本发明涉及用于制备合成的拖丝蜘蛛丝(draglinespidersilk)的包含源自masp(大壶状腺丝蛋白(majorampullatespidroin))蛋白的蛋白质混合物的组合物。
发明背景
拖丝蜘蛛丝在本领域中被称为由织网蜘蛛(orb-webweavingspider)在它们跌落或逃离危险时构建它们的网的框架和幅射线以及生命线所使用的丝。为了能够完成这些任务，由于高弹性和强度的组合，拖丝纤维(draglinefiber)显示出非常高的韧性，这使其成为最坚韧的纤维，无论是天然的还是人造的。例如，拖丝的直径比高强度钢强6倍，比凯夫拉(kevlar)——其是曾经制备的最强的合成纤维之一——坚韧3倍。
拖丝由两种主要多肽组成，通常被称为大壶状腺丝蛋白(masp)1和2，在十字园蛛(araneusdiadematus)中也被称为adf-3和adf-4。这些蛋白质的表观分子量在200-720kda范围内，这取决于样品的年龄和分析条件。已知的拖丝蛛丝蛋白由交替的富含丙氨酸的片段——在纤维中形成结晶的β-片层——和富含甘氨酸的片段——其更具柔性并且主要缺乏有序结构——的高度重复的区段组成。c-端区域不重复，在物种之间高度保守，并且采用α-螺旋构象。拖丝蛋白的n-端区域也被发现在不同的蛛丝蛋白之间以及不同的蜘蛛物种之间高度保守。
已经进行了许多尝试来合成地产生蜘蛛丝，如通过在组织培养中使用细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞以及甚至转基因山羊进行基因工程。
美国专利号8,461,301尤其涉及包含半合成蜘蛛丝蛋白结构域或其任何功能同系物、变体、衍生物、片段或突变体的多个重复的分离的氨基酸序列。该出版物通过引用以其全部并入本文。
有关拖丝蜘蛛丝的其他出版物包括但不限于ittah,s.,etal.biopolymers,93(5),458-468,2010；ittah,s.,etal.biomacromolecules,8(9),2768-2773,2007；ittah,s.,etal.,biomacromolecules,7(6),1790-1795,2006；和huemmerich,d.,ittah,s.,etal.,currentbiology,14,2070-2074,2004。这些出版物通过引用以其全部并入本文。
对用于生产具有类似于天然蜘蛛丝机械性能的纤维的改进组合物和方法存在未满足的需求。
技术实现要素：
本发明涉及包含具有不同分子量并源自masp蛋白的蛋白质混合物的组合物，诸如用于制造合成的拖丝蜘蛛丝。
根据一些方面，提供了一种组合物，其包含含有m种类型的不同分子量的蛋白质的蛋白质混合物，其中所述混合物中的每种蛋白质独立地包含n个重复的源自masp蛋白的重复区、或其功能同系物、变体、衍生物或片段，其中m和n独立地为2-70之间的整数。
在一些实施方式中，所述masp蛋白是选自masp-1、masp-2、adf-4和adf-3的蛋白质。在一些实施方式中，所述masp蛋白是选自masp-1和adf-4的蛋白质。
在一些实施方式中，所述n对于所述混合物中的每种类型的蛋白质是相同的。在另一个实施方式中，n是等于4和32或在4和32之间的整数。在另一个实施方式中，m是等于4和32或在4和32之间的整数。在另一个实施方式中，'n'与'm'的比在2：1至1：2的范围内。在另一个实施方式中，'n'和'm'是相等的。
在另一个实施方式中，每个重复具有2kda至3.5kda范围内的分子量。在另一个实施方式中，每个重复序列具有2.6kda至3kda范围内的分子量。
在另一个实施方式中，组合物包含分子量增量为2kda至3.5kda的所述混合物的两种或更多种蛋白质。在另一个实施方式中，组合物包含分子量增量为2.6kda至3kda的所述混合物的两种或更多种蛋白质。
在一些实施方式中，所述重复具有masp蛋白或其片段的重复区的同系物、变体、衍生物。在一些实施方式中，所述重复具有masp1蛋白或其片段的重复区的同系物、变体、衍生物。在一些实施方式中，所述重复具有adf-4蛋白或其片段的重复区的同系物、变体、衍生物。
在一些实施方式中，所述重复区具有第一部分和与其邻接的第二部分，第一部分是包含至少50％丙氨酸残基的5-30个氨基酸的氨基酸序列，第二部分是包含至少80％选自甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸和酪氨酸的残基的20-60个氨基酸的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述重复区的第二部分包含至多两个谷氨酰胺残基。
在一些实施方式中，所述重复区具有如seqidno：1所示的氨基酸序列：
(x1)zx2gpggygpx3x4x5gpx6gx7ggx8gpggpgx9x10
其中x1独立地在每种情况下为a或g，其中至少50％的(x1)z为a，z为5至30之间的整数；x2为s或g；x3为g或e；x4为g、s或n；x5为q或y；x6为g或s；x7为p或r；x8为y或q；x9为g或s；并且x10为s或g。
在一些实施方式中，所述重复区包含如seqidno：33所示的氨基酸序列：
(x1)zx2sgpx3ggygx4px5qgpx6ggygp
其中x1独立地在每种情况下为a或g，其中至少50％的(x1)z为a，z为5至30之间的整数；x2为s-g或不存在；x3为g-q或不存在；x4为g或不存在；x5为s或g；x6为s-p、g-r或不存在。
在另一个实施方式中，所述重复区包含如seqidno：34(pggygp)所示的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，所述重复区具有如seqidno：2-4中任一个所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述同系物与seqidno：1-3中的任一个共享至少70％的同源性。
在另一个实施方式中，所述重复区具有如seqidno：2-4和35-44中任一个所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述同系物与seqidno：1-3、33和35-44中的任一个共享至少70％的同源性。
在另一个实施方式中，所述重复区包含如seqidno：2(sgpggygpgsqgpsgpggygpggpgss)所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述重复区包含如seqidno：3(aaaaaaaasgpggygpgsqgpsgpggygpggpgss)所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述重复区包含如seqidno：35(sgpggygpgsqgpsgpggygpggpgssagagagaaa)所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述重复区包含如seqidno：36(sgpggygpgsqgpsgpggygpggpgssagagagaga)所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述重复区包含seqidno：35(sgpggygpgsqgpsgpggygpggpgssagagagaaa)和seqidno：36(sgpggygpgsqgpsgpggygpggpgssagagagaga)之间1:2-1:16、1:2-1:8或1:4的比。
在另一个实施方式中，所述重复区包含如seqidno：37(sgsgpggygpggqgpggygpggqgpygpg)所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述重复区包含如seqidno：38(sgsgpggygpggqgpggygpggqgpygpgaaaaaaa)所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述重复区包含如seqidno：39(ggsgpggygpggqgpggygpggqgpygpg)所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述重复区包含如seqidno：40(ggsgpggygpggqgpggygpggqgpygpgaaaaaaa)所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述重复区包含seqidno：38(sgsgpggygpggqgpggygpggqgpygpgaaaaaaa)和seqidno：40(ggsgpggygpggqgpggygpggqgpygpgaaaaaaa)之间1:2-1:16、1:2-1:8或1:4的比。
在另一个实施方式中，所述重复区包含如seqidno：41(sgpgqggyggpggqgpgrggygpgags)所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述重复区包含如seqidno：42(sgpgqggyggpggqgpgrggygpgagsaaaaaaaaa)所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述重复区包含如seqidno：43(ggpgqggyggpggqgpgrggygpgags)所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述重复区包含如seqidno：44(ggpgqggyggpggqgpgrggygpgagsaaaaaaaaa)所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述重复区包含seqidno：42(sgpgqggyggpggqgpgrggygpgagsaaaaaaaaa)和seqidno：44(ggpgqggyggpggqgpgrggygpgagsaaaaaaaaa)之间1:2-1:16、1:2-1:8或1:4的比。
在另一个实施方式中，所述重复区包含如seqidno：4(aaaaaaaasgpggygpenqgpsgpggygpggpgss)所示的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，所述混合物的每种蛋白质还包含选自seqidno：5(msyyhhhhhhdydipttenlyfqgamdpefkglrrraqlv)；seqidno：6(msyyhhhhhhdydipttenlyfqgamdpefkglrrraqlvrplsnldna)；seqidno：7(msyyhhhhhhdydipttenlyfqgamdpefkglrrraqlvdppgcrnsaragss)的单个n-端区域、或其任何功能同系物、变体、衍生物或片段。在另一个实施方式中，所述n-端区域的所述同系物与seqidno：5-7中的任一个共享至少70％的同源性。
在另一个实施方式中，所述混合物的每种蛋白质还包含具有如seqidno：9(gpsgpgaygpspsasasvaasrlsspaassrvssavsslvssgptngaavsgalnslvsqisasnpglsgcdalvqallelvsalvailssasigqvnvssvsqstqmisqals)所示的氨基酸序列的单个c-端区域、或其任何功能同系物、变体、衍生物、片段或突变体。在另一个实施方式中，所述c-端区域的所述同系物与seqidno：9共享至少70％的同源性。
在一些实施方式中，所述混合物的一种或多种蛋白质还包含至少一个标签序列。
在一些实施方式中，所述蛋白质混合物还包含adf-3或masp-2蛋白或其功能同系物、变体、衍生物或片段。在一些实施方式中，所述adf-3或masp-2蛋白构成所述蛋白质混合物的分子量的约1-50％，或其间的任何整数。在一个实施方式中，所述adf-3蛋白具有genbank登录号aac47010.1。
在一些实施方式中，组合物还包含载体、稀释剂或赋形剂。
根据一些方面，本发明提供了编码本发明所述蛋白质混合物的两种或更多种蛋白质的分离的核酸序列。根据一些方面，本发明提供了包含本发明的核酸序列的表达载体，其中所述核酸序列处于可操作地连接的启动子和任选地调节序列的表达控制下。根据一些方面，本发明提供了用本发明的表达载体转化的宿主细胞。
根据一些方面，本发明提供了包含本发明的组合物的纤维。根据一些方面，本发明提供了包含本发明的组合物和/或纤维的物品。
根据下文给出的详细描述，本发明的进一步实施方式和全部适用范围将变得明显。然而，应该理解的是，尽管指出了本发明的优选实施方式，但是详细描述和具体实施例仅仅是以示例的方式给出的，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将变得明显。
附图说明
图1a-i使用immuno-tem(透射电子显微镜)表征(图1a-c)，采用三种不同的构建体：c1、c2和c3(分别是图1d-f)的组装纤维的光学显微镜检查和共聚焦显微镜检查(图1g-i)描绘了本发明的纳米纤维。
图2a-c示出了使用考马斯蓝染色和蛋白质印迹分析的蛋白质重复单元的梯状图案(ladderingpattern)。
图3a-b是电纺纤维(electrospunfiber)的高分辨率扫描电子显微镜检查(hr-sem)(3a)和差示扫描量热法(dsc)(3b)。
图4a-b显示了嵌入透明基质(4a)中的冻干纤维和相应的dsc曲线(4b)。
图5a-c显示了本发明纤维上的多层hek293细胞生长。
图6显示了描绘本发明的纤维指纹的dsc曲线。
具体实施方式
在一些实施方式中，本发明提供包含具有不同分子量的蛋白质的混合物的组合物、编码其的核酸序列、表达载体和细胞，其可用于制备合成的拖丝蜘蛛丝。本发明还提供了包含所述组合物的物品和纤维。
本发明部分基于意想不到的发现，即使用不同分子量并源自masp蛋白的蛋白质混合物合成的人造拖丝蜘蛛丝具有异常的机械性能——其类似于并且在一些性能上优于天然拖丝蜘蛛丝。
如下文所显示的，本发明的人造拖丝蜘蛛丝显示出意想不到的热性质(参见图6)。具体而言，本发明的纤维在约265℃至320±5℃显示dsc峰，表明相对于天然拖丝蜘蛛丝有利的热性质。
根据一些方面，提供了包含含有m种类型的不同分子量蛋白质的蛋白质混合物的组合物，其中所述混合物中的每种蛋白质独立地包含n个重复的masp蛋白的重复区或其功能同系物、变体、衍生物或片段，其中m和n独立地为2至70之间的整数。
如本文所用，术语“蛋白质的混合物”或“蛋白质混合物”是指多种蛋白质，如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10种类型的蛋白质，其中每种类型的蛋白质具有相对独特的和均匀的分子量。如本文所用，术语“独特的”是指所述蛋白质混合物中的每种类型的蛋白质的分子量与所述混合物中的其他类型的蛋白质不同。如本文所用，术语“均匀的”是指所述蛋白质混合物中每种类型的蛋白质的分子量与所述混合物中相同类型的蛋白质至少95％相同。如本文所用，术语“相对”是指每种类型的蛋白质中不超过一个氨基酸残基的变异。
术语“大壶状腺丝蛋白”和“蛛丝蛋白”在整个说明书中可互换使用，并且包括所有已知的大壶状腺丝蛋白，在十字园蛛的情况下通常缩写为“masp”或“adf”。这些大壶状腺丝蛋白通常有两种类型，1和2。这些术语还包括如本文所公开的非天然蛋白质，其与至少已知的大壶状腺丝蛋白的重复区具有高度同一性和/或相似性。其他合适的蜘蛛丝蛋白包括masp2、misp、misp2、acsp、flys、flas、和梨形(piriform)。
如本文所用，术语“重复区”、“重复序列”或“重复”是指源自在蜘蛛丝氨基酸序列中(例如，在masp-1肽中)自然地发生多次的重复单元的重组蛋白质序列。本领域技术人员将会理解，蜘蛛丝蛋白的一级结构被认为主要由一系列单元重复的小的变异组成。在天然存在的蛋白质中的单元重复通常彼此不同。也就是说，沿着蛋白质长度很少或没有单元重复的确切重复。
在一些实施方式中，制备本发明的合成蜘蛛丝，其中蛋白质的一级结构包含许多单一单元重复或直接重复的确切重复。本文使用的术语“直接重复”是具有类似重复的串联重复(头对尾排列)。在另一个实施方式中，用于形成本发明的合成蜘蛛丝的所述重复是直接重复。在一些实施方式中，所述重复在自然界中未发现(即，不是天然存在的氨基酸序列)。在一些实施方式中，所述单一单元重复(或可选地，直接重复)在其氨基酸序列内包含不多于一个变异。
在另外的实施方式中，本发明的合成蜘蛛丝包含多个一个单元重复的重复以及多个第二个单元重复的重复。这样的结构将类似于典型的嵌段共聚物。几个不同序列的单元重复也可以组合以提供具有适用于特定应用的性质的合成蜘蛛丝蛋白。
包含重复序列的示例性序列是adf-4：aaaaaaasgsggygpenqgpsgpvaygpggpvssaaaaaaagsgpggygpenqgpsgpggygpggsgssaaaaaaaasgpggygpgsqgpsgpggsggygpgsqgpsgpgassaaaaaaaasgpggygpgsqgpsgpgaygpggpgssaaasgpggygpgsqgpsgpggsggygpgsqgpsgpggpgasaaaaaaaaasgpggygpgsqgpsgpgaygpggpgssaaasgpggygpgsqgpsgpgaygpggpgssaaaaaaagsgpggygpgnqgpsgpggygpggpgssaaaaaaasgpggygpgsqgpsgpgvygpggpgssaaaaaaagsgpggygpgnqgpsgpggygpggsgssaaaaaaaasgpggygpgsqgpsgpggsggygpgsqgpsgpgassaaaaaaaasgpggygpgsqgpsgpgaygpggpgssaaasgpggygpgsqgpsgpgaygpggpgssaaaaaaasgpggygpgsqgpsgpggsrgygpgsqgpggpgasaaaaaaaaasgpggygpgsqgpsgpgyqgpsgpgaygpspsasas(seqidno：10)。
在一些实施方式中，本发明的合成重复序列基于(例如，如下文所定义具有高百分比同一性)源自adf-4(seqidno：10)的一个或多个重复序列。在一些实施方式中，本发明的合成重复序列基于(例如，具有高百分比同一性)源自seqidno：18-32中任一个的一个或多个重复序列。如本文所用，术语“基于”是指与重复序列具有高百分比的同源性的序列。如本文所用，高百分比的同源性包括以下任何一种：在adf-4序列的特定区域上至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或99％的同一性。
在一些实施方式中，每个重复序列包含多达60个氨基酸、多达55个氨基酸、多达50个氨基酸、多达49个氨基酸、多达48个氨基酸、多达47个氨基酸、多达46个氨基酸、多达45个氨基酸、多达44个氨基酸、多达43个氨基酸、多达42个氨基酸、多达41个氨基酸、多达40个氨基酸、多达39个氨基酸、多达38个氨基酸、多达37个氨基酸、多达36个氨基酸或多达35个氨基酸，其中可能性表示本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，每个重复序列包含5至60个氨基酸、10至55个氨基酸、15至50个氨基酸、20至45个氨基酸、25至40个氨基酸、25至39个氨基酸或28至36个氨基酸，其中可能性表示本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，每个重复序列包含30至40个氨基酸、31至39个氨基酸、32至38个氨基酸、33至37个氨基酸、34至36个氨基酸，其中可能性表示本发明的单独实施方式。在另外的实施方式中，每个重复序列包含35个氨基酸。
在一些实施方式中，n是等于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69和70中任一个的整数。
在一些实施方式中，m是等于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69和70中任一个的整数。
在另一个实施方式中，'n'与'm'的比在2：1至1：2的范围内。在另一个实施例中，'n'和'm'是相等的。
在一些实施方式中，所述'n'对于所述混合物中的每种类型的蛋白质是相同的。如本文所用，术语“n对于所述混合物中的每种类型的蛋白质是相同的”涉及对于每种类型的蛋白质即对于具有相同分子量的一种或多种蛋白质的重复序列的数目。作为非限制性实例，对于具有不同分子量的16种类型蛋白质的蛋白质混合物，每组蛋白质具有不同数量的重复序列。
在一些实施方式中，所述混合物的各种蛋白质组在每种类型的蛋白质的重复序列数与所述组的摩尔比之间具有反比。在一些实施方式中，对于每组蛋白质(例如，具有相同数量的重复)，所述蛋白质的分子量越低，所述组的摩尔比越高。
在另一个实施方式中，每个重复具有2kda至3.5kda范围内、2.1kda至3.4kda范围内、2.2kda至3.3kda范围内、2.4kda至3.2kda范围内、2.5kda至3.1kda范围内、2.6kda至3kda范围内或2.7kda至2.9kda范围内的分子量，其中每种可能性表示本发明的单独实施方式。在另一个实施方式中，每个重复具有约2.8kda范围内的分子量。
在另一个实施方式中，组合物包含所述混合物的两种或更多种蛋白质，其分子量增量为2kda至3.5kda、2.1kda至3.4kda、2.2kda至3.3kda、2.4kda至3.2kda、2.5kda至3.1kda、2.6kda至3kda、或2.7kda至2.9kda，其中每种可能性代表本发明的单独实施方式。在另一个实施方式中，组合物包含分子量增量为约2.8kda的所述混合物的两种或更多种蛋白质。
在一些实施方式中，所述重复区具有第一部分和第二部分，其中第一部分和第二部分是邻接的(即彼此直接相邻)。通常，第一部分和第二部分通过肽键连接。
在一些实施方式中，所述重复区的第一部分是5-30个氨基酸的氨基酸序列，其包含至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少60％、至少55％或至少50％的丙氨酸残基。
在一些实施方式中，第一部分可以包含一个或多个甘氨酸残基。在一些实施方式中，第一部分包含多达5％、多达10％、多达15％、多达20％、多达25％、多达30％、多达45％或多达50％的甘氨酸残基。
在一些实施方式中，第一部分包含丙氨酸-甘氨酸二肽的1至15个重复，如在式(ag)1-15中。
在一些实施方式中，第一部分包含甘氨酸-丙氨酸二肽的1至15个重复，如在式(ga)1-15中。
在一些实施方式中，所述重复区的第二部分是20-60个氨基酸的氨基酸序列，其包含至少80％的选自甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸和酪氨酸的残基。
在一些实施方式中，所述重复区的第二部分是20-60个氨基酸的氨基酸序列，其包含至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的选自甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸和酪氨酸的残基。在一些实施方式中，所述重复区的第二部分包含不超过一个或两个谷氨酰胺残基。本领域技术人员将会理解，只要序列形成自组装纤维，重复区中的甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸和酪氨酸残基的确切数量和顺序可以不同。
在一些实施例中，所述重复区包含：
(i)10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％的丙氨酸残基或其间的任何范围；
(ii)20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％的甘氨酸残基或其间的任何范围；
(iii)10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％的丝氨酸残基或其间的任何范围；
(iv)10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％的脯氨酸残基或其间的任何范围；
(v)1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的酪氨酸残基或其间的任何范围；
(vi)1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的谷氨酰胺残基或其间的任何范围；和
(vii)0％、1％、2％、3％、4％、5％的精氨酸残基或其间的任何范围。
在一些实施方式中，所述重复区包含13-42％的丙氨酸残基、25-55％的甘氨酸残基、10-18％的丝氨酸残基、12-21％的脯氨酸残基、4-7％的酪氨酸残基、4-7％的谷氨酰胺残基、和0-3％的精氨酸残基。
在一些实施方式中，masp1蛋白的所述重复区具有如seqidno：1所示的氨基酸序列
(x1)zx2gpggygpx3x4x5gpx6gx7ggx8gpggpgx9x10
其中x1独立地在每种情况下为a或g，其中至少50％的(x1)z为a，z为5至30之间的整数；x2为s或g；x3为g或e；x4为g、s或n；x5为q或y；x6为g或s；x7为p或r；x8为y或q；x9为g或s；并且x10为s或g。
在一些实施方式中，所述重复区具有如seqidno：8所示的氨基酸序列
(x1)zx2gpggygpgx3x4gpx5gx6ggx7gpggpgx8x9
其中x1独立地在每种情况下为a或g，其中至少50％的(x1)z为a，z为5至30之间的整数；x2为s或g；x3为g或s；x4为q或y；x5为g或s；x6为p或r；x7为y或q；x8为g或s；并且x9为s或g。
在一些实施方式中，(seqidno：1或8的)z是6至11之间的整数、6至10之间的整数或7至9之间的整数。在一个实施方式中，z是选自5、6、7、8、9、10、11和12的整数。在另一个实施方式中，z是8。
在另一个实施方式中，masp1蛋白的所述重复区包含如seqidno：2(sgpggygpgsqgpsgpggygpggpgss)所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，masp1蛋白的所述重复区包含如seqidno：3(aaaaaaaasgpggygpgsqgpsgpggygpggpgss)所示的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，所述同系物与seqidno：1共享至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。
在另一个实施方式中，所述同系物与seqidno：2共享至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。
在另一个实施方式中，所述同系物与seqidno：3共享至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。
在另一个实施方式中，masp1蛋白的所述重复区包含如seqidno：4所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，masp1蛋白的所述重复区具有如seqidno：10所示的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，所述混合物的每种蛋白质还包含选自seqidno：5(msyyhhhhhhdydipttenlyfqgamdpefkglrrraqlv)；seqidno：6(msyyhhhhhhdydipttenlyfqgamdpefkglrrraqlvrplsnldna)；seqidno：7(msyyhhhhhhdydipttenlyfqgamdpefkglrrraqlvdppgcrnsaragss)的单个n-端区域、或其任何功能同系物、变体、衍生物或片段。在另一个实施方式中，所述c-端区域的所述同系物与seqidno：5-7中的任一个共享至少70％的同源性。
在另一个实施方式中，所述混合物的每种蛋白质还包含单个c-端区域seqidno：9
(gpsgpgaygpspsasasvaasrlsspaassrvssavsslvssgptngaavsgalnslvsqisasnpglsgcdalvqallelvsalvailssasigqvnvssvsqstqmisqals)、或其任何功能同系物、变体、衍生物、片段或突变体。在另一个实施方式中，所述n-端区域的所述同系物与seqidno：9共享至少70％的同源性。
在一些实施方式中，所述混合物的一种或多种蛋白质还包含至少一个标签序列。可用于本发明的标签的非限制性例子包括his标签、ha标签、t7标签等。示例性的his标签包含如seqidno：11(hhhhhh)所示六个his残基或由如seqidno：11(hhhhhh)所示六个his残基组成。在另一个实施方式中，标签是包含如seqidno：12(ypydvpdya)所示氨基酸序列或由其组成的ha标签。在另一个实施方式中，标签是包含如seqidno：13(masmtggqqmg)所示氨基酸序列或由其组成的t7标签。技术人员非常清楚可选的合适标签或其他融合伴侣。
如本文所用，“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸，以及随后修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和r基团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的r基团或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。氨基酸在本文中可以通过其公知的三字母符号或由iupac-iub生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。
“氨基酸序列”或“肽序列”是通过肽键连接的氨基酸残基位于肽和蛋白质链中的顺序。该序列通常从含有游离氨基的n-端到含有游离羧基的c-端报道。如果氨基酸序列代表蛋白质的一级结构，则该序列通常称为肽、蛋白质序列，然而必须辨别术语“氨基酸序列”或“肽序列”和“蛋白质”，因为蛋白质被定义为折叠成特定三维构型并且通常经历了翻译后修饰，如磷酸化、乙酰化、糖基化、巯基键形成、裂解等的氨基酸序列。
如本文所用，在本发明所例示的合成蜘蛛丝氨基酸序列或编码其的核酸分子的上下文中，“分离的”或“基本上纯化的”是指氨基酸序列或多核苷酸已从它们的天然环境移除或已经从它们的自然状态改变。这样的“分离的”不一定反映氨基酸序列或核酸分子已被纯化的程度。然而，应该理解的是，已经被纯化到一定程度的这种分子是“分离的”。如果所述分子不存在于天然环境中，即它不存在于自然界中，则无论分子存在于何处，该分子都是“分离的”。举例来说，甚至当氨基酸序列或多核苷酸存在于人类中时，没有天然存在于人类中的氨基酸序列或多核苷酸也是“分离的”。
当应用于氨基酸序列或核酸时，术语“分离的”或“基本上纯化的”表示氨基酸序列或核酸基本上不含天然状态中它们结合的其他细胞组分。它可以处于均一状态，或者可选地在干燥或水溶液中。通常使用分析化学技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱来确定纯度和均一性。存在于制剂中的主要种类的氨基酸序列或核酸是基本纯化的。
在一些实施方式中，所述重复具有masp1蛋白或其片段的重复区的同系物、变体、衍生物。在一些实施方式中，所述重复具有adf-4蛋白或其片段的重复区的同系物、变体、衍生物。在一个示例性实施方式中，所述重复包含seqidno：45-47中任一个所示的多核苷酸序列或由其组成。
如本文所用，如在“功能同系物、变体、衍生物或片段”中的术语“功能”是指具有通过限定的功能测定而鉴定的生物学功能或活性的氨基酸序列。更具体地，限定的功能测定是在表达所述功能同系物、变体、衍生物或片段的细胞中形成自组装纤维。
当同源性被确定为至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％时，氨基酸序列或核酸序列被认为是相应氨基酸序列或核酸的同系物。
如本文所用，可以基于两个氨基酸(肽)或dna序列之间的百分比同一性来确定同源性。一般来说，将要比较的两个序列进行比对以给出序列之间的最大相关性。检查两个序列的比对，确定两个序列之间给出确切氨基酸(或核苷酸)对应的位置数量，除以比对的总长度，乘以100，得到百分比同一性数字。该百分比同一性数字可以在待比较的序列的全长上确定——这特别适合于长度相同或非常相似并且高度同源的序列，或者在更短的限定长度上确定——这更适合于长度不等或具有较低同源性水平的序列。用于比较两个或更多个序列的同一性的方法在本领域中是公知的。因此，例如，威斯康星序列分析包版本9.1中可用的程序，例如程序gap和bestfit，可用于确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性和两个多核苷酸序列之间的百分比同一性。bestfit使用smith和waterman的“局部同源性”算法，找到两个序列之间最好的单一相似区域。bestfit更适合于比较长度不同的两个多肽或两个多核苷酸序列，程序假定较短的序列代表较长的一部分。相比之下，根据needleman和wunsch的算法，gap比对找到“最大相似性”的两个序列。gap更适合于比较大约相同长度的序列，并预期整个长度上的比对。优选地，在每个程序中使用的参数“空位权重”和“长度权重”分别对于多核苷酸序列是50和3，对于多肽序列是12和4。优选地，当被比较的两个序列被最佳比对时确定百分比同一性和相似性。
在两个或更多个氨基酸或核酸序列的上下文中，术语“同一”、“基本同一性”、“基本同源性”或百分比“同一性”是指相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列或子序列(即，当在比较窗口或指定区域上针对最大对应而进行比较和比对时，在指定区域(例如氨基酸序列seqidno：2或3)上约60％同一性，或至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或99％同一性)，如使用具有下述默认参数的blast或blast2.0序列比较算法，或通过手动比对和视觉检查所测量的。然后这样的序列被认为是“基本同一的”。该定义还涉及或可以应用于测试序列的互补序列(compliment)。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。优选的算法可以考虑空位等。
对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。优选地，可以使用默认程序参数，或者可以指定可选参数。然后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
应该理解的是，本发明进一步包括包含n个重复的seqidno：1、2或3任一个变体的氨基酸序列。如本文所用，术语“变体”或“基本上相似的”包含不同于具体鉴定的序列的氨基酸或核苷酸序列，其中一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或25个)氨基酸残基或核苷酸缺失、取代或添加。变体可以是天然存在的等位基因变体或非天然来源的变体。变体或基本上相似的序列是指氨基酸序列或核酸的片段，其可以通过其氨基酸或核苷酸序列与本文所述的氨基酸或核苷酸序列的同一性百分比来表征，如通过在现有技术中使用的常用算法所确定的。氨基酸或核酸的优选片段是当与参考序列比较时具有至少约40或45％的序列同一性，优选约50％或55％的序列同一性，更优选约60％或65％的序列同一性，更优选约70％或75％的序列同一性，更优选约80％或85％的序列同一性，更优选约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸或核苷酸序列的那些片段。
本文使用的术语衍生物和功能衍生物是指具有任何插入、缺失、取代和修饰的本发明的氨基酸序列。
应该理解的是，术语“插入”如本文所用，意指在本发明的序列中添加1至50个氨基酸残基，具体地20至1个氨基酸残基，更具体地，1至10个氨基酸残基的氨基酸残基。最具体地，1、2、3、4、5、6、7、8、9和10个氨基酸残基。此外，本发明的氨基酸序列可以在其n-端和/或c-端用各种相同或不同的氨基酸残基延伸。
氨基酸“取代”是用具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸取代一个氨基酸的结果，即保守氨基酸置换。氨基酸取代可以基于所涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性来进行。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；和带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
在另一个实施方式中，本发明的重复序列具有17个或更少、16个或更少、15个或更少、14个或更少、13个或更少、12个或更少、11个或更少、10个或更少、9个或更少、8个或更少、或者7个或更少的对seqidno：2或3中任一个序列的氨基酸取代。在一个实施方式中，本发明的重复序列具有至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个或至少13个对seqidno：2或3中任一个序列的氨基酸取代。
就氨基酸序列而言，技术人员将认识到对氨基酸、核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加——其改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或少部分氨基酸——是“保守性修饰的变体”，其中所述改变导致用化学上相似的氨基酸取代氨基酸。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。这些保守修饰的变体除了并且不排除本发明的多态变体、种间同系物和等位基因。
例如，可以进行取代，其中脂肪族氨基酸(g、a、i、l或v)用该组的另一个成员取代，或取代如一个极性残基取代另一个极性残基如精氨酸取代赖氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬酰胺。以下八组中的每组含有其他示例性氨基酸，这些氨基酸是彼此的保守取代：1)丙氨酸(a)、甘氨酸(g)；2)天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；3)天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)；4)精氨酸(r)、赖氨酸(k)；5)异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、缬氨酸(v)；6)苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)；7)丝氨酸(s)、苏氨酸(t)；和8)半胱氨酸(c)、甲硫氨酸(m)。
保守核酸取代是导致如上所定义的保守氨基酸取代的核酸取代。
本发明的氨基酸序列的变体可具有与由seqidno：2或3中的任一个表示的重复单元在氨基酸水平上至少80％序列相似性、至少85％序列相似性、90％序列相似性或至少95％、96％、97％、98％或99％序列相似性。
本发明的氨基酸序列可以包含n个重复的seqidno.1或seqidno.3或其任何片段。“片段”构成特定区域的氨基酸或dna序列的一部分。肽序列的片段比特定区域短至少一个氨基酸，并且dna序列的片段比特定区域短至少一个碱基对。该片段可以在c-端或n-端或两端截短。氨基酸片段可以包含seqidno.1或3的至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少24、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33或至少34个氨基酸。
本发明氨基酸序列的突变体的特征在于其一个(点突变体)或更多，约多达10个氨基酸与一个或多个另一个氨基酸的交换。它们是dna水平上相应突变——导致不同密码子——的结果。
另外，本发明涉及本发明氨基酸序列的衍生物。本发明的氨基酸序列的衍生物是，例如，其中官能团如氨基、羟基、巯基或羧基被衍生化，例如分别被糖基化、酰化、酰胺化或酯化。在糖基化衍生物中，寡糖通常与天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸和/或赖氨酸连接。酰化衍生物特别是被天然存在的有机或无机酸如乙酸、磷酸或硫酸酰化，其通常分别发生在n-端氨基处或羟基处，特别是酪氨酸或丝氨酸的n-端氨基处或羟基处。酯是天然存在的醇例如甲醇或乙醇的酯。其他衍生物是盐，尤其是药学上可接受的盐，例如金属盐，如碱金属和碱土金属盐，例如钠盐、钾盐、镁盐、钙盐或锌盐，或与氨或合适的有机胺，如低级烷基胺例如三乙胺、羟基-低级烷基胺例如2-羟乙胺等形成的铵盐。
根据一些方面，本发明提供了编码本发明所述蛋白质混合物的两种或更多种蛋白质的分离的核酸序列。根据一些实施方式，本发明提供了编码本发明蛋白质混合物的分离的核酸序列。
“核酸”是指可以是单链或双链的，由含有糖、磷酸和嘌呤或嘧啶的单体(核苷酸)组成的分子。在细菌、低等真核生物以及高等动物和植物中，“脱氧核糖核酸”(dna)是指遗传物质，而“核糖核酸”(rna)参与将信息从dna翻译为蛋白质。
由于遗传密码的简并性质，清楚的是可以使用多种不同的核酸序列来编码本发明的氨基酸序列。应该理解的是，包含在本发明的核酸序列中的密码子可以针对在sf9宿主细胞中的表达进行优化。
当指用于转化各种宿主的核酸分子的基因或编码区时，术语“密码子优化”指核酸分子的基因或编码区中的密码子的改变，以反映宿主生物的典型密码子使用而不改变dna编码的多肽。在本发明的上下文内，基因和dna编码区经密码子优化以在宿主细胞中以及在特定实例中，在sf9草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)昆虫细胞中最佳表达。
本文使用的术语“表达”意指从编码基因产物序列的基因转录和翻译成基因产物。在该表达中，首先将编码基因产物序列的dna链转录为通常为信使rna的互补rna，然后，如果基因产物是蛋白质，则将如此转录的信使rna翻译成上述基因产物。
在一些实施方式中，本发明涉及一种或多种包含编码本发明的蛋白质混合物的核酸序列的表达载体。在一些实施方式中，本发明涉及一种或多种表达载体，其包含编码本发明的蛋白质混合物的至少一部分(例如，两组或更多组具有不同分子量的蛋白质)的核酸序列。由包含在本发明的表达载体内的核酸序列编码的氨基酸序列可以任选地进一步包含c-端区域(例如，表示为seqidno：9)；和n-端区域(例如，选自seqidno：5-7)中的至少一个。应该注意的是，核酸序列处于可操作连接的启动子和任选地调节序列的表达控制之下。
如本文所用，本文所指的“载体”、“表达载体”或“质粒”是一种染色体外元件，通常携带不是细胞中心代谢的部分的基因，并且通常是环状双-链dna分子的形式。它可以是许多核酸中的任何核酸，通过限制和连接可将期望的序列插入其中，以便在不同遗传环境之间转运或在宿主细胞中表达。载体通常由dna组成，尽管rna载体也是可用的。载体包括但不限于质粒和噬菌粒。克隆载体是能够在宿主细胞中复制的载体，并且其特征还在于一个或多个内切核酸酶限制位点，在该限制位点可以以可测定的方式切割载体，并且可以将期望的dna序列连接到其中，使得新的重组载体保留其在宿主细胞中复制的能力。在质粒的情况下，当质粒在宿主细菌内的拷贝数增加时期望的序列的复制可以发生多次或者在宿主通过有丝分裂繁殖之前每个宿主期望的序列的复制可以仅发生一次。在噬菌体的情况下，复制可以在裂解阶段期间主动地发生或在溶源阶段期间被动地发生。表达载体是可通过限制和连接将期望的dna序列插入其中的表达载体，使得其可与调节序列可操作地连接并可表达为rna转录物。载体可以进一步含有一种或多种适用于鉴定和选择用载体已转化或转染的细胞的标记序列。如本文所用，“转化”或“转染”是通过掺入核酸获得细胞中的新基因。标记包括例如编码增加或减少对抗生素或其他化合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因，编码其活性可通过本领域已知的标准测定可检测的酶(例如β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶)的基因，和明显影响转化或转染的细胞、宿主、集落或噬斑的表型的基因。优选的载体是能够自主复制和表达存在于它们可操作地连接的dna区段中的结构基因产物，即表达合成蜘蛛丝蛋白的载体。
在具体的实施方式中，载体是病毒载体，最具体地是杆状病毒载体系统或痘苗病毒载体系统。这种可商购的杆状病毒系统的例子
在一个实施方式中，杆状病毒系统用于表达本发明的合成丝蛋白。杆状病毒是可分为两个属：核多角体病毒和颗粒病毒的大型杆状病毒家族。它们具有有限的它们可以感染的宿主范围，通常限于有限数量的密切相关的昆虫种类。因为杆状病毒对人体无害，所以它们是用于研究和商业或工业应用的安全选择。昆虫细胞中的杆状病毒表达代表生产重组糖蛋白的稳健方法，相对于原核表达的重要优势，其缺乏糖基化，因此蛋白质折叠恰当。
如上所述，本发明的表达载体可操作地连接至启动子。术语“启动子”和“启动子区”是指通常在结构基因的蛋白质编码序列的上游(5')的dna序列，其通过提供对rna聚合酶和/或转录在正确位置开始所需的其他因子的识别来控制编码区的表达。启动子序列是必要的，但并不总是足以驱动基因的表达。术语“合适的启动子”将指能够驱动合成蜘蛛丝变异基因表达的任何真核或原核启动子。
用于驱动sf9中异源dna片段表达的启动子是众多的且本领域技术人员熟悉的。几乎任何能够驱动编码丝变异蛋白的基因的启动子都适用于本发明。例如，多角体蛋白、碱性蛋白质、p10、opie2和gp4启动子可以是用于所述表达的合适启动子。
当编码序列和调节序列共价连接时，编码序列和调节序列被称为“可操作地连接”或“可操作地结合”，从而将编码序列的表达或转录置于调节序列的影响或控制下。如果调节序列相对于基因定位使得调节序列能够对所产生的基因产物的量施加可测量的影响，那么调节序列与基因可操作地连接。如果期望将编码序列翻译成功能蛋白质，则两个dna序列被称为可操作地结合，如果5'调节序列中的启动子的诱导导致编码序列的转录并且如果两个dna序列之间连接的性质不(1)导致引入移码突变，(2)干扰启动子区指导编码序列转录的能力，或(3)干扰相应的rna转录物被翻译成蛋白质。因此，如果启动子区能够影响该dna序列的转录，则启动子区将可操作地结合至编码序列，使得所得转录物可被翻译成期望的蛋白质或多肽。
基因表达所需的调节序列的确切性质可以在物种或细胞类型之间变化，但是按照需要，通常应该包括分别涉及转录和翻译起始的5'非转录和5'非翻译序列，如tata盒、加帽序列、caat序列。特别地，这种5'非转录调节序列将包括启动子区，其包括用于可操作地结合的基因的转录控制的启动子序列。根据需要，调节序列还可以包括增强子序列或上游激活子序列。
“调节(regulation)”和“调节(regulate)”是指由主要但不唯一位于基因转录起点上游(5')的dna序列元件控制的基因表达的调节。调节可能导致对刺激的全或无响应，或者可能导致基因表达水平的变化。
另一方面，本发明提供了用根据本发明的表达载体转化的宿主细胞。
“细胞”、“宿主细胞”或“重组的宿主细胞”是本文可互换使用的术语。应该理解的是，这样的术语不仅指特定的受试细胞，而且指这样的细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生，所以这样的后代事实上可能不与亲本细胞相同，但仍包括在本文所用的术语的范围内。
如本文所用，“宿主细胞”是指可以用裸dna或使用重组dna技术构建的表达载体重组转化的细胞。抗药性或其他选择性标记部分地旨在便于选择转化体。此外，选择性标记如抗药性标记的存在可用于防止污染性微生物在培养基中繁殖。转化的宿主细胞的这种纯培养物将通过在需要诱导的存活表型的条件下培养细胞来获得。
本发明的宿主细胞用本文描述的表达载体转化或转染以表达本发明的合成蜘蛛丝蛋白。如本文所用，“转化”是指细胞的基因型由于细胞摄入外源dna或rna而改变的过程，并且例如转化的细胞表达重组形式的期望的合成蜘蛛丝蛋白。术语“转染”意指通过核酸介导的基因转移将核酸，例如裸dna或表达载体引入受体细胞。
在一个具体的实施方式中，用根据本发明的表达载体转化的宿主细胞是昆虫细胞。作为昆虫细胞，可以使用鳞翅目昆虫细胞，更具体地，可以使用来自草地贪夜蛾和来自粉纹夜蛾(trichoplusiani)的细胞。最具体地，昆虫细胞是sf9、sf21或high5细胞。
在一些实施方式中，本发明的丝蛋白缺乏翻译后修饰。
在一些实施方式中，本发明的丝蛋白是可生物降解的。例如，在医学领域中，每当丝蛋白打算用于体内使用——其中期望生物降解——时，该特征可能具有重要性。该特征可能特别适用于缝合材料和伤口闭合和覆盖系统。
根据一些方面，本发明提供了包含本发明的核酸序列的表达载体，其中所述核酸序列处于可操作地连接的启动子和任选地调节序列的表达控制下。
纤维
根据一些方面，本发明提供了包含本发明的组合物的纤维。
如本文所用，“纤维”是指由两根或更多根捻合在一起的细丝组成的纤维材料的细线。“细丝”是指细长的、伸长的、线状的物体或长度不定的结构，范围从微观长度到英里或更大的长度。具体地，合成蜘蛛丝细丝是微观的，并且是蛋白质的。“生物丝(biofilament)”是指由蛋白质产生的细丝，包括重组产生的蜘蛛丝蛋白。术语“纤维”不包含非结构化聚集体或沉淀物。
在一些实施方式中，纤维具有至少50nm的厚度直径。在一些实施方式中，纤维具有至多350nm的厚度直径。在一些实施方式中，纤维具有至少50-350nm或其间的任何数值的厚度直径。如本文所证明的(参见图1)，最终的纤维由直径为5-10nm的纳米纤维构成。
在一些实施方式中，与其厚度相比，纤维具有相当大的延伸长度，优选20μm以上。
“微纤维”是指细度小于1旦尼尔的细丝(旦尼尔被定义为每9000米的质量克数)。
在一些实施方式中，蛋白质的纤维的特征在于其至少一个维度(例如直径，长度)的大小。
例如但没有限制，纤维的直径在10nm-1μm、20-100nm或10-50nm之间。
在一些实施方式中，纤维由纳米原纤维构成。在一些实施方式中，纳米原纤维的直径为例如1nm、约2nm、约3nm、约4nm、约5nm、约6nm、约7nm、约8nm、约9nm、约10nm、约11nm、约12nm、约13nm、约14nm、约15nm、约16nm、约17nm、约18nm、约19nm、约20nm、约21nm、约22nm、约23nm、约24nm、约25nm、约26nm、约27nm、约28nm、约29nm、约30nm、约31nm、约32nm、约33nm、约34nm、约35nm、约36nm、约37nm、约38nm、约40nm、约42nm、约44nm、约46nm、约48nm或50nm，包括其间的任何值或范围。在一个实施方式中，纳米原纤维具有3-7nm的直径。在一个实施方式中，纳米原纤维具有4-6nm的直径。
在一些实施方式中，所公开的纤维的长度在1-200μm、10-100μm、100-500μm或200-500μm之间。
通过一个实施方式，本发明的纤维通过自组装而组装。“自组装”是指所述纤维的单体即本发明的合成蜘蛛丝蛋白在正常生理条件下或在室温下以能量有利的方式自发地彼此结合以产生具有本文所述性质的大分子纤维结构。此外，本发明的纤维非常有弹性，并且一经组装就可承受极端的化学攻击，如在10％sds中溶解并煮沸至少1小时。
“韧度(tenacity)”或“拉伸强度”是指细丝在断裂之前可承受的重量。所产生的最大比应力通常是在细丝、纱线或织物中通过拉伸试验来断裂材料。根据具体实施方式，本发明的纤维具有约100-3000mpa(mpa＝n/mm2)、约300-3000mpa、约500-2700mpa、约700-2500mpa、约900-2300mpa、约1100-2000mpa、约1200-1800mpa、约1300-1700mpa或约1400-1600mpa的拉伸强度。更具体地，约1500mpa。
“韧性(toughness)”是指断裂纤维所需的能量。这是应力应变曲线下的面积，有时称为“断裂能量”或破裂功。根据具体的实施方式，本发明的纤维的韧性为约20-1000mj/m3、约50-950mj/m3、约100-900mj/m3、约120-850mj/m3、约150-800mj/m3、约180-700mj/m3、约180-750mj/m3、约250-700mj/m3、约280-600mj/m3、约300-580mj/m3、约310-560mj/m3、约320-540mj/m3或约350-520mj/m3，最具体地约350-520mj/m3。
“弹性”是指在变形后物体倾向于恢复其原始尺寸和形状的性质。塑性，变形而不恢复，与弹性相反。在纤维的分子构型上，通过原子间和分子间结构键的拉伸(再定向)，可恢复或弹性变形是可能的。相反，将分子间键断裂并重新形成新的稳定位置导致不可恢复或塑性变形。
“延伸”是指以初始长度的百分比或分数表示的长度增加。
“细度”是指纤维或细丝(例如生物丝)的平均直径，其通常以微米表示。
在一些实施方式中，公开的组合物通过限定的差示扫描量热法(dsc)图谱来表征。在一些实施方式中，“dsc图谱(dscpattern)”意指峰的位置。在一些实施方式中，“峰”意指放热峰。遍及本文，“峰的位置”或“峰位置”是指温谱图图谱(thermogrampattern)中沿温度轴的峰，并且在一些实施方式中，可以指任何峰强度处的峰位置。本领域技术人员将会理解，在dsc测量中获得的数据部分取决于所使用的仪器和进行测量时的环境条件(例如湿度)。
在一些实施方式中，公开的组合物通过显示至少在250℃至330℃范围内的吸热峰的dsc图谱表征。在一些实施方式中，公开的组合物通过显示至少在290℃至310℃范围内的吸热峰的dsc图谱表征。在一些实施方式中，公开的组合物通过显示至少在295℃至305℃范围内的吸热峰的dsc图谱表征。
在一些实施方式中，公开的组合物通过显示至少在260℃至320℃和220℃至250℃范围内的吸热峰的dsc图谱表征。在一些实施方式中，公开的组合物通过在120℃至160℃范围内的另外的dsc放热峰来进一步表征。
在一些实施方式中，公开的组合物没有在约-100℃至约220℃范围内的dsc峰。在一些实施方式中，公开的化合物没有在约-100℃至约25℃范围内的dsc峰。在一些实施方式中，公开的组合物通过至少显示在40℃至70℃范围内没有放热峰的dsc图谱表征。
在一些实施方式中，公开的化合物没有在约-100℃至约-50℃范围内的dsc峰。在一些实施方式中，公开的化合物没有在约-50℃至约0℃范围内的dsc峰。在一些实施方式中，公开的化合物没有在约-0℃至约-25℃范围内的dsc峰。
组合物
根据具体的实施方式，组合物可以以凝胶、泡沫或用于涂覆支架和植入物的涂层的形式或以用于组织工程目的的形式提供。在其他实施方式中，本发明的组合物是药物组合物。
应该注意，本发明的药物组合物可以包含本发明的氨基酸序列、重组蛋白和纤维中的至少一种，并且可以直接给予待治疗的受试者。制剂通常包含至少一种如上定义的活性成分以及一种或多种其可接受的载体。
制剂特别适用于局部给药，或用作侵入性医疗设备的涂层或用作组织工程的支架，然而皮下、皮内、肌内、腹膜内、静脉内和甚至口服、直肠、鼻或肠胃外给药途径不被忽视。
用于局部给药的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。常规的药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必要的或需要的。
本发明的药物组合物通常包含缓冲剂、调节其渗透性的剂和任选地本领域已知的一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或添加剂。补充活性成分也可以掺入组合物中。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、和植物油的溶剂或分散介质。可以例如，通过使用诸如卵磷脂的涂层，通过在分散的情况下维持所需的粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂等。此类介质和剂用于药物活性物质的用途在本领域中是公知的。除了任何常规介质或剂与活性成分不相容之外，还考虑其在治疗组合物中的用途。
包含本发明的氨基酸序列、重组蛋白和纤维中的至少一种的本发明的药物组合物可以特别适合于生产透皮贴剂即透皮递送系统、弹性伤口敷料、缝合线、涂层或医用织物——其需要弹力、弹性、韧度且无毒。
在又一些实施方式中，本发明的组合物可以是化妆品组合物。术语“化妆品组合物”涉及具有有益的皮肤或其他表面组织美学特性如改善或增强皮肤色调和颜色、头发颜色和光泽、隐藏表面组织缺陷如瑕疵和疤痕、或防止未来或累积的损伤如阳光损伤和皮肤老化的组合物。
根据本发明的用于治疗的皮肤病学或化妆品组合物作为软膏发膏剂、洗剂、霜剂和凝胶剂局部施加于表皮上以及作为水乳剂如乳膏、洗剂或凝胶剂局部施加于粘膜上。化妆品可以使用这样的组合物来生产，包括产品如剃须膏、护手霜、香波、肥皂、调理剂(conditioner)、身体乳霜、皮肤防晒(sunskin-protection)、面霜或身体乳液。根据本发明的化妆品组合物中组分的比可根据化妆品组合物的预期应用进行调节。
组织支架(tissuescaffolding)
另一方面，本发明提供组合物，所述组合物包含(i)细胞；和(ii)包含至少一种本发明的纤维的细胞支架材料。
另一方面，本发明提供培养细胞的方法，该方法包括：
提供待培养的细胞样品；
将所述样品施加到包含至少一种本发明的纤维的细胞支架材料；和
在适于细胞培养的条件下保持所述细胞支架材料——具有施加于其上的细胞。
在本发明的上下文中，术语细胞的“培养”、“细胞培养”应被广泛地解释，使得它们包括例如细胞分裂和/或增殖的情况、细胞维持在分化状态——保留在其天然环境中存在时由细胞类型表现的至少一种功能特征——的情况、以及干细胞维持在未分化状态的情况。
在一些实施方式中，培养方法或细胞组合物可以在包含含有特定生长因子或细胞外基质(ecm)组分的细胞培养和/或培养基的条件下进行。在其他实施方式中，培养或制备方法可以在包含将施加有细胞的细胞支架材料保持在无血清培养基中的条件下进行。在无血清培养基中培养细胞的可能性提供了对含血清培养基和/或含有特定生长因子或细胞外基质(ecm)组分的培养基的使用的成本有效且可控的替代方案。
在本文所述的方法和细胞组合物的一些实施方式中，细胞是真核细胞。在本文所述的方法和细胞组合物的一些实施方式中，真核细胞是哺乳动物细胞，例如人类细胞。在其他实施方式中，真核细胞是非哺乳动物细胞，如昆虫或酵母细胞。
可以通过所述方法培养或制备或包含在根据本发明的细胞组合物中的哺乳动物细胞的非限制性例子。在一些实施方式中，所述细胞是肝细胞、成纤维细胞、角质化细胞和内皮细胞。在一些实施方式中，所述细胞是干细胞和来自包括β细胞的胰岛的细胞。在一些实施方式中，所述细胞是选自神经祖细胞、间充质祖细胞和造血祖细胞的祖细胞。在一些实施方式中，所述细胞是选自造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、乳腺干细胞、内皮干细胞、上皮干细胞和嗅干细胞，特别选自造血干细胞、神经干细胞和间充质干细胞的成体干细胞。
在一些实施方式中，本发明的组合物用作组织粘合剂。如本文所用，“组织粘合剂(也称为组织密封剂或组织胶)”允许彼此连接，特别是重新连接组织层，例如至少两个组织层。特别地，组织粘合剂可以在组织层之间提供紧密的，特别是形式适合(form-fit)的连接，或者在组织层彼此远离的情况下，组织粘合剂可以填充组织层之间的间隙，替换缺失的组织层和/或桥接缺失的组织层。
可以通过本所述方法或使用根据本发明的细胞组合物培养或制备的组织的非限制性例子包括结缔组织、肌肉组织、神经组织、上皮组织、及其组合，例如多个(不同的)组织或任何器官，例如胃、小肠、大肠、肠、直肠、食道、肺、脾、脑、心、肾、肝、皮肤、腺如淋巴和甲状腺、眼或胰。
在一些实施方式中，组合物还包含细胞结合基序。关于在某些条件下培养某些细胞，细胞结合基序的存在可以改善或维持细胞活力。在一些实施方式中，细胞结合基序是通过至少一个肽键与本发明的纤维偶联的寡肽。例如，它可以偶联到本发明纤维内的蛋白质的n-端或c-端，或者在本文所述的蛋白质混合物的其余部分的氨基酸序列内的任何位置。关于寡肽细胞结合基序的选择，技术人员知道几种替代方案。所述寡肽可以例如包含选自rgd、rge、ikvav、yigsr、epdim和nkdil的氨基酸序列。rgd、ikvav和yigsr是普通的细胞结合基序，而epdim和nkdil被称为角质化细胞特异性基序，这在角质化细胞培养的情况下特别有用。使用标准基因工程或化学偶联技术，本领域技术人员容易地实现寡肽细胞结合基序与纤维内蛋白质的偶联。因此，在一些实施方式中，细胞结合基序通过基因工程引入，即形成编码“野生型”蛋白质的核酸与细胞结合基序之间的遗传融合的部分。
在一些实施方式中，与本发明的纤维接触的细胞呈多层形式。多层细胞培养或3d细胞培养包括至少2层细胞，如一层中至少10％的细胞与另一层中至少10％的细胞接触。在一些实施方式中，多层细胞培养或3d细胞培养包括至少3层细胞。
在一些实施方式中，多层细胞培养或3d细胞培养中一层中至少10％的细胞与同一多层细胞培养或3d细胞培养中另一层中至少10％的细胞接触细胞。在一些实施方式中，多层细胞培养或3d细胞培养中一层中至少20％的细胞与同一多层细胞培养或3d细胞培养中另一层中至少20％的细胞接触。在一些实施方式中，多层细胞培养或3d细胞培养中一层中至少30％的细胞与同一多层细胞培养或3d细胞培养中另一层中至少30％的细胞接触。在一些实施方式中，多层细胞培养或3d细胞培养中一层中至少40％的细胞与同一多层细胞培养或3d细胞培养中另一层中至少40％的细胞接触。在一些实施方式中，多层细胞培养或3d细胞培养中一层中至少50％的细胞与同一多层细胞培养或3d细胞培养中另一层中至少50％的细胞接触。在一些实施方式中，多层细胞培养或3d细胞培养中一层中至少60％的细胞与同一多层细胞培养或3d细胞培养中另一层中至少60％的细胞接触。在另一个实施方式中，短语“接触”是物理接触。在另一个实施方式中，短语“接触”是细胞与细胞的相互作用。
在另一个实施方式中，短语“3d培养(三维培养)”是指其中细胞被置于与细胞生长相容的条件，同时允许细胞在多于一个层中生长的培养。
物品
在另外的方面，本发明提供包含至少一种由根据本发明的重组蛋白构成的纤维的物品。
术语“物品”或“制造品”包括为有形、可移动和独立物体的制造物品。更具体地，本文术语“物品”是指这样的制造物品，其包含或掺入本发明的氨基酸序列、重组蛋白质和纤维中的至少一种。这些物品的非限制性实例包括：合成蜘蛛丝涂布的支架和缝合线、皮肤贴片、组织支架材料、织物、背心、防弹背心、绳索、线、化妆品等。
这种物品的实例是用于手术缝合的线、或用于编织服装的线、或物品可以是用于各种组织工程方面的支架。
根据本发明的物品的其它实例包括医疗装置，如医用粘合带、皮肤移植物、替换韧带和外科网；以及各种工业和商业产品，如服装面料、防弹背心衬里、容器织物、包或钱包带、电缆、绳索、钓丝、粘合性粘合材料、非粘合性粘合材料、捆扎材料、汽车覆盖件和部件、飞机建筑材料、耐候性材料、柔性隔断材料、运动设备；事实上，高拉伸强度和弹性是期望特性的纤维或织物的几乎任何用途。本发明还考虑其他形式的稳定纤维产品如干喷涂层、珠状颗粒或与其他组合物混合使用的适应性和用途。
本发明的重组蜘蛛丝蛋白可以添加到纤维素和角蛋白和胶原产品中，因此，本发明还涉及包含纤维素和/或角蛋白和/或胶原和本发明的蜘蛛丝蛋白的纸或皮肤护理和头发护理产品。其中掺入了本发明的蛋白质的纸和皮肤护理和头发护理产品显示出改善的特征，特别是改善的拉伸强度或撕裂强度。
复合材料
在一些实施方式中，本发明提供了复合材料，其包含：(a)具有不同分子量的用于制备合成拖丝蜘蛛丝的蛋白质混合物；和(b)聚合物。
在一些实施方式中，术语“复合材料”是指由两种或更多种具有不同特征的物质构成并且其中每种物质保持其本性同时为整体提供所需特性的材料。
在一些实施方式中，术语“材料”是指固体材料。在一些实施方式中，术语“材料”是指半固体材料(例如，凝胶)。
在一些实施方式中，公开的复合材料表现出优异的机械性能
在一些实施方式中，提供了包含蛋白质混合物的纤维。
在一些实施方式中，多个纤维通过接头彼此附接。
在一些实施方式中，如本文通篇所用的术语“聚合物”描述了由多个重复结构单元(可互换地称为主链单元或单体单元)共价地相互连接并形成聚合物的聚合物主链构成的物质，例如有机物，但可选地无机物。如本文所用，术语“聚合物”包括有机和无机聚合物，并且还包括均聚物、共聚物或其混合物(例如掺合物)中的一种或多种。如本文所用，术语“均聚物”描述了由一种类型的单体单元制成并因此由同种主链单元构成的聚合物。如本文所用，术语“共聚物”描述了由多于一种类型的单体单元制成并因此由异种主链单元构成的聚合物。异种主链单元可以通过其侧基而彼此不同。
为了简单起见，如本文通篇可互换使用的术语“聚合物”和“聚合物主链”涉及均聚物、共聚物和它们的混合物。
在一些实施方式中，聚合物是疏水的。在一些实施方式中，聚合物是uv固化的。
在一些实施方式中，公开的复合材料是生物稳定的。在一些实施方式中，公开的复合材料是生物可裂解的。
在一些实施方式中，术语“生物稳定的”描述了在生理条件下保持完整(例如，在体内不降解，因此不可生物降解或不可生物裂解)的化合物或聚合物。
在一些实施方式中，术语“生物可降解的”描述了可在生理和/或环境条件下分解成分解产物的物质。这样的生理和/或环境条件包括例如水解(通过水解切割而分解)、酶促催化(酶促降解)和机械相互作用。该术语通常是指在这些条件下分解的物质，使得50重量百分比的物质在短于一年的时间内分解。
在一些实施方式中，如在本发明的实施方式的上下文中使用的术语“生物可降解的”还包括术语“生物可吸收的”，其描述了在生理条件下分解以将经历生物吸收的产物分解为宿主生物体即变成宿主生物体的生物化学系统的代谢物的物质。
在一些实施方式中，聚合物是或包含合成聚合物。在一些实施方式中，聚合物是或包含天然聚合物。天然聚合物可以指由但不限于天然来源如植物、动物和矿物来源制成的聚合物，或者可以由天然纤维如棉花、亚麻、黄麻、亚麻、苎麻、剑麻和大麻、毛发、和羊毛织成。
进一步的示例性天然聚合物包括聚丙交酯、胶原角蛋白、纤维素、肌动蛋白(actine)、肌球蛋白(myosine)、壳多糖、家蚕丝。
在一些实施方式中，聚合物是热塑性聚合物。在一些实施方式中，聚合物是热固性塑料。在一些实施方式中，聚合物是环氧树脂。在一些实施方式中，聚合物是聚酯(例如脂肪族聚酯)。在一些实施方式中，聚合物选自聚酰胺、聚氨酯和尼龙。在一些实施方式中，聚合物是交联聚合物。在一些实施方式中，聚合物是共聚物。在一些实施方式中，聚合物呈水凝胶形式。
在一些实施方式中，聚合物材料是两种或更多种组分材料(例如共聚物)。如以下实施例部分所示，组分(也称为“部分”)a可以是主要(基础)聚合物，并且部分b可以是例如硬化剂或催化剂。
硬化剂化学族随着聚合物基础而变化，但包括胺、异氰酸酯、过氧化物和其他少数几种。
共聚物可以通过选自自由基聚合过程(例如使用偶氮二异丁腈(缩写为aibn))，逐步生长聚合和链增长聚合的机制来生产。
如本文所用，术语“环氧”是指具有一个氧和两个亚甲基的三元杂环分子的反应基团，其分子式为-c2h3o。
生产方法
在一些实施方式中，提供了用于生产本发明的蛋白质混合物的方法。在具体实施方式中，本发明的方法包括以下步骤：
a.提供包含编码所述氨基酸序列的核酸序列的表达载体，其中所述核酸在可操作地连接的启动子和任选地调节序列的表达控制下；
b.用(a)的表达载体转化宿主细胞；
c.提供(b)的宿主细胞表达异种蛋白的条件；和
d.分离表达的蛋白质，从而获得本发明的合成氨基酸序列。
可以理解的是，尽管本发明一般涉及源自十字园蛛拖丝的合成蜘蛛丝蛋白或其任何片段或部分，但是许多其他蜘蛛物种也可用于以类似方式获得合成蜘蛛丝。更优选地，拖丝蛋白源自以下蜘蛛中的一种或多种：希氏尾园蛛(arachnurahigginsi)、araneuscirculissparsus、十字园蛛、argiopepicta、条带园蛛(bandedgardenspider)(三带蜘蛛(argiopetrifasciata))、batikgoldenwebspider(nephilaantipodiana)、beccari'stentspider(cyrtophorabeccarii)、鸟粪蛛(celaeniaexcavata)、黑白棘蛛(black-and-whitespinyspider)(库氏棘腹蛛(gasteracanthakuhlii))、黑黄园蛛(black-and-yellowgardenspider)(argiopeaurantia)、流星锤蛛(bolasspider)(ordgariusfurcatus)、流星锤蛛巨蜘蛛(bolasspidersmagnificentspider)(ordgariusmagnificus)、棕色水手蛛(brownsailorspider)(嗜水新园蛛(neosconanautica))、棕腿蛛(brown-leggedspider)(neosconarufofemorata)、带帽黑头蜘蛛(cappedblack-headedspider)(帆楚蛛(zygiellacalyptrata))、普通园蛛(commongardenspider)(parawixiadehaani)、commonorbweaver(neosconaoxancensis)、蟹样棘园蛛(crab-likespinyorbweaver)(gasteracanthacancriformis(elipsoides))、curvedspinyspider(gasteracanthaarcuata)、皿云斑蛛(cyrtophoramoluccensis)、cyrtophoraparnasia、dolophonesconifera、dolophonesturrigera、doria'sspinyspider(gasteracanthadoriae)、双点棘蛛(double-spottedspinyspider)(gasteracanthamammosa)、双尾帐篷蜘蛛(double-tailedtentspider)(方格云斑蛛(cyrtophoraexanthematica))、塞若尖腹蛛(aculeperiaceropegia)、eriophorapustulosa、flatanepsion(anepsiondepressium)、四棘宝石蜘蛛(four-spinedjewelspider)(gasteracanthaquadrispinosa)、园网蛛(gardenorbwebspider)(eriophoratransmarina)、giantlichenorbweaver(araneusbicentenarius)、金色网蛛(goldenwebspider)(nephilamaculata)、hasselt'sspinyspider(gasteracanthahasseltii)、tegenariaatrica、heurodesturrita、islandcyclosaspider(岛艾蛛(cyclosainsulana))、珠宝或棘蜘蛛(jewelorspinyspider)(astracanthaminax)、肾形园蛛(kidneygardenspider)(丽园蛛(araneusmitificus))、laglaise'sgardenspider(eriovixialaglaisei)、long-belliedcyclosaspider(cyclosabifida)、malabarspider(nephilengysmalabarensis)、多色圣安德鲁十字蜘蛛(multi-colouredstandrew'scrossspider)(多色金蛛(argiopeversicolor))、观赏性树干蛛(ornamentaltree-trunkspider)(裂腹蛛(herenniaornatissima))、椭圆形圣安德鲁十字蜘蛛(ovalst.andrew'scrossspider)(好胜金蛛(argiopeaemula))、红色帐篷蜘蛛(redtentspider)(单色云斑蛛(cyrtophoraunicolor))、俄罗斯帐篷蜘蛛(russiantentspider)(cyrtophorahirta)、圣安德鲁十字蜘蛛(凯氏金蛛(argiopekeyserlingi))、猩红阿秋蛛(scarletacusilas)(acusilascoccineus)、银色金蛛(silverargiope)(argiopeargentata)、spinybackedorbweaver(gasteracanthacancriformis)、斑点园蛛(spottedorbweaver)(neosconadomiciliorum)、圣安德鲁十字(argiopeaetheria)、圣安德鲁十字蜘蛛(argiopekeyserlingi)、树干蜘蛛(tree-stumpspider)(无鳞波蛛(poltysillepidus))、三角蜘蛛(triangularspider)(arkysclavatus)、三角蜘蛛(arkyslancearius)、双棘蜘蛛(two-spinedspider)(poecilopachysaustralasia)、络新妇蛛属(nephila)物种，例如nephilaclavipes、nephilasenegalensis、nephilamadagascariensis和更多。
此外，合成蜘蛛丝不仅可以通过选择源自的不同的蜘蛛物种来增强，而且可以通过使用除蛋白质以外的各种化合物来增强。吡咯烷具有吸湿性，有助于保持线湿润。它以特别高的浓度出现在胶线中。磷酸氢钾在水溶液中释放质子，导致ph值约为4，使丝呈酸性，从而保护它免受真菌和细菌的伤害，否则这些细菌会消化蛋白质。据信硝酸钾防止蛋白质在酸性环境中变性。
如本文所用，术语“约”是指±10％。
本文使用词语“示例性”来表示“用作例子、实例或说明”。被描述为“示例性”的任何实施方式不一定被解释为优选或优于其他实施方式和/或不包括从其他实施方式引入特征。本文使用术语“任选地”表示“在一些实施方式中提供而在其他实施方式中不提供”。本发明的任何特定实施方式可以包括多个“任选的”特征，除非这些特征相冲突。
如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“和”以及“该”包括复数指示物。因此，例如，提及“masp”包括多个这样的基因和变体，并且提及“该肽”包括本领域技术人员已知的一种或多种肽，等等。
另外，除非另有说明，否则“或”的使用意味着“和/或”。类似地，“包含”、“包括”是可互换的，并且不意欲是限制性的。还应理解，在各种实施方式的描述使用术语“包含”的情况下，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，可以使用语言“基本上由...组成”或“由...组成”来可选地描述实施方式。
贯穿本申请，本发明的各种实施方式可以以范围形式呈现。应该理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应该被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应被认为已具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，1到6的范围的描述应该被认为已具体公开了子范围，如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
在使用类似于“a、b和c等中的至少一个”的惯例的那些情况下，一般而言，在本领域技术人员将理解该惯例的意义上(例如，“具有a、b和c中的至少一个的系统”将包括但不限于具有以下的系统：单独a、单独b、单独c、a和b一起、a和c一起、b和c一起、和/或a、b和c一起等)，这样的构造是预期的。在使用类似于“a、b或c等中的至少一个”的惯例的那些情况下，一般而言，在本领域技术人员将理解该惯例的意义上(例如，“具有a、b或c中的至少一个的系统”将包括但不限于具有以下的系统：单独a、b单独、单独c、a和b一起、a和c一起、b和c一起、和/或a、b和c一起等)，这样的构造是预期的。本领域技术人员将会进一步理解，无论在说明书、权利要求书还是附图中，实际上任何呈现两个或更多个可选术语的分离性词语和/或短语应当被理解为考虑包括该术语中的一个、该术语中的任一个、或两个术语的可能性。例如，短语“a或b”将被理解为包括“a”或“b”或“a和b”的可能性。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述相似或等同的方法和材料可以用于所公开的方法和组合物的实践中，但是本文描述了示例性方法、装置和材料。
实施例
材料和方法
质粒：从geneart(regensburg，germany)获得的pcr-scriptampsk(+)质粒中的dna序列。从invitrogen获得的pfastbachta。
限制酶：从(newenglandbiolabs，ma，usa)获得的psti、hindiii、nsii。
转染和转化：含有杆粒和辅助质粒的感受态大肠杆菌dh10bac细胞来自invitrogen。escort转染试剂从sigma-aldrich获得。
培养基：esf921昆虫细胞培养基，无蛋白质，从expressionsystems获得。
细胞：在悬浮液中生长的sf9-草地贪夜蛾昆虫细胞(atcc#:crl-1711)。
抗体：从roche获得的小鼠抗-his6单克隆抗体。从jackson实验室获得的德克萨斯红缀合的抗小鼠二级igg。
染料：nanovan(nanoprobes,ny,usa)。
成像：olympusbx51荧光显微镜。magnafiresp照相机来自optronics。
实验程序
编码拖丝蜘蛛丝蛋白的单个重复单元的序列的合成：设计代表构成adf-4(genbank登录u47856)的重复区的15个重复的平均共有序列的35个氨基酸长的序列。平均共有序列肽序列是：sgpggygpgsqgpsgpggygpggpgssaaaaaaaa(seqidno14)，其由105个dna碱基对序列：5′-tctggtcctggaggttatggcccaggaagccaaggaccatctggtccaggaggatatggtccaggcggacctggctctagtgcagcagctgccgcagcagctgca-3′(seqidno：15)编码。上述合成的dna在pcr-scriptampsk(+)质粒中获得。根据草地贪夜蛾的密码子使用，序列被优化用于表达，其细胞用于合成蜘蛛丝蛋白和纤维。
在某些实验中，进行了具有不同氨基酸序列的三种构建体，每种具有独特的氨基酸序列：
ci(seqidno：35和36)：sgpggygpgsqgpsgpggygpggpgssagagagaxaaa(xaa描绘ala或gly)
c2(seqidno：38和40)：xaagsgpggygpggqgpggygpggqgpygpgaaaaaaa(xaa描绘ser或gly)
c3(seqidno：42和44)：xaagpgqggyggpggqgpgrggygpgagsaaaaaaaaa(xaa描绘ser或gly)。
编码三个(c1-c3)构建体的单个重复的多核苷酸序列分别以seqidno：45-47提供。
供体质粒构建：用xbai和xhoi切除scriptampsk(+)质粒，将含有nsii和psti限制位点位于两侧的基本重复序列的136-bp序列分离和克隆到杆状病毒供体质粒pfastbachta的多克隆位点(mcs)中。因此，产生了编码人工49个氨基酸n-端结构域和35个氨基酸核心结构域的基本供体质粒。
单个重复的多聚化：限制酶位点nsii和psti位于编码蜘蛛丝蛋白的一个重复(单体)的基本模块两侧，它们是相容的。在第一步中，单体通过双重限制来释放并符合读框地(inframe)插入用psti切割的相同供体质粒中。只有如果插入以正确的有义方向连接时，双切割才能释放二聚体(两个重复之间的限制位点在连接时被消除)。在第二步中释放二聚体，然后以相同的方式重新插入以获得具有四个重复的载体。在接下来的步骤中，重复该程序以获得含有多个合成重复的供体质粒。由使用的分子生物学工具产生的约束和序列的重复性质限制了相同重复的最大可实现数目。
将天然c-端结构域连接至合成重复的下游：使用具有以下引物的pcr进行adf4114个氨基酸的c-端结构域的插入：有义引物，具有序列5′-atatgctgcaggccctagtggtcctgga-3′(seqidno：16)，含有psti限制位点(加下划线的)，和反义引物，具有序列5′-tcgacaagcttggtaccgca-3′(seqidno：17)，编码3'hindiii限制位点(加下划线的)。将具有不同重复数目的供体质粒载体和pcr产物用psti和hindiii切除，纯化并连接，产生编码his6标签的pfastbachta供体质粒，所述his6标签是人工n端结构域的一部分，随后是不同的数目相同重复(本发明人获得了含有核酸序列的1、2、4、8、12、16、20、24、32个重复的构建体)和天然c末端结构域。
细胞培养：将sf9细胞在27℃下在esf921无血清昆虫细胞培养基中繁殖。sf9细胞或者作为单层在6孔板上的盖玻片上或者在130rpm搅拌的摇瓶中生长。
重组杆状病毒的产生：使用含有杆粒(杆状病毒穿梭载体质粒)和辅助质粒的感受态大肠杆菌dh10bac细胞根据制造商的方案(invitrogen)产生重组杆粒。通过pcr验证基因插入杆粒中。使用escort转染试剂在6孔板中用重组杆粒dna转染sf9细胞。将细胞在27℃温育5小时，冲洗并再温育72小时。收获培养基，离心，含有病毒的上清液用于连续2-3次感染，导致病毒体滴度的放大。
基于合成的adf-4的蛋白质的表达：用重组病毒以0.1至10的各种moi(感染复数)范围感染sf9细胞(3×106个细胞/ml)。感染四天后，通过以16000g离心10min收获细胞。
合成纤维的纯化：感染后4天收获感染的细胞，并以16000g离心10min。将细胞沉淀重悬于0.25％sds溶液中，在室温下温育30分钟，如上沉淀蛋白质组装体。纯化纤维的典型产率为约150mg/lsf9昆虫细胞培养物。将纯化的纤维以所需溶液和体积再悬浮。
差示扫描量热计(dsc)测量：使用mettlerdsc822e热分析仪和铝样品盘在惰性氮气氛下对3-6mg丝心蛋白样品进行热分析。在5℃/min的加热速率下，温谱图(thermograms)的范围为从10℃到400℃。
免疫细胞化学：以moi＝10用重组病毒感染在50％汇合的盖玻片上生长的细胞。感染后三天，细胞在-20℃用甲醇固定。将盖玻片与1：300稀释度的小鼠抗-his6单克隆抗体温育，然后与1：500稀释度的德克萨斯红缀合的抗小鼠二级igg温育。用olympusbx51荧光显微镜观察细胞，并用magnafiresp照相机拍摄图像或通过共聚焦显微镜分析。
透射电子显微镜检查(tem)：为了超结构分析，将纯化的细丝直接吸附到300目铜多孔碳栅上，或用钒(nanovan1，nanoprobes)负染，用在120千伏下运行的tecnait12显微镜观察和拍照。
实施例1
表征组成微纤维的纳米纤维
将直径为1.8纳米的金颗粒(ni-nta-纳米探针)结合到本发明每种单体的n-端his6标签上。免疫tem观察揭示了两步装配过程，其中单体首先以头尾方式相互作用，从而产生直径约为5纳米的纳米原纤维作为第一阶段(图1a)。因此，纳米原纤维以非定向的方式相互作用(图1b)，从而产生直径约为150纳米的纤维(图1c)。
此外，使用光学显微镜检查基于三种独立构建体(c1、c2和c3)的各种组装纤维的表型和使用共聚焦显微镜检查荧光标记的纤维。如图1d-i所示，构建体c1的单体自组装以在表达细胞胞质溶胶内产生卷曲纤维。该纤维的直径范围在100至200nm之间，长度范围在10至150μm之间。构建体c2的单体自组装以产生直径范围在100至200nm之间而它们的长度范围在10至50μm之间的纤维。构建体c3的单体自组装成各种表型：(i)平均直径为1μm的球状聚集体；(ii)覆盖有平均直径为500nm的聚集体的纤维；(iii)具有光滑表面的纤维，类似于构建体c1和c2。
实施例2
独特的梯状现象表征了本发明的纤维
不重复的n-端和c-端结构域位于两侧的含有不同数目的重复(0、1、2、3、4、8、12、16、20、24、32)的单体倾向于自组装并变成不溶。因此，为了确定单体的分子量(mw)，将纤维纯化并用6m胍scn拆解。顺序地，将胍溶液针对8m尿素透析(使用mw截止值为10kda的穿孔透析盒)，加入样品缓冲液，并在变性10％丙烯酰胺凝胶中分析样品。
在来自三种不同来源的拆解纤维上进行考马斯蓝染色：
(1)来自由n-端结构域、24个相同重复(2.7kda)、c-端结构域组成的基因的带梯；
(2)来自由n-端结构域、16个相同重复(2.7kda)、c-端结构域组成的基因的带梯；和
(3)来自由n-端结构域、15个非相同重复(取自十字园蛛的天然序列)、c-端结构域组成的基因的带梯。
如可以观察到的(图2a)，虽然在人工构建体情况(1、2)中，存在与有利于较轻版本的带的不同带的摩尔比相关的恒定梯度，但是在天然序列的梯处不是这种情况(3)。例如，在源于天然序列的梯处与38kda相关的带比周围带(上方和下方)密集得多。
这一观察结果强有力地表明了不同重复区来源的重要性。虽然在人工序列情况下重复是相同的，但是在天然序列情况下，重复相差至少它们的整体大小和聚丙氨酸拉伸长度。此外，所述差异与源自天然重复序列的纤维与源自本文公开的人工重复序列的纤维之间存在的不同组装性质、不同热稳定性和不同机械性质相关。
sds-page和蛋白质印迹分析：
如上所述，sf9细胞用杆粒dna构建体转染并在转染后72小时收获。
细胞沉淀通过使用10％凝胶的sds-page分离并通过半干印迹转移至硝化纤维素。用奶粉在pbsx1、0.5％tween20中封闭1小时。将膜与小鼠抗-his6单克隆抗体(1:2000)和作为二级抗体的hrp缀合的山羊抗小鼠(1:5000)温育。ecl被用来直接检测带his标签的构建体。
使用针对n-端his6标签的一级抗体的蛋白质印迹验证了在每个观察到的带中存在n-端结构域(图2b)。所有三种蛋白质(描述为c1、c2和c3)引起梯状现象。所有三种蛋白质的最强带(由箭头表示)对应于源自构建体1、2和3的蛋白质的计算的m.w(分别为61.41、62.84和62.16kda)
通过二硫键特异性结合半胱氨酸(只有一个半胱氨酸存在于我们的蛋白质中，位于c-端结构域)的荧光团用于验证在所有观察到的梯带处c-端结构域的存在(图2c)。
从在多角体蛋白启动子下编码全长蛋白质的杆状病毒感染的sf9细胞提取的mrna的rna印迹揭示了与全长蛋白质大小相关的大小的mrna。接下来将提取的mrna用作rt-pcr的模板，产生cdna，其随后用作pcr的模板，产生dna带梯。使用具有对完全蛋白质完全序列的第一个和最后18个碱基的互补序列(complementsequence)的引物对来自上述梯的分离的dna带进行测序。测序显示存在不同数量的重复，完全的n和c-端结构域序列位于其两侧。
上述发现与rna二级结构一起导致令人惊讶地发现一种新的蛋白质合成控制，其中mrna的重复区采用发夹结构，而核糖体在该发夹上滑动。由于这个发夹的交替大小，一系列蛋白质由一个mrna合成。这些蛋白质彼此不同之处仅在于它们所含的重复数目，从而使雌性蜘蛛能够基于一个基因表达一系列丝心蛋白单体。
实施例3
溶解的纯化纤维可以被电纺成连续纤维
将从sf9感染的细胞中分离出的合成纤维脱水(在55摄氏度(℃)的条件下过夜)。向干纤维中加入六氟-2-丙醇(hfip)至最终浓度为纺丝原液的23％重量/体积。电纺方案如下进行：注射速率：0.5ml/小时，电压：18千伏，喷嘴末端与收集器之间的距离：16厘米，湿度：40％，温度：28℃。
上述方案产生了平均直径为100纳米的连续纤维网(图3a)。该纤维的dsc检查显示在289℃的吸热峰，表明在合成纤维中存在基于聚丙氨酸拉伸的纳米晶体(图3b)。
实施例4
纯化纤维的冻干和线性表征
将纯化纤维以0.5％重量/体积悬浮在双蒸水(ddw)中，用液氮冷冻(温度-200℃)，然后冻干约24小时。上述过程产生了含有干纤维的白色粉末。对这些纤维的深入检查显示，它们被线性化，保持其直径，并且容易分散在各种基质中，同时采用线性结构(图4a)以及保持其机械性质。
值得注意的是，与天然拖丝熔点(230℃)相比，测量本文公开的合成纤维的熔点是高的，在约235℃(图4b)。
实施例5
本发明纤维上的多层细胞生长
将本发明的纤维(pbs中1:25)加入无菌96孔组织培养板的孔中。在温育(在4℃)和洗涤步骤后，将hek293细胞铺板到每个纤维涂布的孔中，随后进行温育步骤(在37℃，5％co2，72小时)。
如图5a-c所见，发现hek293细胞优选粘附于本发明的纤维而非组织培养板。此外，本发明的纤维改变了从层生长到3d生长的细胞偏好。
实施例6
本发明纤维的热指纹
进行若干测试以表征本发明的纤维的热指纹。
每个测试时纤维称重为5-10mg。每个测试在配备有液氮冷却罐的mettler-toledodsc2系统上在40μl体积的穿孔铝盘上进行。在加热至100℃并保持该温度5min的脱水过程后，以5℃/min的加热速率从25-350℃运行测试。
结果显示，出乎意料的是，热指纹显示峰开始于265±5℃，直到320±5℃，在～300℃具有峰值。
额外的测试显示具有3个峰的热指纹：
1.在-120-160℃的放热峰；
2.在230-260℃的吸热峰；
3.在265±5℃直至320±5℃的分解峰。
虽然已经结合其具体实施例描述了本发明，但是明显的是，对于本领域技术人员而言，许多替代、修改和变化将是显而易见的。因此，旨在包括落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这些替代、修改和变化。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用以其全部并入本说明书，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入本文。另外，本申请中任何参考文献的引用或识别不应被解释为承认这种参考文献可作为本发明的现有技术。就使用章节标题而言，不应将其解释为必需的限制。
序列表
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