本发明涉及发酵饮料的酵母菌株以及选择所述菌株的方法。本发明还涉及来自这些菌株的酵母用于生产葡萄酒的用途。
背景技术：
：发酵是葡萄酒生产中的必要步骤之一，期间葡萄汁中存在的糖经由微生物例如酵母的作用转化成酒精。基于生产的葡萄酒的类型使用不同的酵母菌株。来自申请人的酵母s1酵母菌株能够规律地发酵，但非常缓慢：因此，该菌株尤其适用于长时间浸渍/提取过程所产生的优质红葡萄酒，以从高色度和非常单宁的黑葡萄品种中的高水平多酚(花青素、单宁)受益。不幸地，在葡萄汁中正常或甚至大量有效氮的存在下，该菌株难以发酵酒精含量大于14％v/v的葡萄汁。这些条件对意欲作为陈葡萄酒的红葡萄酒而言很常见，因为红葡萄酒本来就具有很高的酒精含量，且来自产生缺乏有效氮的葡萄汁的过熟的葡萄。因此，在这些情况下，发酵过早停止存在高风险，这对葡萄酒生产是有害的。因此，开发能够改进酵母菌株s1的发酵能力的手段，从而使其在酿造中更令人感兴趣是特别有利的。可以通过使用常规的遗传技术或通过使用分子遗传技术来改进酵母。然而，酿酒市场非常拒绝使用遗传改造的微生物(gmo)。发明简述因此，发明人确定，通过将菌株s1与能够在少量氮存在下且在低温下快速发酵大量糖的酵母菌株杂交，可以获得在酿造具有高单宁水平的黑葡萄中特别令人感兴趣的菌株。贝酵母(saccharomycesbayanus)种的s2酵母菌株属于本申请人。借助于该杂交方法，发明人制备并选择了若干菌株，其呈现非常好的发酵动力学、对大于15％v/v的酒精强度的耐性，以及在少量有效氮存在下的发酵能力。这些菌株在需要长时间发酵的有效氮含量低的葡萄汁的酿造中特别令人感兴趣，称为“陈”葡萄酒(例如波尔多的年份佳酿)的葡萄酒就是这种情况。因此，根据第一个方面，本发明涉及可以通过将菌株s1与菌株s2杂交获得的酵母菌株，根据以下定义的测试a，所述酵母菌株呈现以下特征：-在24℃的温度下从15天至22天的发酵动力学；和-对大于或等于15％v/v的酒精强度的耐性；和-氮需求小于或等于200ppm。发明人还开发了允许从菌株s1与菌株s2的杂交获得并选择葡萄酒酵母菌株的方法。因此，根据另一个方面，本发明涉及获得葡萄酒酵母菌株的方法，所述方法包含以下步骤：a)将酵母菌株s1与酵母菌株s2杂交；b)分离步骤a)获得的菌株；c)在葡萄汁上接种步骤b)分离的菌株；d)研究所述菌株的发酵动力学；和e)选择在步骤c)的相同葡萄汁上的发酵动力学比亲本菌株s1高至少15％，优选至少30％，更优选至少40％且比亲本菌株s2低至少15％，优选至少30％，更优选至少40％的菌株。本发明还涉及如上所述的酵母菌株用于生产发酵饮料，更特别是葡萄酒的用途。发明详述为改进酵母菌株s1的葡萄酒生长能力，尤其是它的发酵能力，发明人开发了特别适用于葡萄酒生长用途的新菌株。在本文中，“改进的发酵特征”理解为是指具有菌株s1提供的优势的酵母菌株，尤其是以中等且规律的速度发酵葡萄汁的能力，没有分析上的缺点例如平均挥发酸产量和低so2产量，且具有令人感兴趣的感官特征例如多酚提取增强和水果香味提升，但它也可以长时间地(甚至当葡萄汁的酒精强度大于15％v/v时)快速发酵，可能是在中等含量的有效氮存在下。因此，保留的选择标准如下：-发酵动力学比亲本菌株s1高，但与亲本菌株s1同样规律；和-在中等含量的有效氮存在下发酵的能力；和-对高酒精强度(即，等于或大于15％)的耐性。因此，本发明的第一个方面涉及可能通过将菌株s1与菌株s2杂交获得的酵母菌株，根据测试a，所述酵母菌株呈现以下特征：i)在24℃的温度下从15天至22天的发酵动力学；和ii)对大于或等于15％v/v的酒精强度的耐性；和iii)氮需求小于或等于200ppm。根据本发明的“测试a”是追踪酵母菌株的发酵活性的测试：通过在24℃的恒定温度下发酵以2.106cfu/ml的含量接种至国际葡萄和葡萄酒组织[oiv](oiv-oenoresolution370-2012)标准化的合成葡萄汁，所述合成葡萄汁调节为250g/l的可发酵糖(以获得15％v/v的酒精含量)，其中初始氮浓度为200ppm。表述“酵母菌株”是指相对均匀的酵母细胞群。酵母菌株获得自菌落，菌落是从单个酵母细胞获得的细胞群。“葡萄酒酵母菌株”理解为是指用于发酵葡萄酒的菌株。酵母菌株s1或菌株s1是指申请人以保藏号i-5011于2015年9月9日保藏于国家微生物培养物中心(cncm)–institutpasteur,25ruedudocteurrouxf75724paris的酵母菌株。酵母菌株s2或菌株s2是指申请人以保藏号i-5012于2015年9月9日保藏于cncm的酵母菌株。“对等于或大于x％v/v的酒精强度的耐性”是指当培养基的酒精强度按体积计大于或等于x％v/v时，酵母菌株能够存活并持续发酵。酵母菌株的“氮需求”定义为葡萄汁中必须存在的有效氮的最小量，从而所述菌株能够在给定葡萄汁上完成发酵(存在至少2g/l的残余可发酵糖)。发酵动力学可以通过本领域技术人员已知的各种技术容易地测量。例如，发酵动力学可以通过随时间称重的方式，通过追踪发酵来测量。本发明特别涉及如上所述的两个新酵母菌株：根据布达佩斯条约，分别以保藏号i-4975和i-4977于2015年5月5日保藏于cncm的菌株51-062和51-135。本发明还涉及从如上所述的酵母菌株分离的酵母。发明人还开发了将菌株s1与贝酵母s2菌株杂交的方法，所述s2菌株能够在少量氮存在下，在低温下快速发酵大量糖。之后，他们开发了能够从该杂交获得的各种菌株中鉴定呈现改进的发酵特征，从而在酿造中令人感兴趣的菌株的选择方法。因此，在另一个方面，本发明涉及获得葡萄酒酵母菌株的方法，所述方法包括以下步骤：a)将酵母菌株s1与酵母菌株s2杂交；b)分离步骤a)获得的菌株；c)在葡萄汁上接种步骤b)分离的菌株；d)研究所述菌株的发酵动力学；和e)选择在步骤c)的相同葡萄汁上的发酵动力学比亲本菌株s1高至少15％，优选至少30％，更优选至少40％且比亲本菌株s2低至少15％，优选至少30％，更优选至少40％的菌株。本领域技术人员已知将酵母菌株进行杂交的数种方法，且能够使用合适的方法来杂交酵母菌株s1和酵母菌株s2。在本发明中，发明人发现，菌株s1不能产生分化的有性类型的孢子a或α，因此该菌株是同宗配合的。因此，将菌株s1与菌株s2杂交的一种方式在于从各菌株剥离四分体后，将来自这两个菌株的孢子杂交。因此，新杂交种可以是来自s1的孢子和来自s2的孢子之间杂交的结果，而不是孢子s1和其中有性类型在繁殖期间改变的来自s1的孢子之间杂交的结果。随后，通过分析新杂交种的遗传谱(例如通过pcrty)并将这些谱与亲本菌株的遗传谱比较，选择从来自s1的孢子和来自s2的孢子之间的杂交获得的杂交种。在本文中，“葡萄汁(must)”理解为是指葡萄汁(grapemust)，即压榨葡萄后获得的混合物或合成葡萄汁，即合成重构以最佳模拟天然葡萄汁的组成。数种葡萄汁可用于本发明的目的。举例而言，可以引用合成的“lesaffre葡萄酒”葡萄汁以预选择酵母，国际葡萄和葡萄酒组织[oiv](oiv-oenoresolution370-2012)标准化的合成葡萄汁以选择多酚含量高且可以通过或不通过热预发酵浸渍获得的来自黑葡萄品种的酵母或葡萄汁，从而将酵母置于旨在优化它们的选择的环境下。在一个实施方案中，发酵测试在合成的oiv葡萄汁上进行。“合成的oiv葡萄汁”是葡萄和葡萄酒组织[oiv](oiv-oenoresolution370-2012)标准化的合成葡萄汁，其调节为250g/l可发酵糖(以获得15％v/v的酒精含量)，其中初始氮浓度为200ppm。因此，根据另一个方面，本发明涉及获得葡萄酒酵母菌株的方法，所述方法包括以下步骤：a)将酵母菌株s1与酵母菌株s2杂交；b)分离步骤a)获得的菌株；c)在合成的oiv葡萄汁上接种步骤b)分离的菌株；d)研究所述菌株的发酵动力学；和e)选择呈现以下三个特征的菌株：i)在24℃的温度下从15-22天的发酵动力学；和ii)对大于或等于15％v/v的酒精强度的耐性；和iii)氮需求小于或等于200ppm。由此选择的酵母能够通过使用少量的氮发酵大量糖，甚至在高酒精强度下。此外，根据另一个方面，本发明涉及如上所述的酵母菌株或酵母用于生产葡萄酒，尤其是红葡萄酒，更尤其是来自非常单宁的黑葡萄品种的葡萄酒的用途。在另一个实施方案中，根据本发明获得/选择的酵母菌株和酵母用于发酵称为“陈”葡萄酒的红葡萄酒。“陈葡萄酒”是一种可以在地窖储存数年并且随着年份而改善的葡萄酒；波尔多的年份佳酿就是如此。陈葡萄酒可以在地窖里储存至少五年。附图说明图1是表示菌株51-062(h)、51-135(f)、s1(d)和s2(e)的发酵动力学的图，所述发酵动力学通过测量重量/初始重量比随时间的变化来表示。具体实施方式实施例1：菌株s1与来自s2的那些的杂交-两个亲本菌株的产孢和开发产孢菌株s1的操作条件产孢条件应用于s2和s1菌株两者。计算产孢速率并示于表1。菌株％子囊孢子葡萄酒菌株s213％葡萄酒菌株s154％表1-通过微操纵分离孢子并研究从菌株s2和s1分离的孢子的自二倍体化。在两个葡萄酒菌株上大规模应用产孢条件。处理asci并通过显微镜观察四分体后，进行由以下组成的剥离：打破四分体，移出孢子，并将其放置于琼脂上的精确位置。放置的孢子和萌发的孢子的计数如下表2所示。表2为了能够杂交菌株s2和s1，必须获得各菌株的明显分化的有性类型的孢子a或α。通过pcr“交配型”研究之前获得的各个孢子的有性标志(表3)。菌株萌发的孢子数标志a标志α标志a/α无结果s239201441s19500950表3表3表明不能从菌株s1获得分化的有性类型孢子a或α。因此，似乎菌株s1是同宗配合的。在这些条件下，考虑菌株s2和s1之间的常规杂交方案是不可能的。-开发s1xs2杂交特异性的杂交操作条件，分离新菌株并研究它们的遗传谱以选择从s1和s2之间的杂交获得的杂交种。在没有收集到可利用的菌株s1的有性类型的a或α孢子的情况下，发明人在经由微操纵器从各菌株剥离四分体后具有了来自s1和s2的杂交孢子。因此，新杂交种可以是来自s1的孢子和来自s2的孢子之间杂交的结果，而不是来自s1的孢子和其中有性类型在繁殖期间改变的来自s1的孢子之间杂交的结果。为了选择从来自s1的孢子和来自s2的孢子之间的杂交获得的杂交种，通过pcrty分析新杂交种的遗传谱，并将这些谱与亲本菌株的进行比较。最后，保留68个杂交种，其显示相对于亲本菌株谱而言不同强度的混合谱。然后评估者68个菌株的酿酒品质。如下选择菌株51-062和51-135。实施例2：开发杂交种选择技术使用了几种选择技术：a)合成条件下的选择：通过在合成的lesaffre葡萄汁(250g/l的糖和250ppm的有效氮)上研究杂交种和亲本菌株的可发酵糖水解、发酵动力学和目标发酵化合物的产生＝测试a和合成的oiv葡萄汁。在动力学标准上进行的第一次选择允许选择了在果糖脱水方面显示比s1更好的性质的11个杂交种。在这些杂交种中，选择了菌株51-026和51-135，因为它们显示s1和s2之间的平均动力学，并且在发酵结束时，这些菌株产生与两个亲本菌株不同的中间发酵化合物。b)真实条件下的选择：通过在天然葡萄汁上研究杂交种和亲本菌株的发酵动力学和酯的产生。选择标准是在天然cabernetsauvignon葡萄汁上的微酿造期间，分析发酵动力学、控制酿酒参数和主要的酯分析。该葡萄汁是通过将非常成熟的cabernetsauvignon葡萄进行热预发酵浸渍获得的。来自今年收获的葡萄汁在冷藏库里储存于-60℃。发酵前，以下列方式加工葡萄汁：1)室温下解冻，2)通过离心分离澄清，3)将葡萄汁分成5个均匀的批次。发酵前，通过傅立叶变换红外光谱法+比色法so2测定分析葡萄汁。所得结果总结于下表4。表4葡萄汁分析后，还观察到发酵前不含酒精和醋酸。246g的葡萄糖+果糖相当于14.6％体积的可能强度(产量为16.83)。-在琼脂管上制备酵母：菌株51-135(f)和51-062(h)制备第0天的待孵育的培养基：酵母提取物20g、蔗糖100g、矿物质溶液(100gmgso4+100gkh2po4+软化水qs1l)10ml、自来水qs1l。第3天-接种测试管“a”(对于测试的各菌株)：将单糖从琼脂中除去并置于10ml培养基中，在26℃下孵育24小时。第4天-制备测试管“b”：1ml来自试管a加上9ml培养基，在26℃下孵育24小时。第5天-将各管“b”倒入90ml培养基，充分搅拌下在26℃孵育16小时±2小时。第6天：用thoma细胞测量群体。接种罐(表5)：表5罐中制剂的对照(表6)：制剂酵母/大方形细胞群/lf(菌株51-135)132.109h(菌株51-062)163.109表6-制备干酵母：菌株d(菌株s1)和e(菌株s2)：第6天：在无菌水中水化酵母：1g置于10ml中，然后超声搅拌10分钟，30℃孵育20分钟，超声搅拌15分钟，室温下放置20分钟。在1l葡萄汁中以2ml制剂接种罐。用thoma细胞验证群体：1010个细胞/l(表7)：制剂酵母/大方形细胞群/ld(菌株s1)356.109d(菌株s2)345.109-发酵分析发酵过程在温度为18℃的气候控制室内进行。通过在±0.1g的刻度上将罐称重来分析发酵动力学，每天约2次。发酵在第7天开始，在第19天停止。结果如图1所示。发酵结束时：榨取并以约60mg/l硫磺处理，装瓶并储存于8℃.-分析所得葡萄酒在第20天，通过傅立叶变换红外光谱法+比色法so2测定分析：表8取决于酵母菌株，观察到以下：-按体积计的总酒精强度差异为0.5％体积。-19天后，所有菌株存在残留的糖。-总酸在4.69-5.12geqh2so4/l变化。-挥发性酸在0.48-0.71geqh2so4/l变化。-苹果乳酸发酵没有开始。多酚颜色分析(表9)：颜色强度比色(shade)do280d13.80.5854e17.90.6759f13.50.6156h14.80.6055酯分析-总结：总之，我们没有观察到干酵母d产生的结果和琼脂管酵母产生的结果之间的显著差异。证实杂交种具有比s1更快的动力学，但形成2个组：-与s2和s1相比，51-135显示中等发酵动力学，糖的残留含量和总so2(高，因此是负的)以及对颜色的影响接近s2，酯的产量略高于但接近亲本酵母。-51-062显示比s2更快的动力学但斜率相等，残留糖含量、挥发性酸和so2低于s2，酯产量高于亲本菌株。该酵母似乎不符合动力学标准，但呈现非常令人感兴趣的特征，应当进行进一步的研究。pct/ro/134表当前第1页12