物——例如通过rt-pcr——测定过表达。在其它实施方式中，例如，使用免疫试验表征fgf2、smad7、和fgf2上游序列中的一种或多种的多肽。在一些实施方式中，这样的预后信息与肾病的阶段相关。在其它实施方式中，预后信息与肾病的结果相关。
本发明构思的另一个实施方式是预防与mers-cov感染相关联的肾病的方法，其通过在感染mers-cov的个体中降低fgf2、smad7、和/或fgf2上游序列中的一种或多种中的至少一种的利用度。这样的利用度的降低通过减少基因表达和/或降低基因产物的生物利用度实现。在一些实施方式中，与fgf2、smad7、和/或fgf2上游序列中的一种或多种相关联的基因的表达被减少，例如通过施用干扰转录和/或翻译的多核苷酸(比如sirna、rnai、核酶、和/或反义多核苷酸)。在其它实施方式中，施用化合物(例如，多核苷酸、肽、蛋白质、转录因子、和/或小分子)，其与编码fgf2、smad7、和/或fgf2上游序列的基因(一个或多个)中的一种或多种的上游调控元件相互作用。在其它实施方式中，施用化合物(比如肽、蛋白质、和/或小分子)，其与和fgf2、smad7、和/或fgf2上游序列相关联的一种或多种调控途径(一个或多个)相互作用。在另一个实施方式中，通过施用结合配偶体(比如抗体、合成抗体、单链抗体、受体、和/或适配体)——其对与fgf2、smad7、和fgf2上游序列对应的多肽具有亲和力——降低生物利用度。
本发明构思的另一个实施方式是治疗与mers-cov感染相关联的肾病的方法，其通过在感染mers-cov的个体中降低fgf2、smad7、和/或fgf2上游序列中的一种或多种的利用度。这样的利用度的降低通过减少基因表达和/或降低与fgf2、smad7、和/或fgf2上游序列中的一种或多种相关联的基因表达产物的生物利用度实现。在一些实施方式中，与fgf2、smad7、和/或fgf2上游序列中的一种或多种相关联的基因的表达被减少，例如通过施用干扰转录和/或翻译的多核苷酸(比如sirna、rnai、核酶、和/或反义多核苷酸)。在其它实施方式中，施用化合物(例如，多核苷酸、肽、蛋白质、转录因子、和/或小分子)，其与编码fgf2、smad7、和/或fgf2上游序列的基因(一个或多个)中的一种或多种的上游调控元件相互作用。在其它实施方式中，施用化合物(比如肽、蛋白质、和/或小分子)，其与和fgf2、smad7、和/或fgf2上游序列相关联的一种或多种调控途径(一个或多个)相互作用。在另一个实施方式中，通过施用结合配偶体(比如抗体、合成抗体、单链抗体、受体、和/或适配体)——其对与fgf2、smad7、和fgf2上游序列对应的多肽具有亲和力——降低生物利用度。
连同附图根据下列优选实施方式的详细描述，本发明主题的多种目标、特征、方面和优点将变得更明显，在附图中，相同的数字代表相同的组分。
附图说明
图1a显示了多种基因家族的基因在感染mers-cov的calu3细胞和在感染sars＝cov的calu3细胞中的表达水平。
图1b在上图中显示了感染mers-cov和感染sars-cov的离体培养的肾组织中的病毒rna表达程度。图1b的下图显示了感染mers-cov的肾组织切片的免疫组织化学研究的结果，其使用针对mers-cov核壳蛋白和细胞特异性标志物的抗体进行染色。
图1c是感染mers-cov的肾的组织切片的电子显微照片，其在原位显示了病毒颗粒。
图1d显示了与mers-cov一起培养的hk2细胞的感染结果，其显示了将感染性mers-cov释放入培养基(上图)和感染性mers-cov在细胞内的生长(下图)。
图2a描绘了感染mers-cov的hk2细胞中凋亡(apoptic)活性的表征结果。
图2b显示了感染mers-cov的hk2细胞的蛋白质印迹研究的结果。使用针对胱天蛋白酶3(凋亡标志物)以及fgf2和smad7的抗体可视化印迹。
图2c和图2f显示了mers-cov和sars-covhk2细胞中fgf2和smad7mrna水平的表征结果。
图2d是描绘大量标志物在感染mers-cov或sars-cov的calu3细胞中的mrna表达水平的热点图。
图2e显示了由感染mers-cov的细胞产生的fgf2蛋白的浓度的定量研究的结果。
图3a显示了针对smad7的沉默rna(sirna)对感染mers-cov的细胞的作用。如在左侧显示的，smad7mrna表达程度在sirna处理的感染细胞中被阻抑。如在右侧显示的，使用针对smad7的sirna的处理在感染mers-cov的细胞中阻抑胱天蛋白酶3的表达和相对凋亡活性。
图3b显示了抑制或隔绝fgf2对感染mers-cov的细胞中的凋亡活性的作用。左图显示了使用fgf2信号传导的小分子抑制剂ag1296的处理的作用。右图显示了使用针对fgf2的抗体隔绝fgf2的作用。
图3c和3d显示了通过施加smad7反义寡核苷酸抑制mers-cov复制。图3c显示了来自细胞溶胞产物的结果。图3d显示了来自培养基的结果。复制被认为通过抑制细胞凋亡——一种促进病毒释放和传播的过程——被减少。
图3e显示了使用图3c和3d的smad7反义寡核苷酸进行的细胞毒性研究的结果。
图4a显示了来自人mers-cov感染的动物模型的组织活检的mrna表达研究的结果。
图4b显示了6只感染mers-cov的动物对象的肺(ull＝左上肺，lll＝左下肺，url＝右上肺，lrl＝右下肺)和肾(ki)组织样品的mers-covrna表征结果。
图4c显示了从人感染的感染mers-cov的动物模型获得的肺组织的免疫组织化学研究的结果。使用针对胱天蛋白酶3、fgf2、和samd7的抗体可视化组织。
图4d显示了来自人感染的感染mers-cov的动物模型的肺组织的组织病理学研究，其显示了肺炎的特性征候。
图4e显示了从人感染的感染mers-cov的动物模型获得的肾组织的免疫组织化学研究的结果。使用针对胱天蛋白酶3、fgf2、和samd7的抗体可视化组织。
图4f显示了人感染的感染mers-cov的动物模型的肾切片的苏木精和伊红染色的组织病理学研究，其显示了急性肾损伤的特征。
图5显示了感染mers-cov的动物模型的肺上的mers-cov感染的结果。图5的上图显示了在mers-cov感染之后的肺病理学的放射显影研究。图5的下图描绘了来自在上图中显示的动物的尸体剖检的肺的肉眼病理学(grosspathology)。
具体实施方式
下列描述包括对理解本发明可能有用的信息。并非承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或承认具体或隐含引用的任何出版物是现有技术。
本发明主题提供了设备、系统和方法，方法和组合物在其中被提供，在所述方法和组合物中，表征fgf2、smad7、和/或fgf2上游序列的表达被用于诊断和/或评价mers相关肾病的预后，其中过表达与肾病和/或肺病相关联。在本发明构思的其它实施方式中，抑制fgf2和/或smad7的表达和/或活性被用于治疗和/或预防由感染mers冠状病毒造成的肾病和/或肺病。
应当领会公开的技术提供了许多有利的技术效果，包括鉴定对预防病痛和/或死亡——其由于在mers感染之后肾细胞中的凋亡活性——有效的治疗模态。而且，由于本发明人在肺细胞中观察到相似的机制，考虑由于mers病毒的肺损伤也可能被减少或甚至被消除。
下列讨论提供了本发明主题的许多实例实施方式。虽然每个实施方式表示本发明要素的单一组合，但是本发明主题被认为包括公开的要素的所有可能的组合。因而如果一个实施方式包括要素a、b、和c，并且第二个实施方式包括要素b和d，则本发明主题也被认为包括a、b、c、或d的其它其余组合，即使没有被明确地公开。
本文的值的范围的叙述仅仅意欲充当单独引用落入该范围内的每个单独值的速记方法。除非本文另外指示，范围内的每个单值被并入说明书，如同它在本文被单独地叙述一样。可以以任意合适的顺序进行本文描述的所有方法，除非本文另外指示或另外与上下文明显矛盾。本文关于某些实施方式提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“比如”)的使用仅仅意欲更好地说明本发明，并且不对另外要求保护的本发明的范围施加限制。说明书中的任何语言均不应当被解释为指示任何未要求保护的要素对本发明的实践必不可少。
本文公开的发明的可选要素或实施方式的分组不被解释为限制。每个组成员可以被单独地提及和要求保护，或以与组的其它成员或在本文发现的其它要素的任意组合被提及和要求保护。组的一个或多个成员出于便利和/或专利性的原因可以被包括在该组中或从该组删除。当任何这样的包括或删除发生时，说明书在本文被认为包含如被修改的组，因而满足在所附权利要求中使用的所有马库什基团的书面描述。
本文公开的发明的可选要素或实施方式的分组不被解释为限制。每个组成员可以被单独地提及和要求保护，或以与组的其它成员或在本文发现的其它要素的任意组合被提及和要求保护。组的一个或多个成员出于便利和/或专利性的原因可以被包括在该组中或从该组删除。当任何这样的包括或删除发生时，说明书在本文被认为包含如被修改的组，因而满足在所附权利要求中使用的所有马库什基团的书面描述。
本领域技术人员应当明白，除那些已经描述的之外，更多修改也是可能的，而不背离本文的本发明构思。因此，除所附权利要求的精神以外，本发明主题不被限制。而且，在解释说明书和权利要求书二者时，应当以与上下文一致的最宽的可能方式解释所有术语。具体而言，术语“包括”和“包含”应当被解释为以非排他性方式引用要素、组分、或步骤，这指示引用的要素、组分、或步骤可以存在，或被利用，或与未明确引用的其它要素、组分、或步骤组合。在说明书或权利要求书指的是选自a、b、c….和n的一些中的至少一种时，文本应当被解释为需要来自上述中的仅一个要素，而非a加n，或b加n等。
本发明构思的一个实施方式包括在鉴定由于mers冠状病毒感染的肾和/或肺病的诊断和/或治疗靶标中有用的方法。在这样的实施方式中，感染mers的细胞中的蛋白质的转录模式的特征在于鉴定可以被用于预测、诊断、减轻、和/或预防mers感染的肾损伤效应的蛋白质/肽和/或蛋白质/肽的家族。为了表征对mers-cov感染的宿主反应，感染mers-cov的极化人支气管上皮calu-3细胞的转录物组概况(transcriptomicprofile)可以与来自相同细胞系的被重症急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)感染的细胞的转录物组概况比较。这样的研究的典型结果在图1a中被显示。如显示的，感染病毒的样品在多个时间点处的基因表达水平首先与相同样品在时间零(即在感染之前)处的基因表达水平比较。通常，差异表达的基因的数目随着时间增加。在显示的示例性数据中，例如，在mers-cov感染后2、4、12和24小时处分别观察到462、639、1650和4287种差异表达的基因。令人惊讶地，在与肾坏死/细胞死亡相关下分类的基因主要在感染mers-cov的细胞中，而非在感染sars-cov的细胞中被影响。本发明人考虑这样的结果与如下临床观察相关：在mers感染中发现而未在感染sars-cov的患者中发现高发病率的肾衰竭。
虽然已经报道了检测感染患者的尿中的mers-covrna，但是先前没有报道肾的mers-cov感染的直接体内证据。本发明构思的一个实施方式是用于表征病毒(例如，冠状病毒)感染效应的离体人肾培养物模型。在一些这样的实施方式中，冠状病毒是mers冠状病毒。本发明人考虑其它人器官培养物(例如，人肺培养物)也可以充当冠状病毒(例如，sars冠状病毒株和/或mers冠状病毒株)的人感染模型。使用人肾培养物的本发明构思的实施方式证明这样的培养物中的肾细胞可以被mers-cov容易地感染。这在图1b的下图中被显示，其显示了针对这样的细胞中的病毒核壳蛋白(np)的免疫组织化学研究的结果。为了鉴定特定的感染细胞类型，可以进行np和多种肾细胞标志物的感染的肾组织的共免疫染色。通常，观察到mers-covnp与突触足蛋白、cd31和细胞角蛋白18的共定位，这指示多种类型的肾细胞——包括肾上皮细胞、肾小囊的壁细胞、肾小管细胞、和血管内皮细胞——易受mers-cov感染。可以通过电子显微术进一步确认感染的肾细胞内病毒体的存在(典型结果在图1c中被显示)。也可以在肾细胞模型——包括原代正常人系膜细胞(nhmc)、足细胞和肾近端小管hk2细胞——中证明病毒易感性(图1d)。这样的培养物有利地允许在体外表征由mers-cov感染诱导的生物学改变。
更具体地，图1a至1d描绘了离体和体外研究的结果，其将培养物中细胞的感染表征为感染mers-cov。图1a使用由这样的感染细胞测定的差异基因表达概况显示了感染mers-cov(上图)和感染sars-cov(下图)的calu-3细胞(源自人肺腺癌)的途径分析。表征的基因基于与多种临床条件的关联被分组为不同类别。如显示的，观察到mers冠状病毒(mers-cov)感染和sars冠状病毒(sars-cov)感染的模式是类似的，例外是感染mers-cov的细胞中对与肾坏死相关联的基因的选择性过表达的指示。
图1b上图显示了离体培养的人肾被接种mers-cov(左)和接种sars-cov(右)的研究的结果。在通过接种感染mers-cov(左；泳道1–5)和通过接种感染sars-cov(右；泳道1–5)后的指定时间点处，从这样的细胞收集总rna。随后使用rt-pcr扩增病毒rna。感染mers-cov的hk2(左；“+”；泳道6)和感染sars-cov的calu-3样品(右；“+”；泳道6)被包括作为阳性对照。模拟试验处理的hk2(左；“-”；泳道7)和calu-3(右；“-”；泳道7)样品被包括作为阴性对照。还显示了存在的组成型表达的3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)mrna的量。如显示的，使用mers-cov感染培养的人肾的细胞导致未在sars-cov感染中发现的病毒rna的时间依赖性增加，这指示肾特异性效应。
图1b的下图显示了感染mers-cov的肾的免疫组织化学研究的结果。在典型研究中，接种mers-cov的人肾被冷冻切片，并且通过使用第一荧光染料(直接地或间接地经由抗物种抗体)标记的特异性抗体(左图)，使用特异性抗体通过免疫染色鉴定mers-cov的核蛋白(np)。为了鉴定多种细胞类型在这样的感染mers-cov的肾内的分布，使用针对突触足蛋白、cd31、和/或细胞角蛋白18(ck18)(中图)——其直接地或间接地标记有第二染料——的细胞类型特异性抗体共染色冷冻切片。病毒抗原与细胞标志物的共定位在右侧图被显示。图1c显示了来自类似研究的典型结果，所述研究利用感染mers-cov的人肾的电子显微检查以提供对肾组织中mers-cov病毒体的直接鉴定。箭头指示了人肾组织基体内的mers-cov颗粒。这样的研究指示这样的人肾培养物可以被利用为鉴定在指示人患者中肾的mers-cov感染中有用的基因和/或蛋白质/肽标志物的工具。
本发明构思的另一个实施方式是将源自肾的培养的细胞用于表征与mers-cov感染和这样的感染的预后相关联的基因和蛋白质/肽标志物。图1d显示了研究的结果，其中感染mers-cov的hk2(人近端小管上皮细胞系)和nhmc(正常人系膜细胞)的条件培养基(上)和细胞溶胞产物(下)被暴露于mers-cov。在感染之后，使用tcid50试验表征和定量这样的细胞的条件培养基(上图)和细胞溶胞产物(下图)的mers-cov含量。如显示的，与这些培养的细胞相关联的mers-cov的数量指示培养的肾细胞容易被mers-cov感染，并且可以被利用为鉴定在指示人患者中肾的mers-cov感染中有用的基因和/或蛋白质/肽标志物的工具。
本发明构思的另一个实施方式是将与凋亡相关联的标志物用于诊断和/或评价患有mers-cov感染的个体中肾病的预后。基于转录物组和离体研究中的发现，本发明人假设mers-cov通过诱导凋亡——细胞死亡的一种主要形式——来诱发肾衰竭。可以利用免疫学试验或染色方法测定凋亡特有的细胞蛋白的存在。图2a在感染mers-cov的hk2细胞中显示了这样的研究的典型结果。如显示的，凋亡的胱天蛋白酶-3的荧光免疫染色试验显示了感染mers-cov的hk2细胞中强烈的典型促凋亡反应。可以通过蛋白质印迹分析测定和/或另外地确认胱天蛋白酶-3在感染mers-cov的细胞中升高的表达，其未在模拟试验感染的细胞中发现，如图2b中显示的。类似的结果在图2b中被显示，这样的测试系统指示了高水平的胱天蛋白酶3、fgf2、和smad7在mers-cov细胞中的选择性表达。微管蛋白充当阳性对照，其在感染mers-cov的细胞和模拟试验感染的细胞二者中高度表达。类似地，定量研究显示了fgf2蛋白在感染mers-cov的细胞中升高的表达(参见图2e)。对于与这样的标志物相关的mrna，可以证明类似的结果。如图2c和图2f中显示的，fgf2和smad7的mrna水平在感染mers-cov的hk2细胞，而不在感染sars-cov的hk2细胞中选择性地升高。在本发明构思的一些实施方式中，通过这样的测试系统的mers-cov感染鉴定的标志物(比如胱天蛋白酶-3、fgf2、和/或smad7)或编码这样的标志物的区域上游的序列的蛋白质和/或mrna的升高的表达可以被用于诊断或评价与mers-cov感染相关联的肾病的预后。
如上面显示的，转录物组数据指示与肾坏死/细胞死亡相关的生物学途径在感染mers-cov的细胞中被严重地扰乱(参见图1a)。在本发明构思的一些实施方式中，编码fgf2和smad7的基因可以被利用为mers-cov诱导的凋亡的指示物(参见图2c和图2d)。图2d显示了感染mers-cov的calu-3细胞和感染sars-cov的calu-3细胞中大范围的特异性基因产物的定量研究的典型结果。结果被展示为热点图。令人惊讶地，本发明人已经鉴定了不仅在肾中而且在肺中，fgf2和smad7二者在mers-cov诱导的凋亡中升高的表达，如它们在感染mers-cov的hk2(图2b和2f)以及calu-3细胞(图2d)二者中升高的表达指示的。
更具体地，图2a至2f显示了mers-cov感染诱导fgf2和smad7的表达的研究的结果。图2a显示了研究的结果，其中通过胱天蛋白酶-3活性的荧光分析测量感染mers-cov的hk2细胞的凋亡(泳道1)。模拟试验感染的(泳道2)细胞被包括为阴性对照。图2b描绘了胱天蛋白酶-3、fgf2和smad7在感染mers-cov和模拟试验感染的hk2细胞中的蛋白质印迹分析。γ-微管蛋白也被检测为上样对照。图2c显示了fgf2和smad7表达在肺细胞中的mers-cov诱导。通过qpcr定量fgf2和smad7在感染mers-cov和sars-cov的calu-3中的相对表达水平。图2d提供了热点图，其显示了在图1a中鉴定的“肾坏死/细胞死亡”的类别中的候选基因。图2e显示了研究的结果，其中使用抗fgf2elisa试剂盒进行分泌的fgf2的定量测量。图2f显示了研究的结果，其中使用rt-qpcr测量smad7和fgf2mrna的相对表达(右图)。通过学生t检验评价统计学显著性，并且指示p值的范围。
在本发明构思的一些实施方式中，通过转录物组途径鉴定的蛋白质的表达和/或功能降低被利用为治疗mers感染中的治疗模态。鉴定作为mers-cov致病机制的介体的smad7和fgf2指示任一种或二者可以充当治疗靶标。值得注意的是，smad7位于fgf2上游，并且在一些实施方式中，fgf2上游序列被利用为治疗靶标。类似地，smad7和/或fgf2的过表达指示可以充当与mers-cov感染相关联的肾病和/或肺病的存在和/或程度的诊断和/或预后指标。本发明人已经发现妥协的(compromising)smad7和表达可以破坏mers病毒诱导的损伤。在一个实施方式中，使用sirna可以降低这样的凋亡相关蛋白的表达。hk2细胞中的典型结果显示使用针对这样的标志物的sirna(例如sismad7-1(seqidno.xxx)和sismad7-2(seqidno.yyy))可以实现表达降低。在这样的研究中，smad7的表达分别在蛋白质(图3a；左上图和rna水平(图3a；左下图)下通常降低75％和40％(p<0.05)。考虑smad7和fgf2表达或功能可以通过其它方法被降低，包括使用rnai、反义多核苷酸、核酶、适配体、调节肽、调节因子的小分子抑制剂或类似物、抗体(天然的和合成的)、和/或抗体片段。
图3a至3e显示了研究的典型结果，其证明fgf2和smad7表达的阻抑可以破坏mers-cov诱导的凋亡。图3a显示了sirna敲低研究的结果。hk2细胞中mers-cov诱导的smad7表达通过转染sirna(sismad7-1，泳道1并且sismad7-2，泳道2)被减幅。沉默sismad7-1对包括序列guucaggaccaaacgaucugc(seqidno.5)和gcagaucguuugguccugaacau(seqidno.6)。沉默sirna对sismad7-2包括序列cucacgcacucggugcucaag(seqidno.7)和cuugagcaccgagugcgugagcg(seqidno.8)。也分析了转染对照sirna(sicontrol)(泳道3)和模拟试验感染的细胞(泳道4)。上左图显示了smad7的蛋白质表达。γ-微管蛋白被利用为上样对照。图3a的下左图显示了归一化为gapdh的mrna水平的smad7的mrna水平。还测定了胱天蛋白酶-3的表达(图3a的上右图)和活性(图3a的下右图)。图3b显示了通过小分子化合物或抗体的fgf2抑制的结果。当使用小分子抑制剂(例如，ag1296)阻断fgf2信号传导时(左图，泳道1)，测量感染mers-cov的hk2细胞中的胱天蛋白酶-3活性。特异性地阻断表皮生长因子而非fgf2信号传导的类似化合物ag490充当对照(左图，泳道2)。此外，在使用抗fgf2中和抗体(右图，泳道1)或不相关的igg(右图，泳道2)处理的感染mers-cov的hk2细胞中测定胱天蛋白酶-3表达。还评估模拟试验感染的细胞(右图，泳道3)。γ-微管蛋白被利用为上样对照。图3d显示了研究的结果，其中通过测量病毒转录物在感染mers-cov的hk2(灰色正方形)和calu-3细胞(深色菱形)中的水平评估抗smad7寡核苷酸的抗病毒活性。图3d显示了研究的结果，其中通过测量病毒产生在感染mers-cov的hk2(灰色正方形)和calu-3细胞(深色菱形)中的水平评估抗smad7寡核苷酸的抗病毒活性。图3e显示了抗smad7寡核苷酸在mers-cov诱导的hk2(灰色正方形)和calu-3(深色菱形)细胞中的细胞毒性研究的结果，其通过细胞代谢活性的mtt比色试验测量。
在本发明构思的一些实施方式中，fgf2、smad7、和/或fgf2上游序列的表达修饰可以被用于预防、减少、或消除由mers-cov感染造成的肾和/或肺损伤，例如通过减少mers-cov诱导的凋亡。修饰smad7表达对mers-cov诱导的凋亡的影响可以通过表征凋亡标志物——比如胱天蛋白酶-3——的活性表达测定。例如，如图3a的左图中显示的，施加针对smad7的sirna(例如sismad7-1和sismad7-2)对降低smad7表达是有效的。如图3a的右图中显示的，施加针对smad7的sirna对如下也是有效的：降低凋亡标志物胱天蛋白酶3在感染mers-cov的细胞中的表达，将表达减少至与在模拟试验感染的细胞中发现的类似水平。
在其它实施方式中，可以影响smad7和/或fgf2的表达和/或活性的小分子(比如酪氨酸磷酸化抑制剂ag1296和/或nsc37204)可以被用于预防、减少、和/或消除mers-cov感染的凋亡诱导效应。图3b的左图显示了在感染的细胞中施用小分子抑制剂酪氨酸磷酸化抑制剂ag1296——其特异性地阻断fgf受体的酪氨酸激酶活性并且因此阻断fgf2表达的下游信号传导——对mers-cov诱导的凋亡的典型结果。阻断fgf2的下游信号传导降低mers-cov诱导的凋亡大约40％(p<0.05)。利用对照抑制剂酪氨酸磷酸化抑制剂ag490——其抑制表皮生长因子受体——的治疗未能显著地减少mers-cov诱导的凋亡。
在还其它实施方式中，针对fgf2、smad7、或在fgf2上游表达的分子的大分子抑制剂和/或隔绝剂(例如特异性抗体或适配体)可以被用于预防、减少、和/或消除与mers-cov感染相关联的对肾或肺的损伤。如图3b的右图中显示的，使用抗fgf2中和抗体隔绝分泌的fgf2可以被用于降低表达的fgf2在mers-cov感染中的功能。添加抗fgf2减弱胱天蛋白酶-3表达大约50％。本发明构思的抗体可以是人或动物(包括鸟类)起源的多克隆或单克隆抗体、人源化抗体、抗体片段、和/或单链抗体。
总的来说，在本发明构思的一些实施方式中，通过降低fgf2、smad7、和/或在fgf2上游表达的产物的表达或功能，可以预防、减少、和/或消除由mers-cov感染造成的肾和/或肺组织中的凋亡事件。这样的活性表达降低可以通过遗传手段(例如使用sirna、反义寡核苷酸、和/或其它寡核苷酸)、小分子(例如小分子量抑制化合物)、和/或大分子(比如抗体)隔绝和/或抑制实现。降低活性fgf2、smad7、和fgf2上游序列的不同途径——其中这样的途径涉及在不同的水平下实现这样的活性——的有效性指示这是普遍现象，其不限于特定种类的分子和/或作用机制。
在本发明构思的另一个实施方式中，降低fgf2和/或smad7表达或功能可以被用于减少mers-cov病毒的复制和/或传播。应当领会，除导致肾和/或肺损伤的直接问题之外，mers-cov在感染的细胞中促进凋亡也可以用于将病毒后代传播至相邻细胞。在本发明构思的一些实施方式中，破坏由mers-cov感染诱导的凋亡过程(如上面详细描述的)也可以用于打断高度溶胞的mers-cov复制周期，从而减少或停止将病毒传播至邻近的、未感染的细胞。例如，在使用mers-cov攻击前，使用抗smad7寡核苷酸(比如gtcgccccttctccccgcag(seqidno.9))处理hk2和calu-3细胞提供了凋亡的剂量依赖性减少。mtt试验显示了抗smad7寡聚物(oligo)分别在hk2和calu-3细胞中以0.432μg/ml和0.965μg/ml的浓度保护50％的细胞免于mers-cov诱导的凋亡(参见图3e)。在本发明构思的一些实施方式中，这样的反义寡核苷酸可以包括非天然碱基和/或寡核苷酸骨架结构。例如，反义寡核苷酸比如由seqidno.9表示的那些可以在特定位置处(例如，在c超过g的地方)用5-甲基-脱氧胞嘧啶置换胞嘧啶。类似地，所有或部分磷酸骨架结构可以被替换为非天然存在的结构比如o,o’-连接的硫代磷酸酯。在一些实施方式中，可以包含对反义序列的两种这样的变化。与此一致的，rt-qpcr定量证明，mers-cov病毒产生与施用的抗smad7寡聚物的浓度成反比例(参见图3c)。使用噬菌斑试验获得了类似的结果，其测量了活的感染性病毒的量。在抗smad7寡聚物处理的calu-3和hk2细胞中，相对于未处理的细胞，本发明人通常在处理的细胞中观察到病毒产生的至少2-log减少(参见图3d)。抗smad7寡聚物针对mers-cov诱导的凋亡的高度保护效应指示降低smad表达是用于mers感染的潜在治疗选项。虽然描述了反义smad7寡核苷酸的用途，但是考虑针对fgf2和fgf2上游序列反义寡核苷酸提供类似的保护。此外，虽然描述了反义寡核苷酸，但是考虑其它抑制性寡核苷酸(例如sirna)、小分子抑制剂、和/或大分子抑制剂和/或隔绝剂用于降低fgf2、smad7、和/或在fgf2上游编码的序列的表达和/或活性的用途。显著地，在肾和肺细胞二者中发现了类似的效应。因此，关于肾细胞考虑的所有考量和优势也适用于肺细胞损伤，其中肺感染mers-cov病毒。
已经使用非人灵长类动物模型——其概括了在感染mers的患者中可见的严重的和有时致命的带有播散性肺外感染的呼吸症状，并且紧密地类似人患者的临床概况——确认了这样的体外研究和实际mers感染之间的关联。在典型研究中，使用mers-cov攻击6只普通狨猴的组。所有接种mers-cov的普通狨猴发展出急性呼吸窘迫综合征(ards)，其中一只死于严重的病痛。通过在从接种mers-cov的普通狨猴收集的所有肺样品中检测病毒rna和抗原来确认mer-cov感染(图4a，上图，和图4b)。与临床发现一致，可以在上呼吸道(ull)和下呼吸道(lrl和lll)二者中检测到mers-cov。肺活检的组织病理学检查在严重感染的普通狨猴中揭示出广泛的支气管间质性肺炎(图4c，右图，和图4d)。结果确认了mers-covrna的量与smad7和fgf2的表达水平之间的良好关联(图4a，中和下图)。这样的发现符合离体人器官培养物和细胞系数据，其中mers-cov已经发现通过诱导fgf2和smad7来介导凋亡。
更详细地，图4a、4e、和4f显示了接种mers-cov的普通狨猴中病毒载量和宿主基因表达的研究结果。图4a显示了mers-covrna在接种mers-cov的普通狨猴的肺的多个部位中的定量测量结果(上)。指示了fgf2(中)和smad7(下)的相对表达水平。使用gapdh使所有值归一化。url＝右上肺；lll＝左上肺；lrl＝右下肺并且ull＝左上肺。图4e显示了mers-covnp与胱天蛋白酶-3(上)、smad7(中)和fgf2(下)在接种mers-cov的普通狨猴的肾中的共-免疫组织化学染色结果。图4f显示了接种mers-cov的普通狨猴的肾切片的苏木精和伊红染色结果。在感染的肾(箭头)中观察到间质性浸润。在接种mers-cov的普通狨猴的肾切片中检测到急性肾损伤的特有临床特征，包括扁平上皮细胞(箭头)和肾小管周(peritubular)毛细血管充血(白色箭头)。d＝膨胀的肾小管；pc＝蛋白管型(proteincast)。
图4b、4c、和4d显示了检测来自接种mers-cov的普通狨猴的肺和肾的mers-covrna和抗原。图4a显示了来自接种mers-cov的普通狨猴(cm1至cm6)的肺和肾的不同部位的mers-covrna的rt-pcr表征结果。url＝右上肺；lll＝左下肺；lrl＝右下肺；ull＝左上肺并且ki＝肾。图4c显示了来自接种mers-cov的普通狨猴的肺的免疫组织化学染色结果，mers-covnp、胱天蛋白酶-3(上)、smad7(中)和fgf2(下)如图4a中显示的。图4d描绘了接种mers-cov的普通狨猴的肺中的组织病理学改变。感染的肺组织显示了急性支气管间质性肺炎以及炎性细胞的流入和肺泡隔的增厚。
显著地，在这样的研究中，在6份肾样品中的4份中也检测到病毒rna和抗原(图4c和图4e)。有趣地，感染的肾样品展现出急性肾损伤(aki)特有的临床特征(图4f)。鉴定肾样品中的mers-covrna和抗原指示mers-cov可以在体内经由凋亡对感染的肺引发直接损伤。显著地，mers-covnp与胱天蛋白酶-3、fgf2、和smad7的共定位在肾小管细胞和肺细胞二者中均被发现。这与本发明人的细胞感染模型——其中mers-cov通过诱导由诱导fgf2和smad7介导的凋亡来诱导直接的细胞病变效应——一致。总而言之，体外、离体和体内结果与本发明人的如下发现一致：smad7和fgf2在mers诱导的肺和肾致病机制中发挥重要和/或关键作用。
如上面记载的，在本发明构思的一些实施方式中，表征smad7和/或fgf2表达可以被用于诊断与mers-cov感染相关联的肾病。在这样的实施方式中，可以在核苷酸表达和/或蛋白质表达的方面表征表达。可以通过任意合适的技术进行smad7和/或fgf2的核苷酸表达(例如mrna表达)，包括rt-pcr、实时rt-pcr、和直接杂交。可以通过任意合适的方法进行蛋白质表达(例如细胞内或细胞外smad7和/或fgf2的检测)，包括免疫学试验(比如eia、ria、和/或fia)、免疫荧光染色、facs等。这样的蛋白质表达技术可以被应用于任意合适的样品，比如全血、血浆、血清、唾液、泪液、滑液、粘液、间质液、和/或组织样品。这样的核苷酸和/或蛋白质表达研究的结果可以是定量的或非定量的，并且在一些实施方式中可以在自动化系统上进行。
在本发明构思的其它实施方式中，表征smad7和/或fgf2表达被用于以预后方式表征与mers-cov感染相关联的肾病的阶段或给临床医生提供对这样的疾病的可能的进程的理解。在这样的实施方式中，可以在核苷酸表达和/或蛋白质表达的方面表征表达。可以通过任意合适的技术进行smad7和/或fgf2的核苷酸表达(例如mrna表达)，包括rt-pcr、实时rt-pcr、和直接杂交。可以通过任意合适的方法进行蛋白质表达(例如细胞内或细胞外smad7和/或fgf2的检测)，包括免疫学试验(比如eia、ria、和/或fia)、免疫荧光染色、facs等。这样的蛋白质表达技术可以被应用于任意合适的样品，比如全血、血浆、血清、唾液、泪液、滑液、粘液、间质液、和/或组织样品。这样的核苷酸和/或蛋白质表达研究的结果可以是定量的或非定量的，并且在一些实施方式中可以在自动化系统上进行。
在本发明构思的另一个实施方式中，降低fgf2、smad7、和/或fgf2上游序列的表达和/或有效表达的方法和组合物被用于降低或消除由mers-cov感染造成的肾衰竭。在一些实施方式中，此表达降低在转录水平下实现，例如通过使用sirna、rnai、和反义多核苷酸——其干扰fgf2、smad7、和/或fgf2上游序列的有效转录和/或翻译——进行处理。在本发明构思的其它实施方式中，与和fgf2、smad7、和/或fgd2上游序列相关联的调控区相互作用的肽、蛋白质、和/或小(即小于大约500d)分子被用于抑制或减少这些序列的转录。
在本发明主题的又进一步考虑的方面，本发明人还考虑抑制或减少凋亡的药物可以被用于(单独或与在本文呈现的治疗模态组合)减少或废除感染mers的细胞的肺和/或肾细胞损伤。例如，考虑的药物包括kaletratm(洛匹那韦(lopinavir)/利托那韦的组合)或具有抗凋亡效应的其它药物，包括抗氧化剂、细胞周期抑制剂、bax抑制剂、胱天蛋白酶-3抑制剂、parp抑制剂、或gsk3β抑制剂。
在本发明构思的其它实施方式中，通过有效地减少fgf2、smad7、和/或fgf2上游序列的表达来降低与这些序列相关联的蛋白质的利用度，可以减少或消除与mers-cov感染相关联的肾病。在这样的实施方式中，对fgf2、smad7、或smad7上游序列的蛋白质产物具有亲和力的结合配偶体可以被用于与这样的蛋白质络合、使其失活、和/或降低其功能。合适的结合配偶体包括天然和/或合成抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、抗体片段、单链抗体、和/或适配体。
在本发明构思的其它实施方式中，可以使用与和fgf2、smad7、和/或位于fgf2上游的序列相关联的调控途径相互作用的化合物减轻与mers-cov感染相关联的肾病。例如，可以使用如下蛋白质、肽、和/或小分子：其阻断或干扰fgf2蛋白和/或smad7蛋白的受体的活性，并且随后导致下调相关基因(一种或多种)的转录。
在考虑这样的治疗模态中，应当领会存在可以施用这样的化合物的各种方式。可以使用多种途径施用根据本发明主题的组合物，包括口服地、肠胃外地、通过吸入、外用地、直肠地、鼻部地、或经由植入的贮器，其中如本文使用的术语“肠胃外的”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、鞘内、肝内、病灶内、和颅内施用(通常注射或输注)。优选地，组合物被口服、腹腔内、或静脉内施用。
例如，考虑的化合物的无菌可注射形式可以是水溶液或油性悬浮液。可以根据本领域已知的技术使用合适的分散或湿润剂和悬浮剂配制这些悬浮液。无菌可注射制剂也可以被制备为无毒性肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如1,3-丁二醇中的溶液。在其它可接受的媒介和溶剂之中，尤其考虑的液体包括水、林格氏溶液、和等渗的氯化钠溶液。此外，无菌的非挥发油可以被采用为共溶剂或悬浮介质(例如，天然的或合成的甘油单酯或甘油二酯)。也可以使用脂肪酸，并且合适的脂肪酸包括油酸和其甘油酯衍生物、橄榄油、蓖麻油，尤其是它们的聚氧化乙烯形式。这样的油溶液或悬浮液可以进一步包含长链醇稀释剂或分散剂。
在另一个实例中，考虑的化合物可以以任何口服可接受的剂型——包括胶囊、片剂、水性悬浮液、或溶液——被口服施用。在用于口服用途的片剂的情况下，所有药学上可接受的运载体(例如，乳糖、玉米淀粉等)被认为是合适的。类似地，可以添加多种润滑剂(例如，硬脂酸镁)。对于以胶囊形式口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当水性悬浮液需要用于口服用途时，活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要的话，还可以添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。
本发明构思的药物组合物也可以被外用施用，尤其是当治疗靶标包括通过外用应用容易接近的区域或器官，包括眼病、皮肤病、下消化道疾病，或在外科手术期间暴露的区域。本领域中存在众多已知的外用制剂，并且所有这样的制剂被认为适合本文的用途。
对于外用应用，可以以合适的药膏、霜剂、凝胶、和/或悬浮液——其包含在一种或多种运载体中悬浮或溶解的活性组分——配制考虑的组合物。用于外用施用本发明的化合物的运载体包括矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯化合物、乳化蜡和水。可选地，可以以合适的洗剂或霜剂——其包含在一种或多种药学上可接受的运载体中悬浮或溶解的活性组分——配制药物组合物。合适的运载体包括矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基月桂醇、苄醇和水。
根据本发明主题的药物组合物也可以通过鼻部喷雾或微粒吸入被施用。这样的组合物采用苄醇或其它合适的防腐剂、增强生物利用度的吸收促进剂、氟碳化合物、和/或其它常规的增溶剂或分散剂，根据药物配制领域熟知的技术被制备，并且可以被制备为干粉或盐水中的溶液。
关于考虑的化合物在组合物中的量，应当认识到具体的数量将通常取决于具体的制剂、活性成分、和期望的用途。因此，应当认识到考虑的化合物的量将显著地变化。然而，通常优选的是，化合物以有效地递送治疗效果和/或治疗效果在体外和/或体内可见的最小量存在。
因而，在最优选的实施方式中，考虑的化合物将以大约0.1ng/ml至大约100mg/ml之间的量，更通常地以大约10ng/ml至大约100mg/ml之间的量，和最通常地以大约1μg/ml至大约100μg/ml之间的量存在。在制剂是固体时，考虑的化合物将以大约0.1ng/g至大约100mg/g之间的量，更通常地以大约10ng/g至大约10mg/g之间的量，和最通常地以大约1μg/g至大约100μg/g之间的量存在。关于剂量单位，通常考虑的是，考虑的化合物以在体外和/或体内有效地实现期望的治疗效果的剂量被施用。
因此，考虑的化合物的合适的量将在0.1μg/剂量单位至大约0.5克/剂量单位的范围中，更通常地在10μg/剂量单位至大约0.05克/剂量单位之间，和最通常地在50μg/剂量单位至大约100mg/剂量单位之间。因而，合适的剂量将在大约0.01μg/kg和100mg/kg的范围中，更通常地在1μg/kg和50mg/kg之间，和最通常地在10μg/kg和10mg/kg之间。
实施例
病毒：sars-cov毒株hku39849和mers-cov分离株hcov-emc/2012由ronfouchier27提供。病毒在dulbecco改良的eagle培养基(dmem)——其补充有10％胎牛血清(fcs)和100单位/ml青霉素+100μg/ml链霉素(1％ps)——中的veroe6细胞(获得自atcc)中进行繁殖。所有研究根据生物安全级别3实践进行。
通过tcid50试验的病毒滴定：通过观察细胞病变效应(cpe)，测定veroe6细胞中的mers-cov和sars-cov的50％组织培养感染剂量(tcid50)/ml。简而言之，细胞以150μl的dmem中5×104个细胞/孔的密度被平板接种在96孔板中。病毒在dmem中从103至1014通过半对数被连续地稀释。每孔添加每次稀释的一百微升；并且连续5天每天观察板的cpe。
细胞培养：在补充有5％fcs和1％ps的dmem/f12培养基(获得自lifetechnologies)中培养hk-2细胞(获得自atcc)。在补充有10％fcs、1％ps、5μg/ml转铁蛋白和5μg/ml胰岛素的系膜细胞基础培养基(msbm)(获得自lonza)中培养正常人系膜细胞(nhmc)(获得自lonza)。所有使用nhmc的实验在它们的第十代内完成。
离体人肾和肺器官培养和感染：作为标准临床管理的一部分，在香港玛丽医院(queenmaryhospital)分别从经历肾切除术或肺切除术的患者获得新近手术切除的肾或肺样本。进行离体培养28。1mm宽小条的肾皮质和肺组织被直接地放置入37℃下的24孔板，其具有1ml的kaighn改良的ham’sf-12培养基(f-12k)和1％ps。组织在37℃下在以6logtcid50s/ml的病毒滴度下被感染mers-cov和sars-cov4小时。使用磷酸盐缓冲盐水(pbs)将未结合的病毒洗涤掉。在感染后0、18、48、72小时(hpi)收集组织，并且然后在10％多聚甲醛中进行固定用于免疫组织化学和电子显微术。
普通狨猴感染模型：在修改的情况下，如本发明人和其他人先前已经描述的进行实验25,26。简而言之，六只雄性普通狨猴(普通狨(callithrixjacchus)；3岁)被接种mers-cov，在每个鼻孔中鼻内接种100μl，口服接种500μl，气管内接种500μl，和在每只眼中接种50μl包含1×107tcid50的总剂量的mers-cov的dmem。六只普通狨猴的尸体剖检安排在感染后3天(dpi)。使用为普通狨猴准备的临床评分系统26，每天两次观察普通狨猴的疾病临床征兆并且评分。在开始实验之前基于评分表建立研究中安乐死标准，并且在35或以上的临床评分处指示安乐死。在1和3dpi，对麻醉的动物进行临床检查，拍摄x射线并且在具有50u/ml青霉素和50mg/ml链霉素的1mldmem中收集鼻部、口腔、和直肠拭子。在尸体剖检时收集所有肺叶、肾、心、肝、脾、脑、淋巴结、唾液腺、胰脏、肾上腺、膀胱和脾的样品。
这些研究的结果在图5中被显示。图5的上图显示了放射显影研究的结果，其展现了肺病理学在mers-cov感染之后的放射显影变化和照片。具体地，图5的上图描绘了在接种后3天来自接种mers-cov的普通狨猴的背-腹和胸外侧x射线。图5的下图描绘了来自在上图中显示的动物的尸体剖检的肺的肉眼病理学。对肺组织的与损伤相关联的改变是明显的。
免疫组织化学染色和电子显微术：感染的灵长类肾在10％多聚甲醛中固定并且冷冻切片。使用tbs4封闭安装的载玻片1小时。使用小鼠抗mers-covnp(1:200)在4℃下对mers-covnp染色过夜。还使用针对细胞类型特异性标志物突触足蛋白(获得自abcam)、cd31(获得自abcam)、细胞角蛋白18(获得自abcam)、smad7(获得自santacruz)、fgf2(获得自abcam)和胱天蛋白酶-3(获得自cellsignalingtechnology)的兔抗体。使用3×磷酸盐缓冲盐水(pbs)以及tween-20(pbst)将未结合的抗体洗涤掉。alexafluor488山羊抗小鼠igg(h+l)抗体(1:500)(lifetechnologies)和alexafluor594山羊抗兔igg(1:500)(获得自lifetechnologies)然后被应用于载玻片以便进行信号检测，接着使用3×pbst洗涤。在存在防褪色封固剂(获得自dako)和1μg/mldapi(获得自sigma)的情况下，染色的载玻片然后安装有盖玻片。人肾组织被包埋在tissue-tekoct化合物(获得自milesinc.,elkhart,in)中，在切片前急冻并且在-80℃下储存。5-10μm厚的切片在低温恒温器上被切割，并且被转移至使用聚赖氨酸(获得自sigma-aldrich)预涂覆的玻璃显微镜载玻片。然后使用冷丙酮在室温下固定切片20分钟。如上面描述的，在封闭和使用抗mers-covnp染色前，使用pbs洗涤固定的切片三次。使用具有spotrt3照相机的nikoneclipseni-u获取数字图像。为了制备用于电子显微术检查的样品，多聚甲醛固定的组织在4℃下使用0.1m二甲胂酸钠中的0.5％四氧化锇/0.8％铁氰化钾后固定30分钟，使用1％丹宁酸后固定1小时，并且使用1％醋酸双氧铀后固定过夜。在渗透和在
定量实时pcr(qpcr)：使用
高通量测序：通过使用truseqstrandedmrnasampleprep
凋亡试验：胱天蛋白酶-3/cpp32荧光试验试剂盒(获得自biovision)被用于测量胱天蛋白酶-3活性。简而言之，细胞被平板接种在六孔盘中，培养，收集，并且在0、8、48和72hpi下在溶胞缓冲剂中被裂解。在蛋白质浓度通过bradford蛋白质试验被归一化后，使用相同量的反应缓冲剂和50mmol/l的devd-afc底物在37℃下培育溶胞产物2小时。使用400nm的激发波长和505nm的发射波长监测荧光。
除那些已经描述的之外，本领域技术人员应当明白更多修改是可能的，而不背离本文的本发明构思。因此，除所附权利要求的精神以外，本发明主题不被限制。而且，在解释说明书和权利要求书二者时，应当以与上下文一致的最宽的可能方式解释所有术语。具体而言，术语“包括”和“包含”应当被解释为以非排他性方式引用要素、组分、或步骤，这指示引用的要素、组分、或步骤可以存在，或被利用，或与未明确引用的其它要素、组分、或步骤组合。在说明书或权利要求书指的是选自a、b、c….和n的一些中的至少一种时，文本应当被解释为需要来自上述中的仅一个要素，而非a加n，或b加n等。
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序列表
<110>emv梅斯有限公司
<120>诊断和治疗mers相关肾病
<130>102996.0002pct
<160>10
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>25
<212>dna
<213>智人
<220>
<221>引物
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<220>
<223>靶向smad7的修饰的反义寡核苷酸:n=
5-甲基-脱氧胞嘧啶并且核苷酸间键被修饰为o,o-连接硫代磷酸酯
<220>
<221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域;新的或少见的特征
<222>(3)..(3)
<223>n是a、c、g、或t
<220>
<221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域;新的或少见的特征
<222>(16)..(16)
<223>n是a、c、g、或t
<400>10
gtngccccttctcccngcag20