本申请要求于2015年10月27日提交的美国临时申请号62/247,192的根据35u.s.c.119(e)的权益，其内容全部并入本文。
发明领域
本公开一般涉及肥胖和糖尿病的治疗，并且特别涉及允许褐色/浅褐色脂肪组织的受控生成的新的基于聚合物的系统。
发明背景
本部分介绍可以有助于本公开的更好理解的方面。因此，这些陈述应当从此角度来阅读，并且不应理解为承认什么是现有技术，或者什么不是现有技术。
肥胖流行病由于其与一系列代谢疾病，包括2型糖尿病(t2d)、心脏病、高血糖症和多种癌症相关而已经对现代社会的公众健康造成重大忧虑。肥胖在形态学上以白色脂肪组织(wat)中过量的脂质储存为特征，并且特征为能量不平衡的复杂紊乱，其中摄入超过消耗。大量的努力已经致力于探索病理机制以及细胞和分子治疗靶物以与肥胖作斗争。
目前，肥胖治疗可用的药物很少。通常，那些疗法致力于通过刺激中枢神经系统抑制食欲或减少胃肠道内的营养物消化和吸收来减少能量摄入。然而，那些药物只产生适度的效果，并且通常伴随不愉快的、潜在有害的副作用。因此，克服肥胖的替代方法正在进行广泛的探索。一种此类方法是通过加强能量消耗。最近，通过刺激产热的此策略已经成为一种有吸引力的备选。
褐色脂肪组织(bat)是通过经由解偶联蛋白1(ucp1)解偶联线粒体呼吸和atp合成的产热的主要部位。在产生热量时，bat不仅消耗游离脂肪酸，而且还消耗大量葡萄糖，从而为代谢健康带来益处。经典的bat在新生儿中是丰富的，但是随着年龄增长而减少，导致成人中的数量有限。这危害bat在肥胖的临床干预中的治疗价值。
最近在wat贮库中发现诱导型bat(ibat)，也称为浅褐色脂肪组织，通过刺激能量消耗重新点燃了肥胖治疗的前景。浅褐色脂肪细胞也拥有强大的产热能力。
目前用于增强浅褐色脂肪细胞生源和功能的策略涉及遗传和系统性药理学操作，其由于对其它细胞/组织具有非有意的不良后果的风险以及缺乏对浅褐色脂肪细胞生源的位置和时间程度的控制而与重大的转化挑战(translationalchallenge)相关。因此，需要提供以空间-时间受控方式诱导浅褐色脂肪细胞生源的基于聚合物的有效药物递送系统，以及制备此类系统的方法。
发明概述
本公开呈现了用于选择性诱导受试者中的脂肪细胞褐变的治疗剂。治疗剂包含诱导褐色和/或浅褐色脂肪细胞形成的至少一种化合物或组合物；和包囊所述至少一种化合物或组合物的聚合物，其中所述化合物或组合物经由物理相互作用或化学相互作用在所述聚合物内包囊，并且配置为接近白色脂肪组织(wat)
在一个优选的实施方案中，前述治疗剂上调解偶联蛋白-1(ucp1)表达。
在一个优选的实施方案中，前述治疗剂包含至少一种化合物或组合物，其是notch信号传导途径抑制剂。
在一些实施方案中，notch信号传导途径抑制剂上调ucp1,ppargc1a的表达。
在一个实施方案中，notch信号传导途径抑制剂选自γ-分泌酶抑制剂，包括二苯并氮卓(dbz)和(n-[n-(3,5-二氟苯乙酰基)-1-丙氨酰]-s-苯基甘氨酸叔丁基酯)(dapt)。
在一个优选的实施方案中，前述治疗剂包含形成微粒或纳米颗粒的聚合物。
在一个优选的实施方案中，前述治疗剂包含选自下组的聚合物：合成聚合物和天然聚合物。
在一个优选的实施方案中，前述治疗剂包含选自下组的聚合物：生物可降解聚合物和非可降解聚合物。
在一个优选的实施方案中，前述治疗剂包含从合成两亲性嵌段共聚物制备的一类人工囊泡，其中所述人工囊泡包含中空球体，所述中空球体含有以双层膜围绕的核心中的水性溶液。
在一个优选的实施方案中，前述治疗剂包含聚(乳酸-共-羟乙酸)(plga)的聚合物。
在一个优选的实施方案中，前述治疗剂是生物可降解的聚磷腈-γ-分泌酶抑制剂缀合物。
在一个优选的实施方案中，前述治疗剂包含至少一种化合物或组合物，其选自β-肾上腺素能活化剂(例如cl316、243和米拉贝隆)、儿茶酚胺(例如去甲肾上腺素)、ppar-γ激动剂(例如罗格列酮和噻唑啉二酮)、辣椒素酯类物质和辣椒素酯类物质样化合物(例如天国谷粒提取物)、脂肪炎症相关细胞因子(例如il4)、利尿钠肽(例如心房利尿钠肽(anp)、脑型利尿钠肽(bnp)和c型利尿钠肽(cnp))、fgf家族成员(例如fgf1、15/19、21)、bmp家族成员(例如bmp7、bmp8b)、甲状腺激素(例如t3和t4甲状腺激素s)和其受体激动剂(例如t3受体激动剂)、肌因子(例如鸢尾素和镍纹蛋白样(metrnl)、vegf家族成员(例如vegf-a)、notch抑制剂(例如γ-分泌酶抑制剂)、janus激酶抑制剂(例如托法替尼)、脾酪氨酸激酶抑制剂(例如r406)、前列腺素及其合成类似物、环加氧酶-2激动剂、视黄酸和视黄醛、视黄醛脱氢酶活化剂、腺苷及其受体活化剂、旁甲状腺激素相关蛋白(pthrp)、脂肪细胞因子(例如神经调节蛋白4、脂连蛋白)、食欲肽、和靶向前述因子相关信号传导途径的微小rna/sirna、或其组合。
在一个优选的实施方案中，前述治疗剂还包含所述聚合物中包埋的脂肪细胞、脂肪细胞前体细胞、或干细胞。
本公开还提供了递送治疗量的药物以诱导受试者中脂肪细胞褐变的方法。方法包括在聚合物基质系统内包囊所述药物，并且在wat附近释放所述药物，其中所述药物是诱导褐色和/或浅褐色脂肪细胞形成的化合物或组合物。
本公开还提供了治疗受试者中的肥胖的方法。方法包括使用前述治疗剂。
在一个实施方案中，递送治疗量的药物的前述方法还包括将脂肪细胞、脂肪细胞前体细胞、和干细胞接种到所述聚合物基质系统上以使用基于支架的组织工程原理工程化改造褐色/浅褐色脂肪组织。
在一个实施方案中，通过选自下列各项的任一种或下列各项的组合的物理相互作用形成所述聚合物基质系统内的所述药物的包囊：疏水性相互作用、亲水性相互作用、氢键键合、和分子间静电相互作用。
在一个实施方案中，经由至少一个官能团通过所述药物和所述聚合物之间的缀合连接形成所述聚合物基质系统内的所述药物的包囊。
在一个实施方案中，通过下列各项的任一种或下列各项的组合形成所述聚合物-药物缀合连接：胺反应、硫醇反应(例如硫醇点击反应)、羧酸反应、羟基反应、醛和酮反应、活性氢反应、光化学反应、和环加成反应(例如第尔斯-阿尔德反应、铜催化的叠氮化物-炔环加成(cuaac)、无铜的叠氮化物-炔huisgen环加成)。
在一个实施方案中，至少一个官能团选自包含下列各项的任一项或下列各项的组合的组：胺、硫醇、羧酸、醛、酮、芳香环上的活性氢位点、双烯、叠氮化物异硫氰酸盐、异氰酸盐、酰叠氮、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯、磺基-nhs、磺酰氯、醛、环氧化物、碳酸盐、芳基卤、亚氨酸酯、碳二亚胺(例如n,n’-二环己基碳二亚胺(dcc)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc))、磷酸烷基酯化合物、酸酐、氟苯基酯、羟基甲基膦、胍基基团、碘乙酰基衍生物、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰衍生物、芳基化剂、二硫化物衍生物、乙烯砜、苯基硫酯、顺铂、重氮基乙酸酯、羰基二咪唑、环氧乙烷(oxiranes)、n、n’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(dsc)、n-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯、卤代烃(alkylhalogen)、肼、马来酰亚胺、炔、和磷结合的氯(phosphorus-boundchlorine)。
在一个实施方案中，缀合连接包含下列各项的任一种或下列各项的组合：异硫脲、异脲、酰胺、磺胺(sulfonamide)、席夫碱(shift-base)、仲胺、氨基甲酸酯、芳香胺、脒、氨基磷酸酯、硫醚、二硫化物、β-硫代磺酰基、酯、氨基甲酸酯、腙、重氮基、2+4环加成、1,2,3-三唑、碳水化合物、氨基酸酯键。
在一些实施方案中，聚合物基质是合成聚合物，其包含下列各项的任一种或下列各项的组合：聚(脂肪族酯)(例如聚(丙交酯)(pla)、聚(ε-己内酯)(pcl)、聚(羟乙酸)(pga)、聚(乳酸-共-羟乙酸)(plga)、聚(三亚甲基碳酸酯)(ptmc)、聚二恶烷酮(pds)、聚(原酸酯)、聚酸酐、聚(酸酐-共-酰亚胺)、聚(酸酐-酯)、聚氨基甲酸酯(例如degrapols)、聚(癸二酸甘油酯)、聚(乙烯亚胺)、聚(丙烯酸)(paa)、聚乙二醇(peg)、聚(乙烯醇)(pva)、聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pnipam)、聚(恶唑啉)(例如聚(2-甲基恶唑啉和聚(2-乙基-2-恶唑啉)、寡(乙二醇)富马酸酯(opfs)、聚(富马酸丙烯酯)、聚(腈基丙烯酸烷基酯)、聚丙烯酸酰胺、合成聚(氨基酸)(例如聚(l-谷氨酸)(l-pga)和聚(天冬氨酸))、聚膦腈、和聚(磷酸酯)及其混合物。
在一些实施方案中，聚合物基质系统包含天然聚合物，所述天然聚合物包含下列各项的任一种或下列各项的组合：纤维蛋白、胶原、基质胶、弹性蛋白、弹性蛋白样肽、清蛋白、天然聚(氨基酸)(例如藻青素、聚(ε-l-赖氨酸)和聚(γ-谷氨酸))、和多糖(例如透明质酸、壳聚糖、葡聚糖、硫酸软骨素、琼脂糖、藻酸盐、和肝素)、及其混合物。
在一些实施方案中，聚合物基质系统包含非可降解聚合物。
这些非可降解聚合物包含下列各项的任一种或下列各项的组合：聚(乙基乙烯)(pee)、聚(丁二烯)(pbd)、聚(二甲基硅氧烷)(pdms)、和聚(苯乙烯)(ps)、聚(n-乙基-4-乙烯基吡啶)、聚(2,2-(甲基丙烯酸二甲基氨乙酯)、聚(乙烯亚胺)、聚(烯丙胺)、和聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、聚(丙烯酸)、聚(磺酸苯乙烯酯)、聚(硫酸乙烯酯)、和聚(3-甲基丙烯酸磺丙酯)、和聚丙烯酸酰胺、及其混合物。
在一些实施方案中，聚合物基质系统包含下列各项的任一种或下列各项的组合：线性、星形、超分支、和交联构造。
在一些实施方案中，基于聚合物的药物递送系统还包含一个或多个表面修饰，包括但不限于peg化或使用靶向脂肪细胞上的受体的配体。
本发明的这些和其它特征、方面和优点通过参考以下附图、相关描述和权利要求书将得以良好理解。
附图简述
图1a和1b显示了基于聚合物的药物递送系统，其包括通过(图1a)物理相互作用和(图1b)化学相互作用包囊在聚合物基质系统内的药物。
图2a是显示notch抑制剂dapt如何诱导培养的白色脂肪细胞的褐变和notch靶物的mrna水平的图。
图2b是显示notch抑制剂dapt如何诱导培养的白色脂肪细胞的褐变和褐色脂肪细胞相关基因的图。
图2c是显示蛋白质水平的western印迹。
图2d是显示dapt提高o2消耗速率(ocr)的图。*p<0.05，**p<0.01。
图3a是显示瘦蛋白缺陷型肥胖小鼠(lepob)中notch抑制改善肥胖并诱导褐变的小鼠背部图。
图3b是皮下wat和h&e染色的图像(右侧，比例尺100μm)。
图3c显示血浆葡萄糖测量。
图3d是显示皮下wat中脂肪细胞基因的相对表达的图。
图3e显示皮下wat的ucp1和gapdh蛋白水平。*p<0.05，**p<0.01。
图4是加载有dbz的plga微球的示意图，该微球能够持续释放dbz以诱导白色脂肪细胞转化为浅褐色脂肪细胞。
图5a是加载有fitc-葡聚糖的微球的荧光图像。比例尺200μm。
图5b是加载有dbz的plga微球的群体的sem图像。比例尺400μm。
图5c是单个加载有dbz的plga微球的较高放大率sem图像。比例尺50μm。
图5d是加载有dbz的plga微球的大小分布。
图6a和6b是来自plga微球的fitc-葡聚糖和dbz的体外释放概貌。图6a显示在ph7.4和37℃在pbs中从微球的fitc-葡聚糖的体外释放。图6b显示了在ph7.4和37℃在pbs中从微球的dbz的体外释放。
图7a-7f显示加载有dbz的plga微球在体外抑制notch并促进褐变。图7a是具有孔底上接种的原代白色脂肪细胞和置于可渗透插入物内的加载有dbz的微球的共培养系统的图。用bodipy标记成熟脂肪细胞(红色)。用dapi复染核(绿色)。与加载有dbz的plga微球共培养的白色脂肪细胞中的(图7b)notch靶基因、(图7c)褐变标志物、和(图7d)线粒体基因的表达。图7e显示与加载有dbz的plga微球共培养的白色脂肪细胞中pgc1-α的蛋白质水平。图7f显示了pgc1-α相对于gapdh的蛋白质水平的量化。dbz：dbz条件化培养基(10μm)中的细胞；ctrl：用dmso媒介物对照处理的细胞。n＝3。*p<0.05，**p<0.01。
图8a是显示用dmso处理的白色脂肪细胞的荧光图像(绿色，mitotracker；红色，redc12，比例尺，200μm)。
图8b是显示用plga-dbz微球处理的白色脂肪细胞的荧光图像(绿色，mitotracker；红色，redc12，比例尺，200μm)。
图8c是显示用dbz处理8天的白色脂肪细胞的荧光图像(绿色，mitotracker；红色，redc12，比例尺，200μm)。
图9a-9d显示加载有fitc-葡聚糖的微球对小鼠的注射的表征。图9a显示将微球直接注射到wt小鼠的腹股沟脂肪贮库中。图9b显示通过腹股沟脂肪组织的大体观察(grossobservation)鉴定的注射微球(蓝色箭头)。图9c是显示注射24小时后微球分布的荧光图像。图9d是代表性图像，其显示在由油红o染色标记的白色脂肪细胞中分散的加载有fitc-葡聚糖的微球的绿色荧光。绿色：fitc；红色：油红o。
图10a-10c显示加载有dbz的plga微球在体内诱导褐变。图10a显示h&e染色，其显示在wat贮库内分散的加载有dbz的plga微球(黄色箭头)。比例尺，200μm。图10b显示注射加载有dbz的plga微球后14天来自小鼠的腹股沟wat的h&e(顶部)和ucp1(底部)染色。比例尺，100μm。图10c显示注射加载有dbz的plga微球后14天来自小鼠的腹股沟wat的pgc1-α和ucp1的蛋白质水平。
图11是显示加载有dbz的微球注射的14天后脂肪细胞基因的相对表达(数值表示两个生物学重复的均值)的图。
图12是显示合成pphos-γ-分泌酶抑制剂偶联物系统的实施方案的图。
图13显示了加载有ftic-bsa的ps-b-(p4mvp)2聚合物体(polymersome)纳米颗粒的脂肪细胞摄取。用dapi染色核。绿色：fitc。
图14a-14c显示了聚合物体结构的实施方案。图14a是hpbd41-b-(p4mvp25)2聚合物体的tem图像。图14b是加载有2％dbz的hpbd41-b-(p4mvp25)2聚合物体的tem图像(比例尺：50nm)。图14c是加载有5％dbz的hpbd41-b-(p4mvp25)2聚合物体的tem图像(比例尺：50nm)。
图15显示在局部注射入腹股沟wat中后dbz-np胞内释放dbz以促进褐变的示意图。
图16显示了纳米颗粒制造和表征。(a)通过纳米沉淀法合成dbz-np的示意图。通过tem对dbz-np的形态进行表征。比例尺，200nm。(b)在ph5.0和7.4条件下来自dbz-np的dbz的体外释放概貌。
图17显示了与纳米颗粒的体外细胞相互作用。(a)在10(顶部)和60(底部)分钟内原代前脂肪细胞中加载有尼罗红的plga纳米颗粒的细胞摄取。用lysotrackergreen(ltg)染色晚期内体/溶酶体，并用赫斯特(hoechst)33342对核染色。比例尺为20μm。(b)内吞囊泡(左侧)和内体(右侧)中的纳米颗粒的代表性tem图像。箭头指向纳米颗粒。比例尺，500nm。
图18显示了dbz-np在体外诱导褐变。从腹股沟wat中分离svf细胞并在脂肪形成分化期间用dbz-np处理。(a，b)定量pcr分析，其显示用plga-np和dbz-np处理的分化的脂肪细胞中的notch靶基因(a)和褐变标志物基因(b)的mrna水平。(c)代表性的western印迹结果，其显示用plga-np和dbz-np处理的分化的脂肪细胞中hes1和pgc-1α的蛋白质表达水平。(d)相对于β-肌动蛋白对照标准化的hes1和pgc-1α的蛋白质水平的量化。(e)定量pcr分析，其显示用plga-np和dbz-np处理的分化脂肪细胞中cox5b的mrna水平。(f)相对于来自分化的脂肪细胞的总蛋白质标准化的在基础呼吸和质子渗漏(protonleak)条件下的ocr。数据显示为均值±s.e.m。n＝每组3只小鼠。*p<0.05，**p<0.01。
图19显示了dbz-np的局部保留促进腹股沟wat的褐变。(a)局部注射plga-cy5.5纳米颗粒到腹股沟wat贮库后24和48小时的体内荧光成像。(b)注射后72小时时不同组织的离体荧光成像。(c)代表性tem图像，其显示纳米颗粒位于脂肪细胞内。箭头指向纳米颗粒。点线和箭头分别指示细胞膜和膜囊泡。比例尺，500nm。(d，e)定量pcr分析，其显示来自用plga-np和dbz-np处理的小鼠的ucp1(d)和线粒体基因cox5b和cox7a(e)的mrna水平。数据显示为均值±s.e.m。n＝每组7只小鼠。*p<0.05。(f)用plga-np和dbz-np处理后腹股沟wat的h&e和ucp1染色的代表性图像。比例尺，50μm。
图20显示了dbz-np防止饮食诱导的肥胖症。(a)在相对于初始体重标准化后接受plga-np和dbz-np的小鼠的相对体重增加。(b)相对于体重标准化后，每只小鼠每天的平均能量摄入量。(c)量化在plga-np和dbz-np处理的情况下的腹股沟wat的重量。显示代表性图像。(d)对接受plga-np和dbz-np的小鼠进行的葡萄糖耐受性测试期间的血糖浓度和曲线下面积量化。(e)对用plga-np和dbz-np处理的小鼠进行的胰岛素耐受性测试期间的血糖浓度和曲线上面积量化。(f，g，h)来自用plga-np和dbz-np处理的空腹小鼠的葡萄糖(f)、胆固醇(g)和胰岛素(h)的血清水平的量化。数据以平均值±s.e.m呈现。n≥每组4只小鼠。*p<0.05，**p<0.01，n.s.非显著。
图21显示了dbz释放概貌的数学建模。在ph5.0(a)和7.4(b)下对korsmeyer-peppas模型拟合的来自dbz的dbz-db的体外释放概貌。数据显示为均值±s.e.m。n＝每组3只。
图22显示了纳米颗粒的离体细胞摄取。(a)代表性图像，其显示加载有尼罗红的纳米颗粒在成熟脂肪细胞中的细胞定位。用赫斯特染色核。(b)显示脂肪细胞内若干纳米颗粒的代表性tem图像。箭头指向纳米颗粒。虚线表示细胞膜。ld，脂质液滴。比例尺，2μm。
图23显示了来自用plga-np和dbz-np处理的空腹小鼠的血清学参数。(a，b)量化来自用plga-np和dbz-np处理的空腹小鼠的甘油三酯(a)和游离脂肪酸(b)的血清水平。(c)胰岛素抗性计算为胰岛素x游离脂肪酸。数据以均值±s.e.m呈现。n≥每组4只小鼠。*p<0.05，n.s.非显著。
图24显示了接受plga-np和dbz-np的小鼠肝脏中的脂肪酸代谢。(a)来自接受plga-和dbz-np的小鼠的肝切片的油红o染色的代表性图像。比例尺，20μm。(b，c，d)qpcr分析，其显示在用plga-np和dbz-np处理的小鼠的肝脏中的cptl(b)、atgl和hsl(c)和accl(d)的mrna水平。数据以均值±s.e.m呈现。n≥每组4只小鼠。*p<0.05。
表1.100mg纳米颗粒合成的优化参数。
表2.在ph5.0和7.4下从纳米颗粒释放dbz的数学模型检查。r2调节的akaike信息准则(aic)和用于模型选择(n＝3)的模型选择准则(msc)。最佳模型拥有r2调节的最高值、最低的aic值和最大的msc。
表3.本研究中使用的qpcr引物。
序列表简述
seqidno:1和2是用于hey1的正向和反向qpcr引物。
seqidno:3和4是用于heyl的正向和反向qpcr引物。
seqidno:5和6是用于hes1的正向和反向qpcr引物。
seqidno:7和8用于ucp1的正向和反向qpcr引物。
seqidno:9和10是用于ppargc1a的正向和反向qpcr引物。
seqidno:11和12是用于cidea的正向和反向qpcr引物。
seqidno:13和14是用于dio2的正向和反向qpcr引物。
seqidno:15和16是用于cox5b的正向和反向qpcr引物。
seqidno:17和18是用于cox7a的正向和反向qpcr引物。
发明详述
为了促进对本公开的原理的理解，现在将参考附图中显示的实施方案，并且将使用特定的语言来描述所述实施方案。然而，应该理解，在此不意图限制本公开的范围。
响应于未满足的需要，本文公开了基于聚合药物递送系统设计的新型治疗方法和系统以诱导脂肪细胞褐变，用于治疗和/或预防肥胖及其附随的代谢症状。
全球肥胖流行及其与慢性疾病相关的风险影响大于10％的全球人口。目前，肥胖治疗可用的药物很少。通常，那些疗法致力于通过刺激中枢神经系统抑制食欲或减少胃肠道内的营养物消化和吸收来减少能量摄入。然而，那些药物只产生适度的效果，并且通常伴随不愉快的、潜在有害的副作用。因此，开发备选的有效治疗策略具有正当理由。
肥胖主要是由于白色脂肪细胞中作为脂质存储的系统能量剩余，所述白色脂肪细胞的扩张导致肥胖。在大多数哺乳动物物种中显著存在的褐色脂肪细胞主要功能为消耗能量过剩(脂质)以产生热量，从而增加能量消耗和抵消肥胖。存在于白色脂肪组织(wat)中的相对鉴定的浅褐色脂肪细胞是可诱导的“褐色样”细胞，其可在环境温度或交感神经支配的控制下双向从白色脂肪细胞转化和转化为白色脂肪细胞。解偶联蛋白1(ucp1)(冷适应型浅褐色脂肪细胞产热的关键调节物)的表达升高与强烈的解偶联的呼吸和产热有关。值得注意的是，浅褐色脂肪细胞的活性与人瘦相关。因此，将白色脂肪细胞转化为浅褐色脂肪细胞(褐变)有望开发新的治疗剂以提高能量消耗并减少肥胖。
目前用于增强浅褐色脂肪细胞生源和功能的策略涉及遗传和药理学操作。然而，这些方法通常与对其它细胞/组织具有非有意的不利后果的风险相关，并且对浅褐色脂肪细胞生源的位置和时间程度几乎没有控制。例如，成纤维细胞生长因子21(fgf-21)的施用与骨损失的系统性副作用有关。
基于聚合物的药物递送系统实现持续的、空间-时间受控的药物释放，并且提供了优于常规药物递送的若干独特优点，包括连续药物释放、系统性副作用减少和患者依从性增加。可以通过调节聚合物的特性，如材料化学性质、分子量、疏水性/亲水性、表面电荷，降解和侵蚀机理来微调药物释放概貌。食品和药物管理局(fda)批准的几种产品包括gliadelwafer、药物洗脱支架、药物释放透皮贴剂、以及浸渍有抗生素的可吸收海绵或网孔。在本公开中，我们提供了基于聚合物的药物递送平台来诱导局部wat的褐变以治疗肥胖及其相关的代谢综合征。聚合递送平台能够实现有效药物，特别是notch抑制剂的受控和持续释放，用于在将含有聚合物的组合物施用到wat贮库后诱导脂肪细胞褐变。此效果的有效药物可以是还有待发现的化合物或组合物，其借助于聚合物的利用局部诱导脂肪细胞褐变。非限制性类别是能够诱导wat褐变的任何化合物或组合物。下文详细提供了示例性的化合物和组合物。
药物可以是诱导褐色和/或浅褐色脂肪细胞形成的治疗剂，诸如β-肾上腺素能活化剂(例如cl316、243和米拉贝隆(mirabegron))、儿茶酚胺(例如去甲肾上腺素)、ppar-γ激动剂(例如罗格列酮和噻唑啉二酮)、辣椒素酯类物质(capsinoids)和辣椒素酯类物质样化合物(例如天国谷粒(grainsofparadise)提取物)、脂肪炎症相关细胞因子(例如il4)、利尿钠肽(例如心房利尿钠肽(anp)、脑型利尿钠肽(bnp)和c型利尿钠肽(cnp))、fgf家族成员(例如fgf1、15/19、21)、bmp家族成员(例如bmp7、bmp8b)、甲状腺激素(例如t3和t4甲状腺激素)及其受体激动剂(例如t3受体激动剂)、肌因子(myokine)(例如鸢尾素(irisin)和镍纹蛋白样(meteorinlike)(metrnl)、vegf家族成员(例如vegf-a)、notch抑制剂(例如γ-分泌酶抑制剂)、janus激酶抑制剂(例如托法替尼(tofacitinib))、脾酪氨酸激酶抑制剂(例如r406)、前列腺素及其合成类似物、环加氧酶-2激动剂、视黄酸和视黄醛、视黄醛脱氢酶活化剂、腺苷及其受体活化剂、旁甲状腺激素相关蛋白(pthrp)、脂肪细胞因子(adipokine)(例如神经调节蛋白4，脂连蛋白)、食欲肽、和靶向前述因子相关信号传导途径的微小rna/sirna。
公开了notch信号传导在调控白色和浅褐色脂肪细胞的稳态中的新作用。已经发现了经由腹膜内注射二苯并氮卓(dbz)(一种γ-分泌酶抑制剂)抑制notch信号传导在肥胖小鼠中诱导白色脂肪细胞的褐变以及随之发生的降低的肥胖和改善的葡萄糖平衡。在本发明中可用作有效药物的notch抑制剂是γ-分泌酶抑制剂，例如二苯并氮卓(dbz)和(n-[n-(3,5-二氟苯乙酰基)-1-丙氨酰]-s-苯基甘氨酸叔丁基酯)(dapt)。
药物应当以按重量计0.1％至70％的百分比加载掺入本发明组合物中的聚合物中。药物释放动力学可以通过操作药物加载百分比、聚合物的性质以及用于制备和加载递送系统的方法来定制。
本发明包括通过将药物与聚合物基质系统组合来制备基于聚合物的药物递送系统的方法。可以从通过物理相互作用在聚合物基质系统中包囊治疗药物来配制基于聚合物的药物递送系统(图1a)。物理相互作用包括但不限于疏水相互作用、亲水相互作用、氢键和分子间静电相互作用。也可以从通过化学相互作用(例如聚合物-药物缀合)在聚合物基质系统内包囊治疗药物来配制基于聚合物的药物递送系统(图1b)。聚合物-治疗剂缀合反应包括但不限于胺反应、硫醇反应(例如硫醇点击反应)、羧酸反应、羟基反应、醛和酮反应、活性氢反应、光化学反应、和环加成反应(例如第尔斯-阿尔德反应、铜催化的叠氮化物-炔环加成(cuaac)、无铜的叠氮化物-炔huisgen环加成)。官能团r1和r2可以包括但不限于胺、硫醇、羧酸、醛、酮、芳香环上的活性氢位点、双烯、叠氮化物异硫氰酸盐、异氰酸盐、酰叠氮、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯、磺基-nhs、磺酰氯、醛、环氧化物、碳酸盐、芳基卤、亚氨酸酯、碳二亚胺(例如n,n’-二环己基碳二亚胺(dcc)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc))、磷酸烷基酯化合物、酸酐、氟苯基酯、羟基甲基膦、胍基基团、碘乙酰基衍生物、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰衍生物、芳基化剂、二硫化物衍生物、乙烯砜、苯基硫酯、顺铂、重氮基乙酸酯、羰基二咪唑、环氧乙烷(oxiranes)、n,n’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(dsc)、n-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯、卤代烃(alkylhalogen)、肼、马来酰亚胺、炔、和磷结合的氯(phosphorus-boundchlorine)。缀合的连接可以包括但不限于异硫脲、异脲、酰胺、磺胺、席夫碱(shift-base)、仲胺、氨基甲酸酯、芳香胺、脒、氨基磷酸酯、硫醚、二硫化物、β-硫代磺酰基、酯、氨基甲酸酯、腙、重氮基、2+4环加成、1,2,3-三唑、碳水化合物、氨基酸酯键。
聚合物基质系统可以包含合成聚合物，由合成聚合物组成，或基本由合成聚合物组成。合成聚合物包括但不限于聚(脂肪族酯)(例如聚(丙交酯)(pla)、聚(ε-己内酯)(pcl)、聚(羟乙酸)(pga)、聚(乳酸-共-羟乙酸)(plga)、聚(三亚甲基碳酸酯)(ptmc)、聚二恶烷酮(pds)、聚(原酸酯)、聚酸酐、聚(酸酐-共-酰亚胺)、聚(酸酐-酯)、聚氨基甲酸酯(例如degrapols)、聚(癸二酸甘油酯)、聚(乙烯亚胺)、聚(丙烯酸)(paa)、聚乙二醇(peg)、聚(乙烯醇)(pva)、聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pnipam)、聚(恶唑啉)(例如聚(2-甲基恶唑啉和聚(2-乙基-2-恶唑啉)、寡(乙二醇)富马酸酯(opfs)、聚(富马酸丙烯酯)、聚(腈基丙烯酸烷基酯)、聚丙烯酸酰胺、合成聚(氨基酸)(例如聚(l-谷氨酸)(l-pga)和聚(天冬氨酸))、聚膦腈、和聚(磷酸酯)、类脂质，及其混合物。在一些实施方案中，合成聚合物可以是具有50:50乳酸与羟乙酸比率的plga。
此外，聚合物基质系统可以包含天然聚合物。天然聚合物可以包括但不限于纤维蛋白、胶原、基质胶、弹性蛋白、弹性蛋白样肽、清蛋白、天然聚(氨基酸)(例如藻青素、聚(ε-l-赖氨酸)和聚(γ-谷氨酸))、和多糖(例如透明质酸、壳聚糖、葡聚糖、硫酸软骨素、琼脂糖、藻酸盐、和肝素)、脂质，及其混合物。
聚合物基质系统可以包含非可降解聚合物。非生物可降解聚合物包括但不限于聚(乙基乙烯)(pee)、聚(丁二烯)(pbd)、聚(二甲基硅氧烷)(pdms)、和聚(苯乙烯)(ps)、聚(n-乙基-4-乙烯基吡啶)、聚(2,2-(甲基丙烯酸二甲基氨乙酯)、聚(乙烯亚胺)、聚(烯丙胺)、和聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、聚(丙烯酸)、聚(磺酸苯乙烯酯)、聚(硫酸乙烯酯)、和聚(3-甲基丙烯酸磺丙酯)、和聚丙烯酸酰胺，及其混合物。
聚合物基质系统可以包括聚合物复合材料。例如，可以将聚合物-聚合物混合物配制成协同组合亲本聚合物的有益性质。可以获得组合具有不同释放速率的聚合物混合物的复合材料以实现期望的释放概貌。
聚合物基质系统可以包括聚合物缀合物。将药物直接缀合到聚合物主链上有助于确保高的药物加载效率和在靶位置处持续的药物释放。药物释放动力学可以通过改变聚合物-药物连接的性质和水解敏感度来调整。此类聚合物-药物缀合物系统也可以用于开发三维基质以研究细胞-胞外微环境相互作用或生成用于移植的工程化褐色脂肪。
聚合物基质系统可以包括但不限于线形、星形、超分支和交联结构。
聚合物基质系统可以进一步包含一个或多个表面修饰，包括但不限于peg化或使用靶向脂肪细胞上受体的配体。
本发明还提供了通过在要实现脂肪褐变的部位处注射或手术植入对受试者施用要求保护的聚合物递送系统组合物的方法。局部递送允许将治疗浓度的药物递送至wat贮库，而使系统性副作用最小化。该方法还可以包括施用治疗量的药物以诱导受试者内脂肪细胞褐变的步骤。在又一个实施方案中，呈现了治疗受试者肥胖的方法。聚合物系统可以具有适合于以板(slabs)、珠、团粒、水凝胶、微粒、纳米颗粒或其组合形式递送至部位的任何大小。聚合物药物系统可以通过许多公认的技术制造，包括溶剂浇铸(solventcasting)、水包油乳液/溶剂蒸发、喷雾干燥或使用溶剂/非溶剂系统沉淀。在优选的实施方案中，聚合物系统将为颗粒的形式。例如，在一些方面中，聚合物系统包含配置用于注射到受试者的wat中的微粒。在其它方面中，聚合物系统包含配置用于注射到受试者的wat中的纳米颗粒。
可以将脂肪细胞、脂肪细胞前体细胞和干细胞与聚合物基质系统组合，以使用基于支架的组织工程原理工程化改造褐色/浅褐色脂肪组织作为新型治疗剂，以治疗肥胖和相关疾病。在一个实施方案中，可以通过脂肪组织生检从受试者中收获细胞。然后，将细胞接种到模拟天然胞外基质的三维聚合支架上。在体外培养后，可以将细胞/支架构建体移植回受试者。在移植前，可以应用多种化学和生物因子(例如褐变剂)和机械刺激(例如生物反应器)以促进的组织生成过程。在一个实施方案中，公开了生物可降解的加载有notch抑制剂的plga微球系统。具有预先确定的降解和药物释放概貌的可生物降解的聚合物微球是开发用于多种应用的有效药物递送系统的焦点，所述应用包括癌症、心血管疾病和疫苗开发。在已经用于药物递送的各种聚合物中，由于生物相容性、生物可降解性和便利的可加工性，plga(乳酸和羟乙酸的共聚物)已经是特别突出的。plga微球的药物释放动力学可以通过调节plga的微球大小、分子量和组成来控制。
在一个实施方案中，公开了生物可降解聚磷腈-γ-分泌酶抑制剂缀合物系统。具有交替磷和氮原子的主链的聚膦腈(pphos)由于合成灵活性、聚合物性质的可调性(tunability)和生物相容性而代表用于药物递送的独特材料类别。每个磷原子带有两个有机取代基，具有可用于特性优化的多个侧基。由pphos降解引起的侧基的释放使得能够使用前药概念合理设计基于pphos的递送系统。可以使用水解敏感性键将诸如γ-分泌酶抑制剂的药物分子作为侧基直接附接到聚合物链上作为药物递送的贮库。
另一个实施方案中，公开了包含聚合物体的基于纳米颗粒的药物递送系统。聚合物体是由合成两亲性嵌段共聚物制成的一类人工囊泡。典型的聚合物体是中空球体，其含有双层膜包围的核心中的水性溶液。双层膜由在膜的疏水中间部分的内侧和外侧的水合亲水性冠层(coronas)构成，从而将流体核心与外部介质分开并且保护流体核心。嵌段共聚物包含两个或更多个均聚物嵌段。每个嵌段与聚合物中具有独特物理化学性质的特定单体或单体组合聚合。在那些实施方案中，疏水性嵌段包括但不限于非可生物降解的聚(乙基乙烯)(pee)、聚(丁二烯)(pbd)、聚(二甲基硅氧烷)(pdms)、和聚(苯乙烯)(ps)以及生物可降解聚(丙交酯)(pla)、聚(ε-己内酯)(pcl)和聚(三亚甲基碳酸酯)(ptmc)等；在那些实施方案中，亲水性嵌段包括但不限于聚(n-乙基-4-乙烯基吡啶)、聚(2,2-(二甲基氨基甲基丙烯酸乙酯)、聚(乙烯亚胺)、聚(烯丙胺)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、聚(丙烯酸)、聚(磺酸苯乙烯酯)、聚(硫酸乙烯酯)、聚(3-甲基丙烯酸磺丙酯)、聚乙二醇、聚(2-甲基恶唑啉)、聚(2-乙基-2-恶唑啉)、和聚丙烯酸酰胺等。聚合物体可用于通过物理相互作用(例如疏水相互作用、亲水相互作用、氢键键合和分子间静电相互作用)或通过聚合物内的化学相互作用(例如聚合物-药物缀合)来包囊治疗性分子。聚合物体的水性核心可用于亲水性治疗分子的包囊。膜可以将疏水性药物掺入其疏水性核心内。
在另一个实施方案中，通过利用notch信号传导在脂肪细胞可塑性中发挥的作用的发现和基于纳米颗粒的胞内药物释放在增强治疗效力并将潜在的副作用最小化中的益处，公开了包含plga和dbz的生物可降解的基于纳米颗粒的药物递送系统(dbz-np)。可以通过将靶向部分与纳米颗粒缀合实现系统施用情况下的细胞或组织特异性递送。例如，已经报告了一种特定肽ckggrakdc(seqidno:20)和抗增殖蛋白(脂肪组织中的血管标志物)之间的相互作用促进纳米颗粒靶向到脂肪组织中的血管系统。
在备选的实施方案中，可以用于递送药物(例如，褐变剂)的其它聚合物系统包括但不限于纳米载体、微粒、水凝胶、纤维基质、速溶片(wafer)或膜、胶囊、贴剂和可植入药物递送装置。
尽管在本公开中提到肥胖的应用，但是应当理解，此类应用并非旨在限制本文所述的方法和系统的应用。此类基于聚合物的使能技术平台可以容易地适用于治疗范围广泛的疾病，诸如脂肪肝疾病和动脉粥样硬化。
重要的是，我们已经证明dbz-np的局部递送防止了hfd诱导的肥胖并且改善了肝脏中的葡萄糖稳态以及脂肪酸代谢，验证了wat中的notch抑制对系统性代谢概貌的直接调节作用。通过局部操作引起的这些系统性益处与先前的公开文献一致，即来自运动训练小鼠的皮下wat或来自正常小鼠的bat的移植显著改善了葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性25,26。仍然难懂的是这些代谢益处是否是由于葡萄糖和脂肪酸的摄取升高所致或另外涉及由转化的浅褐色脂肪细胞分泌的其它内分泌因子。
实施例1：抑制notch信号传导促进白色脂肪细胞的褐变：
notch信号传导途径对于发育过程中的细胞-细胞通讯和细胞命运决定是重要的，并且是成体组织稳态所需要的。notch靶基因hairy/enhancer-of-split1(hes1)直接结合prdomain-containing16(prdm16)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(pparγ)、和pparγ共激活物1α(ppargc1a)的启动子以抑制它们转录。这导致减少的线粒体生源和降低的ucp1水平。
notch信号传导的药理学抑制在体外培养期间诱导白色脂肪细胞的褐变。在培养的白色脂肪细胞中用γ-分泌酶抑制剂dapt(n-[n-(3,5-二氟苯乙酰基)-1-丙氨酰]-s-苯基甘氨酸叔丁基酯)抑制notch信号传导。dapt抑制notch信号传导，并且上调褐色脂肪特异性基因ucp1、cidea、prdm16和ppargc1a的表达(图2a-2c)。此外，用dapt处理的脂肪细胞比那些用dmso处理的细胞表现出更高的氧消耗速率(ocr)，如在发生褐变时预期的那样(图2d)。
wat是大多数脊椎动物物种中长期储存能量的主要部位。响应过量的卡路里摄入，wat的大小通过脂肪细胞的增生和肥大而扩大。响应于暴露于寒冷的环境温度，交感神经系统释放儿茶酚胺，其结合β-肾上腺素能受体并通过camp途径激活脂解。脂解产生的脂肪酸可以直接激活ucp1以进行产热。因此，理解有效发挥功能以调节脂肪细胞稳态的途径对于治疗肥胖是至关重要的。最近已经报告notch信号传导在体内调节白色和浅褐色脂肪细胞的可塑性(转化)中起作用，因此影响身体能量代谢。由ap2-cre驱动的notch1或rbpj的脂肪细胞特异性消融导致wat中各种脂肪贮库的大小减小和浅褐色脂肪细胞的相对丰度增加，伴随实验动物中增加的代谢速率、改善的葡萄糖耐受性、和胰岛素敏感性。这些表型与wat而非bat中浅褐色脂肪细胞特异性基因的表达水平升高有关。另外，消减notch1或rbpj的小鼠表现出响应寒冷环境的加速的褐变(在wat内出现浅褐色脂肪细胞)。脂肪特异性notch1突变体小鼠也对hfd诱导的肥胖具有抗性。在确认notch信号传导在脂肪组织中的作用的最初努力中，显示了使用高度脂肪细胞特异性脂连蛋白-cre小鼠激活notch信号传导抑制wat的褐变并诱导bat的白化，以典型的肩胛间bat中脂质沉积和白色脂肪细胞出现表现。脂连蛋白-cre诱导的notch激活也使小鼠变成葡萄糖不耐受且胰岛素抗性的。这些表型与notch缺陷小鼠中观察到的表型形成鲜明对比。
为了评估notch抑制在病理条件下体内改善肥胖的程度，用二苯并氮卓(dbz，γ-分泌酶抑制剂)处理瘦蛋白缺陷的ob/ob小鼠(lepob)。值得注意的是，dbz处理减弱在媒介物处理的对照组中看到的体重增加而不影响能量摄入。在经dbz处理的小鼠中相比于媒介物处理的小鼠中，体重差异与各种wat贮库的更小尺寸和更轻重量相关(图3a，b)。相对于对照，经dbz处理的小鼠也表现出改善的葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性(图3c)。与降低的肥胖一致，经dbz处理的小鼠与对照小鼠相比显示更低的呼吸交换率(respirationexchangeratio)，指示dbz施用引发代谢向利用脂肪作为相关能量源转变。在分子水平上，dbz施用导致对notch靶物hes1、hey1和heyl，以及lep表达的抑制，但是上调wat中ucp1和ppargc1a的表达(图3d，e)。dbz施用还导致抑制与人肥胖相关的由cd68、il6和il1b编码的炎性细胞因子的表达。在实验完成时，进食的血糖浓度在存在dbz注射的情况下仍然较低，提示脂肪褐变对葡萄糖代谢的长期有益影响。
然而，与多次定期药物注射要求相关的潜在顺从性问题以及体内广泛药物分布的安全性和效力问题为此发现的临床转化带来了重大障碍。因此，迫切需要开发新的药物输送系统，其允许notch抑制剂如dbz对脂肪组织的选择性空间-时间递送。
实施例2：基于plga微球的dbz递送系统促进wat的褐变用于治疗肥胖：
在本实施例中，公开了基于plga微球的dbz递送系统来促进wat的褐变以治疗肥胖(图4)。使用具有50:50丙交酯与乙交酯比率的plga，因为该特定聚合物在plga家族中具有相对较快的降解速率，这有利于诱导褐变。我们使用乳液/溶剂蒸发技术配制加载有dbz的plga微球，并表征那些微球的形态和释放概貌。此外，我们证明加载有dbz的plga微球抑制notch，并因此体外和体内促进褐变。据我们所知，这是第一次开发有效的生物工程系统来递送治疗剂，以将白色脂肪细胞转化为浅褐色脂肪细胞。这项研究不仅有助于我们理解褐变过程中notch抑制的潜在机制，而且为开发新的治疗策略以抵消肥胖及其伴随的人类代谢综合征铺平了道路。
材料和方法：
材料：
从lakeshorebiomaterials获得plga(丙交酯:乙交酯50:50；mw＝75,000)。聚(乙烯醇)(pva；87-90％水解，平均mw＝30,000-70,000)，异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(fitc-葡聚糖)(mw＝70,000)和dbz获自sigma。二氯甲烷(methylenechloride，dcm)、二甲亚砜(dmso)和乙腈购自fisherscientific。
动物：本研究中使用的所有小鼠都是在清洁设施中保持正常维护的野生型瘦小鼠。所有关于动物维护和实验使用的程序均按照规定进行。
加载有fitc-葡聚糖的微球配制和表征
通过水包油包水(wow)双重乳化技术制备加载有fitc-葡聚糖的plga微球。简言之，将0.4gplga溶于4mldcm中。向此有机相(o)中，使用以1,000rpm操作3分钟的涡旋混合器将330μl含有约3.7mgfitc-葡聚糖的水性溶液(w1)乳化以形成w1/o乳液。将该初级乳液注射到400ml含有1％(w/v)pva(w2)的水相中。使用高架磁力搅拌器(overheadmagneticstirrer)以400rpm将得到的w1/o/w2乳液搅拌过夜，以使溶剂蒸发并使微球硬化。然后通过离心分离微球，用蒸馏水清洗三次，并在真空烘箱中干燥24小时。在干燥器中贮存终产物。通过荧光显微术(evosfl)对加载有fitc-葡聚糖的plga微球成像。
加载有dbz的微球配制和表征
通过水包油(o/w)乳液/溶剂蒸发技术制备加载有dbz的plga微球。油相具有溶解于2.7mldcm中的540mgplga和10.8mgdbz。将该油相注射入400ml含有1％(w/v)pva的水相中，对其以600rpm搅拌以实现o/w乳液系统。用高架磁力搅拌器将所得乳液搅拌过夜，以使溶剂完全蒸发并将液滴固化成微球。然后，通过离心分离微球，用蒸馏水清洗三次，并在真空烘箱中干燥24小时。在干燥器中贮存终产物。通过扫描电子显微术(sem)(novananosem)研究微球表面结构。使用image-j软件测量微球直径，并且随机选择约130个微球进行分析。
通过沉淀法分析微球中dbz的含量。将5mg加载有dbz的plga微球完全溶于氯仿中。一旦溶解，将氯仿溶液逐滴添加到离心管中的4ml甲醇以溶解dbz并沉淀plga。收集上清液中的dbz并在氮气流下浓缩。然后，将dbz在真空烘箱中干燥过夜并溶于10ml2:1乙腈与millipore水。将产物过滤以进行高效液相层析(hplc)分析(thermohplc)。在五氟苯丙基柱上以1ml/min的流速使用乙腈与0.1％磷酸(50:50)的流动相和在232nm下进行uv检测分析样品。一式两份测量每个样品。使用以下等式计算实际药物加载和药物包囊效率：
从微球的体外fitc-葡聚糖释放
通过在ph7.4的5mlpbs-缓冲液中悬浮约20mg微球测量从微球释放的fitc-葡聚糖。将样品置于维持于37℃并以200rpm摇动的摇动器中。以预先确定的时间间隔，将样品从摇动器中取出并以1000g离心2分钟。将2ml培养基等分取样用于分析，然后添加等体积的新鲜培养基。将沉淀的微球团粒重悬于培养基中并放回到摇动器中。一式三份研究fitc-葡聚糖的体外释放。使用标准校准曲线，荧光测定水相中的fitc-葡聚糖浓度(激发：485nm，发射：520nm，synergyh1微板读板仪)。
从微球的体外dbz释放
在ph7.4和37℃的pbs中对加载有dbz的plga微球表征药物释放达6天。使用hplc测量dbz释放。简言之，将20mg样品置于单独的离心管中，并填充2.5ml的pbs。然后将样品放入维持于37℃并以200rpm摇动的摇动器中。在特定的时间点，取出1ml培养基，保存用于分析，并用相同量的新鲜pbs替换。选择时间点使得维持完全的漏槽状态(sinkcondition)。用1ml氯仿萃取每个上清液样品。然后分离有机层并允许蒸发。然后，将干燥的dbz用1ml的40％乙腈水溶液重建以提供用于hplc分析(thermohplc)的合适溶液。
原代前脂肪细胞的分离
从肢体皮下wat贮库收集原代前脂肪细胞并切碎成2-5mm2块。然后，将这些块在37℃下在搅拌的情况下进行1.5mg/ml胶原酶消化1.5-2小时。用含有10％胎牛血清(fbs)的dulbecco改良eagle培养基(dmem)终止消化。此后，去除漂浮的成熟脂肪细胞并通过100μm筛网过滤细胞悬浮液，然后以450g短暂离心5分钟。将团粒重悬并接种到组织培养板上。
原代前脂肪细胞与微球的共培养
将原代前脂肪细胞在含有dmem、20％fbs和1％青霉素/链霉素的生长培养基中在37℃和5％co2下培养。每隔一天更换培养基。汇合后，将细胞经受含有dmem、10％fbs、2.85μm胰岛素、0.3μm地塞米松和0.63mm3-异丁基-甲基黄嘌呤的诱导培养基达4天，接着再经受含有dmem、200nm胰岛素、和10nm三碘甲状腺原氨酸达4天。同时，在诱导细胞进行脂肪形成分化时将5mg聚合物微球加入悬浮于24孔板的每孔中的可渗透的transwell插入物中。其它平行处理组包括dbz条件化培养基(10μm)中的细胞和dmso媒介物对照中的细胞。为了监测脂肪形成分化，分别用bodipy(redc12)和dapi复染培养过程中脂质液滴和脂肪细胞的核。
定量聚合酶链式反应
通过trizol从细胞培养物提取总rna。使用随机六聚体引物逆转录以合成cdna。用rochelightcycler96仪(roche)进行定量聚合酶链式反应(qpcr)。将18srrna作为用于标准化的内部对照应用。对于qpcr结果分析，使用2-δδct方法来计算倍数变化。
蛋白质提取和western印迹分析
使用含有50mmtris-hcl(ph8.0)、150mmnacl、1％nonidetp-40、0.5％脱氧胆酸钠和0.1％十二烷基硫酸钠(sds)的ripa缓冲液从细胞或组织样品中提取总蛋白质。通过使用piercebca蛋白质测定试剂(piercebiotechnology，rockford，il，usa)测量蛋白质浓度。通过sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离蛋白质，然后转移至聚偏二氟乙烯(pvdf)膜(milliporecorp.，billerica，ma)。将膜在5％乳中封闭1小时，并在4℃下与一抗温育过夜。pgc1-α(sc-13067)和gapdh(sc-32233)抗体购自santacruzbiotechnology，并且二者均以1:1,000稀释。缀合有辣根过氧化物酶(hrp)的二抗(抗兔igg，7074s，cellsignaling)以1:5,000稀释。使用chemidoctm触摸成像系统(touchimagingsystem)(bio-rad)检测信号。用bio-radimagelabv5.2.1进行光密度量化，对各道进行分析。
体内注射plga微球
首先通过氯胺酮-赛拉嗪(xylazine)混合物麻醉小鼠，然后将加载有fitc-葡聚糖的plga微球或加载有dbz的plga微球(20mg/30g体重)在1ml0.5％methocele4m(wt/vol；dowchemical)和0.1％tween-80(wt/vol；sigma)的水溶液中注射到身体一侧的腹股沟wat贮库中。类似地，将plga微球注射到对侧腹股沟wat贮库中。在注射后24小时和14天后收集脂肪组织分别用于对加载有fitc-葡聚糖的plga微球和加载有dbz的plga微球进行研究。进行油红o染色以标记脂肪细胞用于对加载有fitc-葡聚糖的plga微球的研究，而进行苏木精和曙红(h&e)和免疫组织化学染色用于对加载有dbz的plga微球的研究。
h&e和免疫组化染色
在室温下将脂肪组织在10％福尔马林中固定24小时。然后，将组织包埋在石蜡中并切成4μm厚的切片，脱石蜡，并通过标准方法用二甲苯、乙醇和水再水合。在dakoautostainer(dako)上进行免疫组织化学。将载玻片与3％过氧化氢和2.5％正常马血清(s-2012，vector)一起温育，然后与在2.5％正常马血清(s-2012，vector)中1:200稀释的兔多克隆抗ucp1一抗温育60分钟。用抗兔igg聚合物检测试剂盒(mp-7401，vector)检测信号。用3,3’-二氨基联苯胺(dab)作为色原体(sk-4105，vector)显现标记。将载玻片用harris苏木精(ekindustries)复染，并用aperioscanscope载玻片扫描仪(aperio)收集全载玻片数字图像。统计分析
定量数据报告为均值±s.e.m。通过双尾student’st检验(two-tailedstudent’st-test)计算p值。认为p<0.05是统计学显著的。
结果：
plga微球的配制和表征
使用plga50:50，制备加载有药物的plga微球并表征药物分布和形态特征。我们首先将fitc-葡聚糖(一种常用的荧光探针)包囊到plga微球中，以通过荧光显微术评估fitc-葡聚糖在微球中的分布。观察到绿色荧光均匀分布在整个微球中(图5a)。接下来，我们通过优化工艺参数(如pva浓度和搅拌速度)以获得50-150μm的窄微球大小范围来配制加载有dbz的plga微球(图5b)。较高的放大率sem显微照片揭示了微球的平滑表面形态(图5c)。加载有dbz的plga微球的大小分布类似于高斯分布,其中在90-110μm范围内具有超过50％(图5d)。实际的dbz加载百分比表征为约1.4％(w/w)，相当于约68％的dbz包囊效率。
plga微球系统实现fitc-葡聚糖和dbz释放
为了检查从plga微球的货物药物释放能力，我们首先将加载有fitc-葡聚糖的plga微球置于37℃的pbs中，并通过荧光测定法量化释放。加载有fitc-葡聚糖的plga微球显示快速释放概貌，其导致在24小时后释放约50％的总fitc-葡聚糖(图6a)。这推测是由于fitc-葡聚糖的亲水性质。我们进一步表征从加载有dbz的plga微球的dbz的释放概貌(图6b)。一般来说，从plga微球的dbz释放速率比fitc-葡聚糖的释放速率慢得多。在前24小时内约2％的dbz从plga微球中释放出来。此后释放速率显著降低，在6天内释放约3％dbz(约8μg)，指示dbz可以以持续方式从plga释放。
加载有dbz的plga微球在脂肪细胞中促进褐变
作为初步尝试测试从plga微球释放的dbz的生物活性，我们将加载有dbz的plga微球与原代脂肪细胞共培养并检查细胞响应(图7a)。在诱导脂肪形成分化8天后，我们观察到以bodipy免疫荧光为特征的经典脂质液滴(图7a)，这提示了微球对细胞培养未引起明显的不利影响。然后，我们继续分析notch靶物和产热基因的mrna水平。加载有dbz的plga微球显著抑制notch，其通过notch靶基因hes1和heyl的40％mrna减少证明(图7b)。重要的是，加载有dbz的plga微球显著提高褐变标志物包括ucp1、cidea和ppargc1a(图7c)以及线粒体基因，包括cox5b、cox7a、cpt1a和cpt2(图7d)的mrna水平，提示了从plga微球释放的dbz可以抑制notch途径并因此促进褐变。此外，western印迹结果证明了加载有dbz的plga微球将pgc1-α(由ppargc1a编码)的蛋白质水平显著升高约3.5倍(图7e和7f)，其在线粒体生源和氧化代谢中起关键作用。细胞培养8天后，与用dmso处理的对照组相比，观察到用dbz处理的脂肪细胞的线粒体密度的显著增加(图8a-8c)。redc12与mitotracker阳性结构存在重叠，指示dbz处理后脂肪酸摄取和线粒体的潜在协同增强。潜在重要的是，加载有dbz的微球还导致脂肪细胞中更多的线粒体以及redc12与mitotracker的重叠。所有这些数据共同证实，dbz在体外从plga微球中释放后仍具有生物活性以诱导褐变。
加载有dbz的plga微球在体内刺激褐变
为了进一步测试plga微球是否可以局部递送dbz并体内促进褐变，我们试图将微球直接注射到小鼠腹股沟wat贮库并在此后评估褐变效应(图9a)。最初，为了确保可以将微球精确注射到贮库中，我们利用加载有fitc-葡聚糖的微球追踪微球位置。通过靶腹股沟脂肪组织中的大体观察，用绿色荧光容易地鉴定微球注射部位(图9b)。注射24小时后，加载有fitc-葡聚糖的微球保持具有扩展荧光的圆形形态，指示在此段时间内从微球释放fitc-葡聚糖(图9c，d)。此观察结果也与我们之前关于体外fitc-葡聚糖释放概貌的结果一致。
我们接下来使用相同的程序将加载有dbz的plga微球注射到腹股沟wat贮库中。在注射14天后，收集腹股沟wat并加工以进行石蜡包埋和切片处理。通过h&e染色，我们观察到加载有dbz的plga微球分散在wat中并维持50-150μm大小范围内的圆形形态。重要的是，这些微球不引起任何显著的炎症反应(图10a)。值得注意的是，加载有dbz的plga微球大大减少了成熟白色脂肪细胞的大小(图10b)，这是褐变效应的标志指标。使用加载有dbz的plga微球，多泡ucp1+浅褐色脂肪细胞明显丰富(图10b)。此外，褐变的此种形态特征得到组织样品的western印迹进一步支持，所述组织样品表现出与对照相比在加载有dbz的微球组中的pgc1-α和ucp1蛋白水平增加(图10c)。此外，用加载有dbz微球注射的小鼠相对于对照表现出线粒体基因(cox5b)以及褐色脂肪特异性基因如ppargc1a和cidea的表达增加(图11)。所有这些数据证明了dbz成功地从微球释放并且保持其notch抑制生物学活性以促进体内褐变。
越来越多的证据表明，区别浅褐色脂肪细胞与白色脂肪细胞的显著代谢差异潜在可以成功用于建立治疗和/或预防肥胖的新治疗策略。因此，鉴定和靶向褐变的根本机制对于减少肥胖的有效治疗剂的开发至关重要。notch信号传导途径对于发育过程中的细胞-细胞通讯和细胞命运决定是重要的，并且是成体组织稳态所需要的。notch靶基因hairy/enhancer-of-split1(hes1)抑制prdomain-containing16(prdm16)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(pparγ)共激活物1α(ppargc1a)和pparγ(在褐色脂肪细胞生源中都至关重要)的转录。这导致减少的线粒体数量和ucp1表达。值得注意的是，已发现通过腹膜内注射dbz抑制notch信号传导在肥胖小鼠中诱导白色脂肪细胞的褐变以及因此减少的肥胖和改善的葡萄糖平衡。此策略可以开辟另一条治疗肥胖及其相关代谢疾病的新途径。然而，与多次定期药物注射要求相关的潜在顺从性问题，结合身体中广泛药物分布的安全性和功效性问题降低此治疗的转化潜力。例如，已经提出了notch抑制影响多种生物学过程，如血管生成、骨形成和肌生成。因此，在载体系统能够以持续方式对wat局部递送dbz以治疗肥胖时将是有益的。
基于聚合物的受控药物递送系统提供了优于传统药物递送的若干独特优点，包括连续药物释放、降低的系统性副作用和增加的患者顺从性。在受控药物递送中聚合物降解是高度期望的，因为它消除了对手术除去植入物的需要。已知plga通过将酯键简单水解成乳酸和羟乙酸而降解，所述乳酸和羟乙酸最终代谢为二氧化碳和水。已经广泛研究了plga微球作为载体递送多种治疗剂。通过扩散和聚合物降解两者来控制从plga微球中释放包囊剂。可以通过改变共聚物组成、分子量和微球大小来调整药物释放动力学。特别是，plga的降解速率取决于共聚物组成。随着乙交酯含量的增加，水解期间的分子量损失加速。这归因于聚合物基质对水的较多吸收。例如，plga按照plga50:50(1-2个月)<plga75:25(4-5个月)<plga85:15(5-6个月)的顺序表现出降解时间。具有较高分子量的聚合物导致较慢的降解速率。此外，plga微球的大小是药物扩散和聚合物降解的重要控制因素。berchane等人证明了吡罗昔康(piroxicam)从plga微球的初始爆发释放速率随着微球大小从13.9μm增加到81.2μm而下降，这与fick扩散定律一致，因为扩散途径的增加会降低药物释放速率。已经报告了大微球以异质性方式降解，其中核心中的降解速率大于表面处的降解速率。相反，直径小于300μm的微球经历同质性降解，其中核心降解速率等同于表面的降解速率。由于酸性降解产物的积聚减少，小微球也比大微球更慢地降解。体外释放研究显示制造的具有大小范围50-150μm的加载有dbz的plga微球能够缓慢释放dbz，导致在6天内释放约3％的包囊药物。此种逐渐释放特别有益于规避多次定期注射dbz以诱导褐变的需要。
原代前脂肪细胞与加载有dbz的plga微球的共培养证明释放的dbz保持其生物活性并且有效地抑制notch信号传导并上调褐色脂肪特异性基因的表达(图7)。例如，使用dbz和加载有dbz的微球两者的培养的白色脂肪细胞中notch下游靶物hes1和heyl的表达降低超过40％，指示从聚合物释放的dbz的生物活性。此外，加载有dbz的微球导致褐变标志物(包括ucp1、cidea和ppargc1a)以及线粒体基因(包括cox5b、cox7a、cpt1a和cpt2)的表达升高。值得注意的是，褐色和浅褐色脂肪细胞含有比白色脂肪细胞更多的线粒体，并且拥有燃烧脂质(通过β-氧化)产生热量的能力。已知pgc1-α(由ppargc1a编码)也诱导脂肪细胞中ucp1和其它产热成分的表达。我们的结果也符合我们早先使用dbz对白色脂肪细胞褐变的发现。与dbz单独组相比，plga-dbz处理组中的ucp1和cideamrna水平的更显著的增加据推测是由于dbz从微球的持续释放，这应当已经改善dbz的生物学活性，因此突出显示了我们的药物递送系统用于诱导性褐变的主要优点。
开发有效的基于聚合物的药物递送系统的最重要的要求之一是组织相容性。plga聚合物由于其公认的生物相容性而被认为是药物递送的标准，并且被食品和药物管理局批准用于多种临床应用。在体内注射到wat贮库中后，加载有dbz的plga微球耐受良好(图10a)。更重要的是，我们证明加载有dbz的微球局部注射在14天后成功诱导wat的褐变(图10b和10c)。产生的褐变进一步验证notch信号传导在体内调节白色和浅褐色脂肪细胞的可塑性中起作用。
wat是长期储能的主要部位。响应过量的卡路里摄入，wat的大小通过脂肪细胞的增生和肥大而扩大。我们的工作查明了聚合微球作为载体平台以持续的方式将dbz局部递送到wat的潜力。此类局部递送系统可以消除重复注射的需要以及伴随dbz系统施用的潜在副作用。对褐色和浅褐色脂肪细胞生物学的了解增加已经导致最近发现多种因子促进wat褐变，如成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白(bmp)、鸢尾素、t3和t4甲状腺激素、利尿钠肽、和β3-肾上腺素能途径激动剂。然而，与dbz一样，对这些褐变因子的系统性施用存在着相当大的安全性和效力担忧，因为不受控制的组织暴露可能导致潜在的脱靶副作用和不可预测的动力学。例如，fgf21的施用与系统性骨损失的副作用有关。因此，开发有效的基于褐变的治疗剂来解决日益恶化的肥胖流行病需要将受控释放技术的进展与浅褐色/褐色脂肪细胞生物学的发现结合起来。
使用乳液/溶剂蒸发技术制备大小范围为50-150μm的加载有dbz的plga微球作为dbz递送系统。加载有dbz的plga微球支持以持续方式释放dbz。在体外和体内研究两者中证明了加载有dbz的plga微球诱导褐变的有效性。这项研究第一次证明开发用于受控递送dbz的生物工程化载体系统以使用生物可降解聚合微球实现诱导性褐变的可行性。为了促进我们的技术平台的转化以对治疗性处理具有积极影响，未来的努力将聚焦于用人细胞和组织对此受控递送系统的评估。
实施例3：使γ-分泌酶抑制剂能够逐渐释放的pphos前药系统：
pphos是具有交替的磷和氮原子主链的高分子量聚合物。每个磷原子带有两个有机取代基，具有可用于性能优化的多种侧基。附接到pphos主链的侧基的类型对聚合物的物理化学和生物学性质具有深远的影响。例如，根据聚合物的特定分子结构，用水解不稳定基团如氨基酸酯、咪唑基、葡糖基、甘油基和乙醇酸酯或乳酸酯取代聚(二氯膦腈(dichlorophospazene))的氯原子使聚合物致敏以在生理温度下在数小时、数天、数月或数年内分解。另一方面，疏水性侧基如芳氧基、氟烷氧基和高级烷氧基单元保护聚合物主链免于水解。已经研究了pphos基于扩散、侵蚀或侵蚀和扩散的混合递送多种药物。此外，可以将药物分子作为侧基通过水解敏感键直接附接到聚合物链上作为药物递送的贮库。例如，生物可降解药物缀合物pphos-铂(ii)通过在降解过程中从pphos主链受控释放铂(ii)部分显示高抗肿瘤活性。因此，pphos构成有吸引力的候选材料，用于设计基于聚合物的前体药物系统，对降解速率和药物释放概貌具有有效控制。
pphos前药系统的优势包括：
由于通过大分子取代路线合成聚合物，可以一致性再现明确定义的聚合物结构。
pphos的合成灵活性，其允许通过利用侧基化学开发具有化学或生物部分的新型聚合物。γ-分泌酶抑制剂与不同侧基对聚合物主链上的共取代允许通过简单改变取代基的比率来微调聚合物降解和药物释放。
此聚合物系统是生物相容的，因为聚合物主链降解为磷酸铵，所述磷酸铵可以容易地被身体代谢或排泄。
可再现的基于pphos的缀合物，其避免通过试图将药物包埋于聚合物内可能遇到的困难；相反，药物是聚合物。将dbz直接缀合到聚合物主链上有助于确保药物的高加载效率。可以通过改变聚合物-药物连接的性质和水解灵敏度来调整药物释放动力学。
此类聚合物-药物缀合物系统也可用于开发三维基质，以研究细胞-胞外微环境相互作用或生成用于植入的工程化褐色脂肪。
聚合物合成和表征：
可以通过两步大分子取代方案合成基于pphos的前药系统。(npcl2)3的热开环聚合，接着进行所得聚(二氯膦腈)的亲核取代反应，导致产生pphos-γ-分泌酶抑制剂前药(图12)。或者，可以通过三氯膦亚胺(trichlorophosphoranimine)的活性阳离子聚合(livingcationicpolymerization)来合成聚(二氯膦腈)。在我们之前的出版物中已经报告了此方法的合成细节。预期将γ-分泌酶抑制剂(ly411575)的钠盐直接附接到聚合物主链上导致相对高的加载效率。可以通过用不同侧基共取代聚合物主链进一步微调加载百分比和聚合物降解。为了确认结构和侧基比率，使用bruker360mhznmr光谱仪获得聚合物的31pnmr(145mhz)和1hnmr(360mhz)谱。使用hewlettpackardlc1100系列从凝胶渗透层析(gpc)的结果评估聚合物的分子量。
聚合物降解和药物释放：
聚合物降解对于开发受控/持续释放药物递送媒介物是高度期望的。参与聚合物降解的过程通常包括几个阶段：1)有或没有溶胀的水合，2)通过水侵入产生寡聚物和单体，3)逐渐降解，以及4)寡聚物和单体释放，导致质量损失。本文开发了基于目前的干预方案在12周范围内具有完全降解时间的聚合物，以实现人中wat的褐变。简言之，将圆盘形式(10mm直径和0.5mm厚度)的pphos前药在ph7.4的pbs(10ml)中在37℃在250rpm的摇动水浴中温育12周。在特定的时间点，将基质从培养基中除去，干燥至恒定重量，并测定重量变化。还使用gpc测定降解基质的分子量。通过sem显现样品。使用nmr、hplc和红外光谱术技术的组合进行包括γ-分泌酶抑制剂的这些聚合物的降解产物的分析。
此类聚合前药系统可用于不同的配制剂(例如微球、纳米颗粒、纤维、速溶片)以将γ-分泌酶抑制剂递送至脂肪组织，从而抑制notch信号传导并诱导wat的褐变以治疗肥胖。
实施例4：包含聚合物体的基于纳米颗粒的递送系统：
包含聚合物体的纳米颗粒药物递送系统通过在靶细胞内提供高药物有效载荷提供了改善药物效力的有效手段。合成嵌段共聚物已经广泛用于聚合物体的制备。可以通过使用具有不同分子量、官能性、电荷状态、化学组成、亲水/疏水比率、嵌段数目和分子结构的嵌段共聚物来产生具有范围广泛的性质(例如不同膜厚度、对刺激的响应性和渗透性)的聚合物体。
加载有fitc-bsa的聚合物体配制和表征
根据我们先前的报告合成聚苯乙烯-b-聚(4-乙烯基-n-甲基吡啶碘化物)2，ps-b-(p4mvp)2三嵌段聚合物。通过简单透析制备加载有fitc-bsa的ps33-b-(p4mvp29)2聚合物体。具体而言，将10mgps33-b-(p4mvp29)2三嵌段共聚物和不同量的fitc-bsa溶于dmso中，并使用spectrummwco10-12kda透析管针对di水进行透析以制备限定浓度(约5mg/ml)的聚合物体。通过透析(mwco100kda)24小时除去游离蛋白。使用标准校准曲线以荧光测定法测定水相中的fitc-bsa浓度(激发：485nm，发射：520nm，synergyh1微板读板仪)。实际的fitc-bsa加载百分比表征为约8.6％(w/w)，相当于约86％的fitc-bsa包囊效率。
聚合物体纳米颗粒的细胞摄取：
将原代前脂肪细胞在含有dmem、20％fbs和1％青霉素/链霉素的生长培养基中在37℃和5％co2下培养。将细胞与一系列加载有fitc-bsa的ps33-b-(p4mvp29)2聚合物体浓度预温育20分钟，然后与脂肪细胞培养基一起温育。24小时后，将细胞用pbs清洗三次，并在4％甲醛中固定。用dapi染色核。在nikona1r上进行共聚焦显微术(图13)。
加载有dbz的聚合物体配制和表征：
通过raft聚合合成氢化聚丁二烯-b-聚(4-乙烯基-n-甲基吡啶碘化物)2，hpbd-b-(p4mvp)2三嵌段聚合物。通过简单透析制备加载有dbz的hpbd41-b-(p4mvp25)2聚合物体纳米颗粒。具体而言，将10mghpbd41-b-(p4mvp25)2三嵌段共聚物和不同量的dbz溶于dmso中，并使用spectrummwco10-12kda透析管针对di水透析48小时以制备限定浓度的聚合物体。将加载有dbz的hpbd41-b-(p4mvp25)2聚合物体冻干以获得加载有dbz的hpbd41-b-(p4mvp25)2纳米颗粒。
为了测试加载效率，将5mg加载有dbz的hpbd41-b-(p4mvp25)2纳米颗粒完全溶解于0.4mldmso中。将溶液逐滴添加到离心管中的6ml乙酸乙酯中以溶解dbz并沉淀hpbd41-b-(p4mvp25)2。收集上清液中的dbz并在氮气流下浓缩。然后，将dbz在真空烘箱中干燥过夜并溶于2.4ml2:1乙腈与millipore水。将产物过滤以进行高效液相层析(hplc)分析(thermohplc)。在五氟苯丙基柱上以1ml/min的流速使用乙腈与0.1％磷酸(50:50)的流动相并在232nm下进行uv检测分析样品。dbz包囊效率表征为约30％。
进行tem研究以表征聚合物体的大小(图14)。简言之，将加载有dbz的hpbd41-b-(p4mvp25)2聚合物体(约2μl)置于400目超薄a型网格(tedpella)上并用tecnait20tem成像。使用200kv的加速电压，并且用2％乙酸铀酰(uac)染色样品以增强对比度。
还可以开发主动靶向策略以通过用靶向脂肪细胞上的特定受体的特异性配体装饰纳米颗粒来提高递送效率。
实施例5释放notch抑制剂的plga纳米颗粒诱导局部白色脂肪组织的褐变以抵消肥胖
在本实施例中，公开了聚(乳酸-共-羟乙酸)(plga)纳米颗粒(np)系统的开发，该系统可以实现选择性持续释放notch抑制剂(二苯并氮杂，dbz)到wat贮库。这些dbz-np在快速细胞内化后抑制notch信号并诱导褐变。重要的是，与对照组相比在饮食诱导的肥胖小鼠模型中将dbz-np局部注射入腹股沟wat贮库中表明局部化的np保留，刺激褐变，因此改善葡萄糖稳态并减轻体重增加。这些发现为开发用于肥胖及其相关代谢综合征的临床治疗的潜在治疗策略提供了新途径。
材料和方法：
材料：
50:50聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)(plga，resomer504)获自boehringeringelheim(ingelheim,germany)。二苯并氮卓(dbz)购自tocrisbioscience(bristol，uk)。具有末端胺基团的plga(plga-nh2)购自polyscitech(westlafayette，in)。丙酮(认证的acs)和氯仿购自fisherscientific。所有其它试剂和溶剂购自sigma-aldrich。
动物：
根据普渡大学(purdueuniversity)动物护理和使用委员会提出的规定进行所有关于动物维持和实验使用的程序。从taconic购买具有c57bl/6背景的10周龄雄性饮食诱导的肥胖(dio)小鼠，并在普渡大学在正常条件下饲养。高脂肪饮食(研究饮食#d12492，60％脂肪)用于诱导和维持小鼠肥胖。14周时平均体重为36g的小鼠开始接受纳米颗粒治疗。5周后，通过致死剂量的二氧化碳将小鼠实施安乐死，然后立即从心脏采集血液以评估血液学参数，然后快速解剖腹股沟wat、bat和肝脏进行分子和细胞分析。
纳米颗粒合成和表征。用纳米沉淀法制备plga纳米颗粒。简言之，将plga溶于含有或不含相应药物化合物的丙酮中，所述药物化合物包括dbz或尼罗红(flukaanalytical)。聚合物/药物混合物溶液离心(12,000rpm，4℃，45分钟)并通过搅拌15分钟分散于水中。通过使用malvernzetasizer的动态光散射(dls)测定大小和ζ电势。用1％磷钨酸溶液将纳米颗粒染色，并使用在200kv下操作的透射电子显微镜(philipscm100)观察大小和形态。通过hplc(thermofisher)测定纳米颗粒中的dbz含量。
从纳米颗粒释放dbz。通过透析，然后进行hplc表征检查从纳米颗粒的dbz释放。详细地，将1mldbz-np溶液(1mg/ml)转移到透析袋(10kda)中，并在100rpm的轨道摇动器中浸入37℃的40mlpbs(ph7.4)或乙酸盐缓冲液(ph5.0)中。在特定的时间点，取出12ml缓冲溶液并用新鲜替换。用氯仿萃取样品，然后用1ml的67％的乙腈水溶液重构，用于hplc分析。
plga-cy5.5nps的合成。通过在真空下在schlenk烧瓶中的3mldmso中混合1.2mgcy5.5-nhs酯和33mgplga-nh2并且在黑暗中在室温下搅拌过夜进行cy5.5-nhs酯和plga-nh2(m.w.30,000)的缀合。反应后，通过使用溶剂/非溶剂技术来纯化终产物。将反应混合物滴入冰浴中冷却的40ml甲醇中，并在4℃以8,000rpm离心30分钟。将团粒再次溶解于dmso中，并且将清洗程序再重复两个循环。使用真空烘箱在室温下将最终团粒干燥24小时。按照上述标准方案制备plga-cy5.5np。
从腹股沟wat分离和培养基质血管级份(svf)。具体地，将腹股沟wat切开并切成小块，接着在dulbecco改良的eagle培养基(dmem)中在37℃在温和搅拌的情况下用1.5mg/ml胶原酶消化1.5-2小时。通过dmem中10％(vol/vol)胎牛血清(fbs)终止消化。然后用100μm细胞过滤器(bdflacon)过滤混合物溶液，并以450g进行短暂离心5分钟。除去漂浮的脂质层和上清液后，将团粒重悬，并用补充有20％(vol/vol)fbs和1％青霉素/链霉素的dmem在37℃和5％co2下维持。
纳米颗粒的细胞摄取。将svf细胞以每孔10,000个细胞的密度接种在8孔室载玻片(lab-tek)中并培养24小时。然后将细胞暴露于含有0.1mg/ml加载有尼罗红的plga纳米颗粒的dmem达10和60分钟。用pbs清洗两次后，随后在37℃将细胞与50nmlysotrackergreen(lifetechnologies)一起温育30分钟并且与1mg/ml赫斯特33342(lifetechnologeis)温育10分钟。用leicadmi6000b荧光显微镜拍摄图像。
用纳米颗粒对svf细胞的脂肪形成分化。将svf细胞在组织培养板中培养至汇合。在脂肪形成诱导之前，将细胞用pbs冲洗3次，并与含有终浓度为0.1mg/ml的纳米颗粒的dmem温育1小时。在除去纳米颗粒悬浮液后，将细胞用pbs仔细冲洗并经受含有dmem、10％(vol/vol)fbs、2.85μm胰岛素、0.3μm地塞米松和0.63mm3-异丁基甲基黄嘌呤的脂肪生成诱导培养基达4天。在第5天，用上述相同程序再次用纳米颗粒处理细胞，然后将含有dmem、200nm胰岛素和10nm三碘甲状腺原氨酸的脂肪形成分化培养基再处理4天，直到脂肪细胞成熟。
耗氧率(ocr)测量。将来自三只不同小鼠的腹股沟wat的svf细胞培养并以20,000个细胞/孔的密度接种到seahorsexf24微板(seahorsebiosciences)中。遵循上述方案，通过plga-np和dbz-np的处理诱导细胞并分化为成熟的脂肪细胞。8天分化后，将成熟脂肪细胞用pbs清洗两次，并在补充有20mm葡萄糖、2mm谷氨酰胺和1mm丙酮酸的xf基础培养基中在37℃下在无co2环境中预温育1-2小时。在连续注射寡霉素(1mm)、fccp(1mm)和鱼藤酮/抗霉素a(0.5μm)后，在xf细胞外通量分析仪(seahorsebiosciences)上测量ocr。相对于蛋白质质量标准化呈现ocr值。
体内成像研究。通过氯胺酮-赛拉嗪混合物麻醉后，在腹股沟wat中给小鼠注射悬浮于pbs中的1mg/ml缀合有cy5.5的plga纳米颗粒。使用ivisluminaⅱ成像系统(caliper，usa)在注射后24、48和72小时拍摄图像。72小时扫描后，将小鼠实施安乐死并收集多个相关组织，随后进行离体成像。通过livingimagesoftware分析荧光图像。
血糖测量。对于gtt，在空腹16小时后，对小鼠腹膜内注射100mg/mld-葡萄糖(2gkg-1体重)。从尾部抽血并通过血糖仪(accu-checkactive，roche)测量葡萄糖水平。对于itt，空腹4小时后，对小鼠腹膜内注射人胰岛素(santacruz)(0.75u/kg体重)。在从尾部抽取的血液中测量葡萄糖浓度。对于gtt和itt两者，将小鼠按随机顺序分成1只/笼。
血清学参数的测量。通过来自randoxlaboratories的标准试剂盒检查纳米颗粒处理5周后来自空腹dio小鼠的游离脂肪酸、葡萄糖、胆固醇和甘油三酯的血清水平。根据制造商的说明书(alpco)通过elisa测量血清中的胰岛素水平。
h&e和免疫组织化学染色。将腹股沟wat的部分在室温在10％福尔马林中固定24小时，包埋入石蜡中并切成4-μm切片。根据标准方案将载玻片脱蜡并顺序与二甲苯、乙醇和水一起温育以进行再水合。对于h&e染色，将载玻片用苏木精染色15分钟，然后进行曙红染色1分钟。对于免疫组织化学染色，将载玻片在0.01m柠檬酸钠(ph6.0)中温育并在96℃加热20分钟以恢复抗原。在dakoautostainer(dako，carpinteria，ca)中进行ucp1免疫组织化学。用以1:200稀释的ucp1一抗(ab10983，abcam)将载玻片染色1h。对于信号检测，使用抗兔igg聚合物检测试剂盒(mp-7401，vector)。然后使用3,3'-二氨基联苯胺(dab)作为色原体显现标记。通过aperioscanscope载玻片扫描仪(aperio，vista，ca)收集图像。
油红o染色。冷冻切片后，用含有60％(vol/vol)油红o储备溶液(异丙醇中5gl-1)的油红o工作溶液将肝样品染色30分钟。染色后，用60％异丙醇清洗载玻片并拍摄图像。
总rna提取，cdna合成和定量pcr。根据生产商的方案通过trizol(lifetechnologies)从细胞或组织提取总rna。在通过nanodrop(thermofisher)测量rna浓度后，通过m-mlv逆转录酶(invitrogen)用随机六聚体引物将5μgrna逆转录为cdna。在rochelightcycler96pcrsystem(roche)上进行定量pcr。在补充表s中列出了引物的序列。对于结果分析，使用2-δδct方法计算相对于18srrna标准化后的基因表达的相关变化。
蛋白质提取和western印迹。用含有50mmtris-hcl(ph8.0)、150mmnacl，1％nonidetp-40、0.5％脱氧胆酸钠和0.1％十二烷基硫酸钠(sds)的ripa缓冲液从细胞或组织样品中提取蛋白质。通过piercebca蛋白测定试剂(piercebiotechnology，rockford，il，usa)测定蛋白质浓度。通过sds-page分离蛋白质，然后转移至pvdf膜(milliporecorp.，billerica，ma)，随后用5％乳封闭1小时。然后在4℃下将膜与一抗温育过夜。hes1(sc-166378)、pgc1-α(sc-13067)和β-肌动蛋白(sc-47778)抗体(santacruzbiotechnology)均以1:1000稀释。将缀合有hrp的二抗(抗兔igg，7074s或抗小鼠igg，7076s，cellsignaling)以1:5,000稀释。与二抗温育2小时后，使用增强的化学发光western印迹底物(piercebiotechnology)用chemidoctm触摸成像系统(bio-rad)检测信号。
统计分析。定量数据表示为均值±s.e.m。p值由双尾student’st检验计算。认为p<0.05是统计学显著的。
结果：
纳米颗粒的合成和表征。以dbz/plga质量比1:19，使用具有优化条件(表1)的纳米沉淀法配制dbz-np，其导致94％的高包囊率。透射电子显微术(tem)显示合成的dbz-np的球形结构(图16a)。如图16b所示，通过动态光散射(dls)确定纳米颗粒大小为约150nm。使用相似大小的裸plga-np作为对照。dbz-np在水中的表面ζ电势为-20.2±3.0mv。为了检查所得纳米颗粒的稳定性，将它们在不同ph值的缓冲盐溶液中温育，然后通过dls监测颗粒大小和多分散指数(pdi)(图21)。在7天内在不同ph条件下没有发现颗粒大小和pdi的显著差异。为了评估dbz释放特征，我们研究了在37℃在中性(1xpbs缓冲液，ph7.4)和酸性(1xpbs缓冲液，ph5.0)条件下dbz从dbz-np的体外释放概貌。dbz-np呈现dbz的连续释放，其中分别地以在ph5.0时1天和在ph7.4时3天的半衰期释放(图16c)。此外，通过数学建模进一步分析从这些dbz-np的dbz释放动力学(表2)。在这两个ph值将释放数据充分拟合到korsmeyer-peppas模型(图22)，指示dbz通过扩散释放。
纳米颗粒的细胞摄取。使用共聚焦激光扫描显微术检查原代前脂肪细胞对np的细胞摄取(图17a)。通过包囊尼罗红荧光染料使np显现，而用lysotrackergreen(ltg)对晚期内体/溶酶体进行染色。从腹股沟wat分离基质血管级份(svf)并进行培养，然后与纳米颗粒温育。在10分钟内，晚期内体/溶酶体与前脂肪细胞中的np共定位，如从橙色到黄色荧光的出现看明显的，指示np的相对快速的胞吞。当将温育时间延长到60分钟时，np分布在整个细胞质中以及核周围，提示了np的内溶酶体(endolysosomal)逃逸。接下来，通过tem成像进一步显现np的胞吞作用过程(图17b)。在温育10分钟后，在内吞囊泡和内体中清楚鉴定出np，这与上文讨论的结果一致。为了进一步验证组织水平上的np的细胞摄取，我们从小鼠中取出腹股沟wat，随后与加载有尼罗河红的np温育。温育24小时后，在一系列成熟的脂肪细胞中观察到红色荧光(图23a)。通过腹股沟wat的tem成像进一步证实纳米颗粒的细胞摄取(图23b)，证明了纳米颗粒在脂肪细胞内的定位。我们的数据提示np通过内吞途径被脂肪细胞迅速内化。
dbz-np在体外抑制notch并促进褐变效应。为了测试我们的dbz-np在抑制notch信号传导并刺激褐变中的生物活性，我们通过dbz-np或对照plganp处理一起诱导svf细胞的脂肪形成分化。分化8天后，我们通过定量pcr测定检查了notch靶物和褐变标志物的mrna水平。经典的notch靶基因hey1、heyl和hes1在dbz-np处理的情况下显著降低(图18a)。同时，褐变标志物(包括ucp1、cidea、ppargc1a和dio2)的mrna水平显著升高(图18b)。由于褐变效应与线粒体生源和氧化能力内在相关，则通过dbz-np的处理显著提高细胞色素c氧化亚基5b(cox5b)的mrna水平(增加69％，图18c)。一致地，hes1的蛋白质水平下降，而pgc1α的蛋白质水平显著增加，这通过密度测定分析来量化(图18d)，提示dbz-np对notch的抑制和褐变效应。此外，为了测定这些观察到的分子改变是否可以通过细胞呼吸反映，在xf24分析仪中研究了分化脂肪细胞的耗氧率(ocr)。使用dbz-np处理，在基础和质子泄漏条件两者下的ocr显著增加(图18e)。这些结果共同提示了从np释放的dbz保留其在体外抑制notch并因此诱导褐变的生物活性。
dbz-np的局部保留在体内导致腹股沟wat的褐变。为了评估wat内的局部np保留能力，使用非侵入性近红外光学成像技术研究了在注射入腹股沟wat贮库后cy5.5标记的plganp(cy5.5-np)的体内生物分布。通过形成酰胺键将近红外荧光染料cy5.5-nhs酯与plga-nh2缀合，然后进行纳米颗粒的标准配制。随后将那些纳米颗粒注射到腹股沟wat贮库中，所述腹股沟wat贮库由于其显著的募集浅褐色脂肪细胞的能力而构成广泛研究的脂肪组织。施用24小时后，cy5.5-np在注射部位周围呈现强烈的荧光信号。随着时间的增加，cy5.5-np的荧光强度随着保留在wat贮库中的荧光信号而下降，直到注射后72小时，指示wat内具有强大的np保留效应(图19a)。注射72小时后，立即对小鼠实施安乐死，并收集相关组织，包括腹股沟wat(iwat)、前皮下wat(aswat)、bat、肌肉、肝、脾、肾和心脏，用于离体成像。值得注意的是，cy5.5-np的荧光信号仅在腹股沟wat中检测到，而在脱靶组织中不存在(图19b)，这与iwat内局部np保留的发现一致。另外，iwat的tem分析进一步证实了体内注射后纳米颗粒在脂肪细胞内的定位(图19c)。这些数据共同支持纳米颗粒在使脱靶效应最小化的情况下实现对腹股沟wat贮库的局部胞内递送中的潜力。我们接下来评估了我们的dbz-np在体内抑制notch并因此促进褐变中的效力。我们采用饮食诱导肥胖(dio)小鼠模型，并将dbz-np每周一次注射到腹股沟wat贮库达5周。之后，从腹股沟wat提取总rna，然后进行定量pcr分析。与对照plga-np组相比，ucp1的mrna水平在dbz-np组中上调6倍(图19d)。一致地，与plga-np相比，dbz-np显著增加线粒体基因cox5b和cox7a的mrna水平(图19e)。这些分子变化通过腹股沟wat的h&e和ucp1免疫组织化学染色证实，证明了多泡脂质液滴、脂肪细胞收缩和ucp1表达升高(图19f)，这是源自dbz-np处理的褐变效应的标志指标。因此，局部递送dbz-np可以在体内有效抑制notch信号并诱导局部wat的褐变。
dbz-np改善代谢并预防饮食诱导的肥胖。我们进一步试图评估dbz-np对局部腹部沟wat贮库的诱导性褐变是否可以在肥胖小鼠中调节代谢并减少肥胖。我们使用高脂肪饮食(hfd)诱导的肥胖模型，并且每周一次将dbz-np注射到腹股沟wat贮库中以测定dbz-np对体重、脂肪细胞组织形态学和葡萄糖代谢的影响。用rosi(在溶液中和非靶向np形式)处理的小鼠与未处理的肥胖小鼠之间的体重增加没有差异。值得注意的是，dbz-np处理减弱经plga-np处理的对照组中看到的体重增加而不影响能量摄入(图20a，b)。处理5周后，对小鼠实施安乐死并回收组织样品。使用dbz-np处理的腹股沟wat与plga-np对应物相比大小似乎更小，这通过来自经dbz-np处理的小鼠的腹股沟wat的较低重量进一步验证(图20c)。更引人注意的是，通过dbz-np的局部褐变效应导致显著增强的葡萄糖耐受性(图20d)和胰岛素敏感性(图20e)。一致地，血浆化学分析证明用dbz-np处理的小鼠比用plga-np处理的小鼠中葡萄糖水平显著降低54％(图20f)。此外，接受dbz-np的小鼠中血液胆固醇水平降低47％(图20g)。在用dbz-np和plga-np处理的小鼠中，没有观察到血浆胰岛素(图20h)、甘油三酯、游离脂肪酸和胰岛素抗性(ir)水平(图23)的统计学差异。这些结果共同提供了令人鼓舞的证据，即在dio小鼠模型中局部递送dbz-np至wat可以在预防肥胖方面发挥显著的积极代谢作用。
此外，用dbz-np处理的小鼠的肝中的脂质含量比用plga-np处理的小鼠中的脂质含量降低(图24a)。这通过参与肝脂肪酸代谢的基因的qpcr分析进一步证实。通过dbz-np处理显著增加肉碱棕榈酰转移酶i(cpt1)的mrna水平(图24b)，指示脂肪酸氧化升高。并且，通过dbz-np处理大大增加脂肪甘油三酯脂肪酶(atgl)和激素敏感性脂肪酶(hsl)(两者都造成肝中的脂解)的mrna水平(图24c)。同时，从头脂肪生成在接受dbz-np的小鼠的肝中显著降低，其通过乙酰coa羧化酶1(acc1)(脂肪酸合成中的限速步骤)的mrna水平下降表现(图24d)。这些数据共同提示了通过dbz-np的局部褐变增强hfd喂养条件下的肝脂质代谢。
通过局部操作引起的这些系统性益处也与之前的出版物一致，即来自运动训练的小鼠的皮下wat或来自正常小鼠的bat的移植显著改善葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性。
过去几年已经发现众多褐变因子改善能量消耗，如β3-肾上腺素能途径激动剂27,28、bmp29,30、fgf31,32,33、鸢尾素34、甲状腺激素35,36和利尿钠肽37。然而，由于在系统性施用的情况下不受控制的组织暴露和不可预测的动力学，这些因子一直面临重大的转化挑战。例如，尽管fgf21由于其调节葡萄糖和脂质代谢的强大能力而成为2型糖尿病的有希望的药物，但是fgf21的系统性施用与骨骼脆性(skeletalfragility)有关38。因此，迫切需要开发有效的药物递送平台来推动临床转化。可以潜在应用本发明中公开的工程化聚合纳米颗粒以递送一大批这些褐变因子。此外，同时掺入不同褐变因子以实现协同效应也可以是有利的。
在本实施例中，我们通过生物可降解和生物相容性plga的纳米沉淀设计并合成聚合np平台，以将dbz直接胞内递送到wat贮库。针对粒径和表面特性优化这些加载有dbz的plga纳米颗粒(dbz-np)，并且在体外细胞培养过程中被脂肪细胞快速内化。此外，我们显示了从这些dbz-np释放的dbz导致对notch靶基因的抑制和脂肪细胞的褐变标志物和线粒体基因的升高。重要的是，与对照组相比，在饮食诱导的肥胖小鼠模型中将这些工程化dbz-np局部注射到腹股沟wat贮库中表明在贮库中局部化的np保留，而在其它主要器官中没有任何积累，刺激wa的褐变，因此改善葡萄糖稳态，并且减弱体重增加。这些发现不仅在机械论上了解由notch抑制引起的wat局部褐变对系统代谢改善的直接贡献，还为开发用于肥胖及其相关代谢综合征的临床治疗的基于wat贮库褐变的潜在治疗策略提供了新途径。
本领域技术人员将认识到，可以对上述具体实施方式进行许多修改。这些实施方式不应限于所述的特定限制。其它实施方式可以是可能的。
表1
表2
表3
序列表
<110>珀杜研究基金会
<120>用于诱导性脂肪褐变的基于聚合物的治疗剂
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<150>62/247,192
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