本发明涉及用于将原始生殖细胞分化成功能上成熟的卵母细胞的培养方法。
背景技术：
：只有生殖细胞能够将遗传信息传递给下一代。而且，生殖细胞中的卵子起着启动发育并引导早期发育的作用，因此，卵子负责了非常重要的主要作用。体细胞分裂阶段的大量原始生殖细胞存在于雌性哺乳动物的胚胎性腺中。出生前，他们都转向减数分裂并分化成卵母细胞。转移到减数分裂后，卵母细胞不能再次增殖，并且卵巢中的卵母细胞处于停滞的发育阶段。根据动物物种独特的发情周期和排卵次数，只有一部分卵母细胞可以生长并成熟。因此，雌性在其一生中产生的可育卵子的数量与原始生殖细胞的数量及作为雄性生殖细胞的精子相比非常小(参见非专利文献1和2)。此外，分化成功能卵子的详细机制尚未阐明。鉴于上述情况，建立将原始生殖细胞分化成卵子的体外培养方法可以成为克服卵子发生过程中的上述问题的一种方法。此外，这种体外培养体系的建立确保了卵子的新来源。然而，目前还没有关于减数分裂前的雌性原始生殖细胞和卵泡生成前的未成熟的卵母细胞能够通过体外培养成功分化成功能卵子(即能够产生后代的卵子)的报道。这是由于在培养条件下还没有重现用于足够支持卵子分化的卵泡的形成及卵母细胞的生成和成熟。已经提出了一些用于从原始生殖细胞产生全功能卵子的体外培养体系，但是即使通过这些方法，由于卵泡形成异常和卵母细胞生长不足，因此尚未达到下一代发育。例如，非专利文献3公开了一种通过在激活素A的存在下培养胎龄12.5天(12.5dayspostcoitum(dpc))的雌性小鼠性腺的一部分，然后与颗粒膜细胞(preantralgranulosacells：PAGC)共培养，提高分化成第二次减数分裂中期卵子的效率的方法。但是，没有关于通过非专利文献3的方法获得的卵子可以发育到下一代的报道。在小鼠中，还有报道称，将12.5-dpc胚胎性腺移植到成年雌性小鼠中，并且在移植后14天取得的次级卵泡通过体外培养分化成能够产生后代的功能卵子(参见非专利文献4)。最近，通过体外培养从ES细胞和iPS细胞产生原始生殖细胞样细胞。也如所报道的，将这些细胞与12.5-dpc的性腺体细胞共培养后，将该细胞凝结块移植到小鼠体内，以分化成能够产生后代的功能卵母细胞(参见非专利文献5)。然而，在非专利文献4和5中，需要将靶细胞移植到小鼠体内以实现减数分裂和卵泡形成并获得成熟的卵母细胞。这意味着，将小鼠个体用于卵母细胞生长，并且卵母细胞没有通过体外培养完全成熟。非专利文献1公开了一种卵母细胞培养方法，其包括在高分子化合物存在下培养卵母细胞和其外周体细胞的复合体的步骤。非专利文献1中的方法能够有效地使从成体卵巢分离的卵母细胞在体外成熟。然而，非专利文献1的方法是：通过从活体内的发育中的卵泡收集卵母细胞-颗粒细胞复合体，获得在第一次减数分裂中的前期停滞的卵母细胞；使该卵母细胞进行体外生长和体外成熟。该方法不是用原始生殖细胞开始体外培养的方法。因此，目前还没有关于使原始生殖细胞或原始生殖细胞样细胞通过体外培养而成功形成功能卵子而不使用活体的方法的报道。如果能够使哺乳动物原始生殖细胞在减数分裂前通过体外培养发育为功能卵子，则能够确保大量的卵子。该方法对于将复杂的卵子形成机制可视化和理解该机制也是有帮助的。因此，通过体外培养从原始生殖细胞产生功能卵子的方法是所期望的。[现有技术][专利文献]专利文献1：日本未审查专利申请公开No.2004-173635[非专利文献]非专利文献1：Tam,P.P.&Snow,M.H.“Proliferationandmigrationofprimordialgermcellsduringcompensatorygrowthinmouseembryos.”JEmbryolExpMorphol64,133-147(1981)非专利文献2：Miyano，T.JSAR杰出研究奖。“Invitrogrowthofmammalianoocytes.”JReprodDev51,169-176(2005)非专利文献3：Zhang,Z.P.等人,“GrowthofMouseOocytestoMaturityfromPremeioticGermCellsInvitro”PLoSOne7，e41771(2012)非专利文献4：ShenW，ZhangD，QingT，ChengJ，BaiZ，ShiY，DingM，DengH.，“Liveoffspringproducedbymouseoocytesderivedfrompremeioticfetalgermcells.”BiolReprod75，615-623(2006)非专利文献5：HayashiK.等人，“OffspringfromOocytesDerivedfrominvitroPrimordialGermCell-likeCellsinMice.”Science338,971-975(2012)技术实现要素：[本发明解决的问题]本发明的问题在于提供一种将原始生殖细胞分化为功能卵母细胞的方法。而且，本发明的问题在于提供一种从通过分化方法获得的卵母细胞获得功能卵子的方法。[解决问题的手段]为了解决上述问题，本发明的发明人研究了卵巢培养方法以增强起始事件如减数分裂、卵泡形成和卵泡生长。首先，通过气-液界面方法(Trowell,O.A.“Thecultureofmatureorgansinasyntheticmedium.”ExpCellRes16,118-147(1959))，在含有10％FBS的α-MEM培养基中在-COL上培养12.5dpc胚胎性腺(图1a)17天，作为已知的标准培养条件。在12.5dpc胚胎性腺中，将作为减数分裂期的标记的SCP3进行免疫染色，未检测到SCP3阳性细胞。然而，在培养的第5天，无论是否与中肾共培养，都检测到许多SCP3阳性细胞。这意味着卵母细胞即使在体外培养中也能开始减数分裂。对于在卵巢中次级卵泡形成后期的持续的卵母细胞生长，需要复杂的血管化组织和血流量。然而，由于培养卵巢不具有这样的组织和血流量，因此有必要分离次级卵泡并重新培养。另一方面，在培养的第17天，尝试从卵巢分离次级卵泡时，在一个卵巢中存在超过100个正在生长的卵母细胞。然而，在已知培养条件下的卵巢培养的情况下，很难分离卵泡。正常卵泡形成球形结构并生长，其中该球形结构为卵母细胞表面被颗粒细胞层包围，颗粒细胞层的表面进一步被膜细胞层包围。另一方面，在培养的卵巢中，这样的球形卵泡的数量很少，卵泡是脆弱的，并且当这些卵泡被分离时，大量卵母细胞被剥去。在通过体外培养获得的卵巢中，对形成卵泡并赋予其强度的基膜结构蛋白的层粘连蛋白进行免疫组织化学分析。结果表明，在来自出生后10天的小鼠的卵巢中，将卵巢组织在平面上切割并观察时，基膜(层粘连蛋白)以呈圆形地包围一个卵泡的方式局部存在，而在体外培养的卵巢中，观察到层粘连蛋白不呈圆形而在同一平面上断断续续地存在。另外，位于其表面且原本应该以卵泡的形式分别独立的膜细胞群的一部分与上下左右相邻的卵泡共同存在，层粘连蛋白也显示出花形的局部存在等，这样的膜细胞层的形成异常非常显著(参照图5a)。因此，需要一种使卵泡分离的新方法。然后，本申请的发明人着眼于在性腺的体外培养过程中在培养基中的性类固醇激素(特别是雌激素和具有与雌激素相似的功能的因子)的影响。作为深入研究的结果，发明人发现，在性腺培养的培养基中消除雌激素和具有与雌激素相似的功能的因子的影响，通过包括上述步骤，从而得到大量的次级卵泡，该次级卵泡是使功能卵子分化必不可少的。此外，发明人研究了获得的次级卵泡的体外器官培养。结果，发明人发现通过包括以下步骤的方法可以产生功能上成熟的卵子：当在体外培养次级卵泡时，卵泡中的颗粒细胞层与膜细胞层之间的结合被部分地切割的步骤；以及在含有高分子化合物的培养基中培养卵母细胞-颗粒细胞复合物的步骤。本发明的一个方面涉及：[1]通过体外培养将原始生殖细胞分化成功能GV期卵母细胞的方法，包括：(a)通过在消除雌激素或具有与雌激素相似的功能的因子的影响的条件下，培养原始生殖细胞和邻近原始生殖细胞的支持细胞来产生次级卵泡的步骤；(b)部分地切割颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合的步骤，其中卵母细胞、颗粒细胞层和膜细胞层构成产生的次级卵泡；和(c)通过在含有高分子化合物的培养基中培养构成次级卵泡的卵母细胞、颗粒细胞层和膜细胞层，使卵母细胞分化为功能GV期卵母细胞的步骤。根据本发明通过体外培养将原始生殖细胞分化成功能上成熟的GV期卵母细胞的方法的一个实施方式的特征在于：[2]在步骤(a)的消除雌激素或具有与雌激素相似的功能的因子的影响的条件下的培养包括在雌激素抑制剂存在下培养或使用无血清培养基进行培养。根据本发明通过体外培养将原始生殖细胞分化成功能上成熟的GV期卵母细胞的方法的一个实施方式的特征在于：[3]步骤(a)中使用的雌激素抑制剂是雌激素受体拮抗剂。根据本发明的一个方面涉及：[4]通过体外培养将原始生殖细胞分化成功能上成熟的GV期卵母细胞的方法，包括：(a)通过在消除性类固醇激素或具有与性类固醇激素相似的功能的因子的影响的条件下，培养原始生殖细胞和邻近原始生殖细胞的支持细胞来产生次级卵泡的步骤；(b)部分地切割颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合的步骤，其中卵母细胞、颗粒细胞层和膜细胞层构成产生的次级卵泡；和(c)通过在含有高分子化合物的培养基中培养构成次级卵泡的卵母细胞、颗粒细胞层和膜细胞层，使卵母细胞分化为功能GV期卵母细胞的步骤。根据本发明通过体外培养将原始生殖细胞分化成功能上成熟的GV期卵母细胞的方法的一个实施方式的特征在于：[5]根据上述[4]所述的方法，其中在步骤(a)中在消除性类固醇激素或具有与性类固醇激素相似的功能的因子的影响的条件下的培养包括在性类固醇激素抑制剂存在下培养或使用无血清培养基进行培养。根据本发明通过体外培养将原始生殖细胞分化成功能上成熟的GV期卵母细胞的方法的一个实施方式的特征在于：[6]根据上述[5]所述的方法，其中，性类固醇激素抑制剂是雌激素抑制剂或雄激素抑制剂，或其组合。根据本发明通过体外培养将原始生殖细胞分化成功能上成熟的GV期卵母细胞的方法的一个实施方式的特征在于：[7]上述[1]-[6]中任一项所述的方法，其中，步骤(b)中部分地切割结合通过酶处理和/或物理手段来进行。根据本发明通过体外培养将原始生殖细胞分化成功能上成熟的GV期卵母细胞的方法的一个实施方式的特征在于：[8]如上述[1]-[7]中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)中，高分子化合物为选自由以下所组成的组中的至少一种化合物：聚乙烯吡咯烷酮、菲可羟丙基甲基纤维素和血清白蛋白。本发明的通过体外培养将原始生殖细胞分化为功能上成熟的GV期卵母细胞的方法包括根据上述[1]至[8]中任一项的实施方式中描述的两个或更多个特征的组合。根据本发明的一个方面涉及：[9]通过根据上述[1]-[8]中任一项的方法得到的GV期卵母细胞。根据本发明的一个方面涉及：[10]一种用于产生功能卵子的方法，其特征在于，包括：将通过根据上述[1]至[8]中任一项的方法获得的GV期卵母细胞进行体外成熟培养以恢复减数分裂的步骤。根据本发明的一个方面涉及：[11]通过上述[10]中所述的方法获得的卵子。根据本发明的一个方面涉及：[12]体外将原始生殖细胞分化为功能卵子的试剂盒，包括：雌激素抑制剂、无血清培养基、血清替代物、用于切割细胞间结合的酶、或高分子化合物，或其组合。根据本发明的一个方面涉及：[13]体外将原始生殖细胞分化成功能卵子的试剂盒，包括：性类固醇激素抑制剂、无血清培养基、血清替代物、用于切割细胞间结合的酶、或高分子化合物，或其组合。通过上述[9]或[11]的方法获得的GV期卵母细胞或卵子的性质不同于通过已知的体外培养方法获得的GV期卵母细胞或卵子的性质。然而，澄清它们之间性能的这种差异需要很长时间。考虑到专利申请体系的快速性的重要性，等待完成澄清这种差异是不切实际的。因此，根据上述[9]和[11]的GV阶段卵母细胞或卵子是通过其制备方法而指定的。[发明效果]根据本发明的方法，该方法是以原始生殖细胞作为起始材料的两步培养方法，其包括培养减数分裂前的原始生殖细胞或培养仅包含原始生殖细胞的性腺的步骤，和通过培养获得的次级卵泡进行体外成熟的步骤，通过该方法可以获得功能上成熟的卵母细胞。例如，本发明的方法可以在约一个月内从来自小鼠胚胎性腺的原始生殖细胞产生成熟卵子。[附图的简要说明][图1]图1a是显示12.5-dpc雌性胚胎小鼠来源的性腺的图像。图1b是显示用抗SCP3抗体进行免疫染色的培养第0天来源于卵巢的雌性原始生殖细胞(左侧)和没有中肾的培养第5天的细胞(右侧)的图像。细胞核用DAPI染色。SCP3(一种减数分裂标记)在培养第0天时呈阴性。另一方面，在培养的第5天，SCP3呈阳性，这意味着原始生殖细胞分化成卵母细胞。[图2]图2解释了下面描述的例子的“1.性腺的体外器官培养”中的每个实验条件。[图3]图3是在光学显微镜下显示通过在下述实施例1中描述的条件下体外培养12.5-dpc胚胎小鼠来源的性腺获得的卵巢的图像。图3a至3d分别显示了通过下文实施例1中描述的(i)FBS区(图3a)，(ii)SPS区(图3b)，(iv)FBS/SPS区(图3c)，或(v)FBS/10μMICI区(图3d)的每个条件下培养获得的卵巢。[图4]图4是显示从通过下文描述的实施例的“1.性腺的体外器官培养”中的每个试验区获得的一个卵巢收集的次级卵泡数量的比较的图。[图5]图5a和5b是在下文实施例的“1.性腺的体外器官培养”中描述的(i)FBS区(图5a)或(v)FBS/10μMICI区(图5b)的培养的第17天的卵巢、卵巢的切片、以及使用抗层粘连蛋白抗体的免疫染色的图像。图5c是10日龄小鼠来源的卵巢及其切片的图像，和使用抗层粘连蛋白抗体的免疫染色图像。Bar＝100μm。[图6]图6显示了卵泡培养第12天从卵泡获得的卵母细胞-颗粒细胞复合体(性腺的器官培养开始的第29天)。图6b显示了在胚泡(GV)阶段完全生长的卵母细胞(在图6b中，去除了卵母细胞周围的卵丘细胞)。[图7]图7a至7j是在下文描述的“3.次级卵泡的体外培养”中在膜上培养的第3天至第12天的卵泡的图像。图7k至7t是在下文描述的“3.次级卵泡的体外培养”中在-COL膜上培养的第3天至第12天的卵泡的图像。图7中的卵泡是在FBS/10μMICI区条件下培养性腺获得的卵泡。Bar＝100μm。[图8]图8是显示当通过(v)FBS/10μMICI区的器官培养获得的卵泡以下文实施例的“3.次级卵泡的体外培养”的方法培养时，用酶免疫测定试剂盒(Cayman)测定的产生类固醇激素的能力的图。通过t检验确定类固醇激素浓度的显著差异。*(星号)表示类固醇激素测量值与2天前相比的显著变动(*P<0.05，**P<0.01)。误差bar表示标准偏差(n＝4)。[图9]图9显示了通过重亚硫酸盐法在下文描述的“3.次级卵泡的体外培养”中获得的卵母细胞中的印记基因(Igf2r和H19)的甲基化状态的结果。Igf2r是受母本等位基因-特异性超甲基化影响的印记基因。H19是受父本等位基因-特异性超甲基化影响的印记基因。条形图中的条分别显示分析的DNA链，条形中的黑色部分显示分析的DNA链中甲基化CpG位点的比率，以及条形中的白色部分显示分析的DNA链中非甲基化CpG位点的比率。#1和#2样本不同且彼此独立。[图10]图10显示了在“8.体外成熟的卵母细胞的体外受精和胚胎移植”中获得的后代中印记基因(Igf2r，H19，Litl，Snrpn，和Peg1/Mest)的甲基化状态的结果，其中卵子通过重亚硫酸盐法通过在下文描述的“3.次级卵泡的体外培养”和“6.通过体外培养使卵子成熟”中的方法获得。Igf2r、Litl、Snrpn和Peg1/Mest是受母本等位基因-特异性超甲基化影响的印迹基因。H19是受父本等位基因-特异性超甲基化影响的印记基因。条形图中的条分别显示分析的DNA链，条形中的黑色部分显示分析的DNA链中甲基化CpG位点的比率，条形中的白色部分显示分析的DNA链中非甲基化CpG位点的比率。#1和#2样本不同且彼此独立。[图11]图11a显示了在“6.通过体外培养使卵子成熟”中描述的培养期间在第二次减数分裂中卵母细胞的核型分析的结果。图11b显示了在下文实施例的“6.通过体外培养使卵子成熟”中获得的在MII阶段的卵丘细胞-卵母细胞复合物(cumulus-oocytecomplexes；COCs)。图11c和11d显示了通过在下文实施例的“8.体外成熟的卵母细胞的体外受精和胚胎移植”中的方法获得的胚泡和后代的图像。[图12]图12是显示通过在下文实施例的“8.体外成熟的卵母细胞的体外受精和胚胎移植”中的方法获得的后代的存活率和由来源于活体的卵母细胞发育的后代的存活率之间的比较的图。[图13]图13是光学显微镜(明视场：BF)下的图像和荧光显微镜下的图像，其显示了在实施例中描述的“10.用来源于多能干细胞的PGCLC产生功能GV期卵母细胞和功能卵子的体外培养方法”的“II-2.次级卵泡的产生”中描述的培养方法开始后1周、2周或3周在来源于ES细胞和性腺体细胞的PGCLC上的Blimp1报告基因(BV；原始生殖细胞标记)表达或Stella报告基因(SC；原始生殖细胞标记和卵母细胞标记)表达。[图14]图14是在光学显微镜下的图像，其显示了在“10.用来源于多能干细胞的PGCLC产生功能GV期卵母细胞和功能卵子的体外培养方法”的“II-4.次级卵泡的体外成长培养”中描述的培养方法开始后的第2天(图14A)或1周(图14B)或2周(图14C)的次级卵泡。图14D显示了从培养方法开始的第11天从生长的次级卵泡分离的COCs。图14E显示了通过下文描述的在“10.用来源于多能干细胞的PGCLC产生功能GV期卵母细胞和功能卵子的体外培养方法”的“II-5.通过体外培养体外成熟(IVM)卵母细胞”中描述的方法获得的成熟卵子(MII期)在光学显微镜下的图像。[图15]图15显示具有正常胎盘大小的新生后代(图15中的左图)和由其生长的正常成年小鼠(图15中的右图)的图像。[实施方式的描述]根据本发明的一个方面是通过体外培养将原始生殖细胞分化成功能上成熟的GV期卵母细胞的方法，其包括：(a)通过在消除性类固醇激素(例如雌激素或具有与雌激素相似的功能的因子)的影响的条件下，培养原始生殖细胞和邻近原始生殖细胞的支持细胞来产生次级卵泡的步骤；(b)将构成所生成的次级卵泡的卵母细胞、颗粒细胞层和膜细胞层中的颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合部分地切断的步骤；和(c)通过在含有高分子化合物的培养基中培养构成次级卵泡的卵母细胞、颗粒细胞层和膜细胞层，使卵母细胞分化为功能GV期卵母细胞的步骤。在本说明书中，术语“原始生殖细胞”是指分化成生殖细胞的细胞，通过卵原细胞或精原细胞分化成卵子或精子的细胞。原始生殖细胞可以是来源于活体的原始生殖细胞，并且可以是从多能干细胞分化的原始生殖细胞样细胞(primordialgermcelllikecell：PGCLC)。例如，当从活体收集原始生殖细胞时，可以将原始生殖细胞与来自雌性胎鼠(11.5-12.5dpc)的性腺一起收集。当从活体收集性腺时，可以与中肾共同收集，或者中肾可以从性腺分离。用于本发明的“原始生殖细胞”还包括已经经历原始生殖细胞发育阶段并启动减数分裂的初级卵母细胞。本发明的方法也可以将这些初级卵母细胞分化为功能GV期卵母细胞。当在本发明的方法中使用初级卵母细胞时，它是卵泡形成开始之前的初级卵母细胞。如上所述，在本说明书中，术语“原始生殖细胞”包括从多能干细胞分化的原始生殖细胞样细胞(PGCLC)。术语“多能干细胞”是指具有“自我更新能力”以增殖维持未分化状态的未分化细胞和具有“多能分化能力”以分化成所有类型的外胚层细胞、内胚层细胞和中胚层细胞的未分化细胞。“多能干细胞”包括但不限于例如，诱导多能干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)、来源于原始生殖细胞的胚胎生殖细胞(EG细胞)、可以在用于建立GS细胞的培养过程中从睾丸组织分离的多能生殖细胞系干细胞(multipotentgermlinestemcell)(mGS细胞)、从骨髓间充质细胞分离的Muse细胞等。应该指出，ES细胞可以是通过体细胞核重编程产生的ES细胞。上面列出的多能干细胞可以分别通过已知的方法获得。iPS细胞是一些基因被导入的细胞，并且具有重编程为各种组织细胞或器官细胞的能力。在本发明中，可用于诱导原生殖细胞分化的iPS细胞可以是来源于从适当的供体采集的体细胞的原代培养细胞的细胞或来源于确立细胞株的细胞。由于iPS细胞可分化成任何外胚层细胞、内胚层细胞和中胚层细胞，因此用于制备iPS细胞的体细胞基本上可以是来源于任一类型的外胚层细胞和内胚层细胞的细胞。在本发明的该方面中，用于制备iPS细胞的体细胞优选易于收获、侵袭性较小的皮肤、毛发、牙龈、血液等的细胞。iPS细胞的制备方法可以根据本领域已知的方法进行。具体而言，可以使用例如公知的文献中公开的制造方法，例如OkitaK.等人，“Generationofgermline-competentinducedpluripotentstemcells.”Nature,448,313-317(2007)，HamanakaS.等人，“Generationofgermline-competentratinducedpluripotentstemcells”PLoSOne6(7),e22008(2011)和OhnukiM.等人，“Generationandcharacterizationofhumaninducedpluripotentstemcells.”CurrProtocStemCellBiol.JunChapter4:Unit4A.2,(2009)。在本发明中，用于诱导原始生殖细胞分化的ES细胞可通过已知方法获得。例如，可以通过从目标动物的受精卵的胚泡中收集内部细胞团并通过在来源于成纤维细胞的饲养细胞上培养内部细胞团来建立。此外，还可以使用通过培养由用体细胞核核移植产生的早期胚胎建立的ES细胞。诱导iPS细胞向原始生殖细胞分化的方法可以通过参考已知方法进行，例如非专利文献5，HayashiK.等人，“Reconstitutionofthemousegermcellspecificationpathwayinculturebypluripotentstemcells.”，Cell，Aug19，146(4)，519-32(2011)；HayashiK.等人，“Generationofeggsfrommouseembryonicstemcellsandinducedpluripotentstemcells.”NatureProtocols8,1513-1524(2013)；和SasakiK.等人，“RobustInvitroInductionofHumanGermCellFatefromPluripotentStemCells.”CellStemCellJul1，pii：S1934-5909(15)00299-4，doi:10.1016/j.stem.2015.06.014(2015)。诱导ES细胞分化为原始生殖细胞的方法可以通过参考已知方法进行，例如非专利文献5，HayashiK.，“Reconstitutionofthemousegermcellspecificationpathwayinculturebypluripotentstemcells.”CellAug19,146(4)，519-32(2011)；Nakaki等人，“Inductionofmousegerm-cellfatebytranscriptionfactorsinvitro”Nature，501,222-226(2013)；KimuraT.等人“InductionofPrimordialGermCell-LikeCellsFromMouseEmbryonicStemCellsbyERKSignalInhibition.”，StemCells32,2688-2678(2014)。当将来源于多能干细胞的PGCLC用作原始生殖细胞时，期望从多能干细胞群中去除未分化的细胞，未分化的细胞经处理用于分化诱导。这样的方法是已知的，例如可以用诸如通过前瞻性将编码包含Blimp1、原始生殖细胞标记物基因的融合蛋白和报告蛋白的核酸引入多能干细胞的荧光激活细胞分选(FACS)技术，容易地从由多能干细胞分化的PGCLC群中移除那些细胞。在本说明书中，“原始生殖细胞”包括来源于活体的原始生殖细胞和来源于通过上述基因工程方法修饰的多能干细胞的原始生殖细胞样细胞。作为对来源于活体的原始生殖细胞和来源于多能干细胞的原始生殖细胞样细胞进行基因修饰的方法，可以使用已知方法将目标核酸或载体导入上述细胞。例如，可以使用显微注射法、电穿孔法、脂质转染法、或用病毒载体转移核酸。用于导入外部基因或外部核酸片段的方法不限于上述方法，只要改进的原始生殖细胞可通过本发明的方法分化成功能卵母细胞即可。本领域技术人员可以在适当的时机对原始生殖细胞进行基因修饰。例如，在小鼠中，其可以在11.5dpc到12.5dpc期间进行。当使用来源于多能干细胞的原始生殖细胞时，可以在诱导分化成原始生殖细胞之前通过已知方法对多能干细胞进行基因修饰。这种基因修饰可以参照例如Watanabe等人，“Genetransfectionofmouseprimordialgermcellsinvitroandanalysisoftheirsurvivalandgrowthcontrol.”ExpCellRes230,76-83(1997)中描述的方法。术语“支持细胞”是指围绕原始生殖细胞并在性分化卵巢(sexual-differentiatedovary)中分化成颗粒细胞或膜细胞的细胞。由于支持细胞将来会分化为颗粒细胞或膜细胞，因此它可以用于与原始生殖细胞共培养。因此，原始生殖细胞的培养优选通过培养性腺本身或通过共培养彼此接触的原始生殖细胞和支持细胞来进行。当将来源于多能干细胞的PPGCLC用作原始生殖细胞时，可以将从活体收集的来源于性腺的体细胞用作支持细胞。当从活体收集的来源于性腺的体细胞用作支持细胞时，预先制备由来源于多能干细胞的PGCLC和来源于生殖细胞的体细胞构成的聚集体的培养步骤优选在“(a)通过在消除性类固醇激素(例如雌激素或具有与雌激素相似的功能的因子)的影响的条件下，培养原始生殖细胞和邻近原始生殖细胞的支持细胞来产生次级卵泡的步骤”前添加。可以根据非专利文献5中的方法进行用于收集来源于性腺的体细胞的方法和用于制备由来源于多能干细胞的PGCLC和来源于性腺的体细胞构成的聚集体的方法。例如，用于收集来源于性腺的体细胞的方法包括手术收集性腺并用胰蛋白酶等从性腺分离体细胞。在该方法中，优选去除活体来源的性腺内部存在的生殖细胞。去除性腺内部存在的这些生殖细胞的方法可以通过已知的方法进行。例如，那些内部存在的生殖细胞可以通过用抗SSEA1抗体或抗CD31抗体分选的磁性活化细胞来去除。用于收集体细胞作为支持细胞的性腺优选来源于胚胎。例如，在小鼠中，12.5dpc来自胎鼠的性腺是优选的。本领域技术人员可以根据本说明书的公开内容和本领域的常识，根据性腺来源的动物种类在适当阶段选择性腺。用于制备由来源于多能干细胞的PGCLC和来源于性腺的体细胞构成的聚集体的方法可以通过将来源于多能干细胞的PGCLC和来源于性腺的体细胞进行混合/凝集，以及通过用含有视黄酸(添加有15％KSR，1xGlutaMax，1x青霉素/链霉素(100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素)，100μM2-巯基乙醇和1μM视黄酸)的GK15培养基培养那些混合和凝集后的细胞而进行。具有低吸附性能的培养板优选用于培养。在小鼠中，制备聚集体的培养期为2至3天，优选2天。本领域技术人员可以根据动物种类设定合适的培养期。只要制备的聚集体能够形成次级卵泡和功能GV期卵母细胞，将来源于多能干细胞的PGCLC和来源于性腺的体细胞混合的比例就不受限制。例如，在小鼠中，来源于多能干细胞的PGCLCs的数量与来源于性腺的体细胞的数量之间的比例优选为约1:10。也可以使用冷冻保存的原始生殖细胞、冷冻保存的支持细胞或含有原始生殖细胞和支持细胞的冷冻保存的性腺。冷冻保存方法可以根据已知的方法进行。例如，原生殖细胞和支持细胞可以通过用10％DMSO培养基或市售的冷冻保存剂的缓慢冷冻方法进行冷冻保存，并且可以根据在下文实施例的“9.玻璃化保存和解冻”中描述的方法进行性腺的冷冻保存。可用于本发明的原始生殖细胞来源于哺乳动物，但不限于猪、牛、马、绵羊、山羊、狗、猫、兔，仓鼠、大鼠、小鼠和人类。本发明的方法包括“(a)通过在消除性类固醇激素(例如雌激素或具有与雌激素相似的功能的因子)的影响的条件下，培养原始生殖细胞和邻近原始生殖细胞的支持细胞来产生次级卵泡的步骤”。在步骤(a)中，在消除性类固醇激素(例如雌激素或具有与雌激素相似的功能的因子)的影响的条件下培养原始生殖细胞和邻近原始生殖细胞的支持细胞。当使用从活体采集的性腺时，不需要将原始生殖细胞和支持细胞与性腺分离，可以以将性腺保持原样、或分离的原始生殖细胞和支持细胞的聚集体、或一些组织切片的形式进行培养。在本说明书中，步骤(a)中的术语“培养原始生殖细胞和邻近原始生殖细胞的支持细胞”包括培养含有原始生殖细胞和支持细胞的性腺、分离的原始生殖细胞和分离的支持细胞的聚集体、或其一部分。只要能够获得功能卵母细胞，可以将原始生殖细胞和支持细胞从性腺分离出来并用于培养。当使用来源于多能干细胞的原始生殖细胞样细胞时，则如上所述，优选预先制备由来源于多能干细胞的PGCLC和来源于性腺的体细胞组成的聚集体。术语“原始生殖细胞”可以是启动减数分裂并处于形成卵泡之前的状态的初级卵母细胞。为此，术语“培养原始细胞”包括培养包含启动减数分裂并处于形成开始减数分裂的卵泡之前的状态的初级卵母细胞的性腺、分离的初级卵母细胞和支持细胞的聚集体、或其一部分。在本说明书中，术语“雌激素”意指由卵巢颗粒细胞中的雄激素代谢产生的性类固醇激素之一。释放的雌激素通过与雌激素受体结合而激活特定基因的转录。三种类型的雌激素，雌酮(E1)、雌二醇(E2)和雌三醇(E3)是已知的。在本说明书中，术语“雌激素”包括上述的雌激素类型。而且，在本说明书中，术语“性类固醇激素”包括除雌激素之外的雄激素，例如睾酮、二氢睾酮和雄酮。“具有与雌激素相似的功能的因子”或“具有与性类固醇激素相似的功能的因子”是具有与雌激素或性类固醇激素相同功能或与雌激素或性类固醇激素相似功能的因子。在本说明书中，术语“与雌激素相似的功能”或“与性类固醇激素相似的功能”是指在体外培养原始生殖细胞时的以下至少一种功能，(i)抑制来源于原始生殖细胞的卵母细胞中卵母细胞囊破裂的功能或(ii)抑制卵泡形成的功能。这种与雌激素或性类固醇激素具有相似功能的因子包括，例如，可与性类固醇激素受体(例如雌激素受体或雄激素受体)结合的因子。特别是，这样的因子包括酚红等。由于除了雌激素或雄激素以外，血清中还可能含有与雌激素具有相似功能的不明因子，所以优选的实施方式可以采用能够消除与雌激素或性类固醇激素具有相似功能的这些因子的影响的培养条件。“在消除性类固醇激素(例如雌激素或具有与雌激素相似的功能的因子)的影响的条件下”的培养包括在“性类固醇激素抑制剂”的存在下培养。“性类固醇激素抑制剂”包括雄激素抑制剂、雌激素抑制剂和雄激素抑制剂和雌激素抑制剂的组合。可用于本发明的“雌激素抑制剂”或“性类固醇激素抑制剂”是具有抑制雌激素受体或性类固醇激素受体活化的作用的物质，包括例如ICI182,780((7R,9S,13S,14S,17S)-7-(9-(4,4,5,5,5-五氟戊基亚磺酰基)壬基)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-13-甲基-6H-环戊二烯并[a]菲-3,17-二醇((7R,9S,13S,14S,17S)-7-(9-(4,4,5,5,5-Pentafluoropentylsulfinyl)nonyl)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-decahydro-13-methyl-6H-cyclopenta[a]phenanthrene-3,17-diol))，其是雌激素受体的拮抗剂。此外，市售试剂例如他莫昔芬柠檬酸盐，4-羟基他莫昔芬、MPP(4-[1-(4-羟苯基)-4-甲基-5-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-1H-吡唑-3-基]-苯酚)、PHTPP(4-[2-苯基-5,7-双(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]苯酚)和G15((3aS,4R,9bR)-4-(6-溴-1,3-苯并二氧戊环-5-基)-3a,4,5,9b-3H-环戊二烯并[c]喹啉)可用作这些抑制剂。另外，市售试剂如KW-365(N-[4-[(苄基)(4-硝基苯基)氨基]-1-甲基吡咯-2-羰基]吡咯烷)可用作性类固醇激素抑制剂中的雌激素抑制剂。雌激素抑制剂和性类固醇激素抑制剂不限于上述试剂，可以使用任何抑制剂，只要其具有抑制雌激素受体或性类固醇激素受体的活化的作用和使原始生殖细胞分化成功能卵母细胞的作用。抑制雌激素受体或性类固醇激素受体的活化控制了卵母细胞囊破裂和/或初级卵泡的形成。因此，优选在卵母细胞囊破裂解和/或初级卵泡形成之前添加雌激素抑制剂。不必从原始生殖细胞和邻近原始生殖细胞的支持细胞的培养开始，“在消除性类固醇激素(例如雌激素或具有与雌激素相似的功能的因子)的影响的条件下”进行培养。至少在卵母细胞囊破裂和/或初级卵泡形成时，优选“在消除性类固醇激素(例如雌激素或具有与雌激素相似的功能的因子)的影响的条件下”进行培养。下面以雌性激素抑制剂作为性类固醇激素抑制剂并将小鼠用作动物物种的实施方式作为示例进行解释：例如，在小鼠中，从17.5dpc至出生前后，大量的卵母细胞囊破裂。因此，优选从与这种胚胎年龄的时期相当的培养天数开始添加那些抑制剂。当性腺在12.5dpc时收集并且原始生殖细胞的培养从收集日期开始时，体外培养的第5天对应于17.5dpc。在含有雌激素抑制剂的培养基中培养的时期优选可以设定为卵母细胞囊破裂和卵泡形成完成的时期。当培养来自小鼠的原始生殖细胞时，其不限于，但优选从培养的第5天至第11天培养这些细胞6天。当培养来源于小鼠多能干细胞的PGCLC和体细胞的聚集体时，其不限于，但优选从培养开始的第7天至第10天培养聚集体4天，从开始培养初步制备的聚集体算起。以上，虽然说明了使用小鼠的实施方式，但是本领域技术人员可以根据每个动物物种中的卵母细胞囊破裂和卵泡形成的时机，使用“雌激素抑制剂”来设定培养期。除了使用“雌激素抑制剂”之外，优选将“在消除性类固醇激素(例如雌激素或具有与雌激素相似的功能的因子的影响)的影响的条件下”培养的时期设定为完成卵母细胞囊破裂和原始卵泡形成的时期。在这种条件下的培养可以从卵母细胞囊开始破裂时开始，或者可以在完全完成初级卵泡形成之前停止。从原始生殖细胞形成次级卵泡的培养期可以根据用于培养的原始生殖细胞来源的动物物种设定。作为培养期的指导，优选考虑从在活体中的原始生殖细胞形成次级卵泡的时期。当培养小鼠卵母细胞时，优选将卵母细胞培养至对应出生后10天左右的那天。例如，当从12.5dpc的胚胎雌性小鼠采集的卵母细胞用于培养时，优选从15天至18天培养卵母细胞。当培养来源于小鼠多能干细胞的PGCLC和体细胞的聚集体时，从初步制备的聚集体的培养的开始算起，优选从第11天至第21天培养聚集体。雌激素抑制剂和性类固醇激素抑制剂可用于添加到用于培养原始生殖细胞的已知的基础培养基中。这种基础培养基包括，例如α-MEM，PRMI1640，199，StemPro-34SFM，并且可以将血清或血清替代物加入这些基础培养基中。只要原始生殖细胞能分化成功能卵母细胞，可用于本发明步骤(a)的基础培养基不限于上述培养基。当在小鼠原始生殖细胞的培养中使用ICI182,780作为雌激素抑制剂时，优选将该试剂以0.01至50μM(终浓度)，更优选0.1至10μM(终浓度)添加至培养基。本领域技术人员可以根据原始生殖细胞来源的动物物种、使用的基础培养基和使用的雌激素抑制剂等调整雌激素抑制剂的添加时间或浓度。在没有添加雌激素抑制剂的培养期中，可以使用上述基础培养基进行培养。基础培养基可以任意地包含其他因子，如抗坏血酸和青霉素，除非该因子抑制原始生殖细胞成为功能卵母细胞的培养。“在消除性类固醇激素(例如雌激素或具有与雌激素相似的功能的因子)的影响的条件下”的培养的另一个实施方式是用无血清培养基培养。无血清培养基可以是已知的无血清培养基(例如，34SFM等制备成可直接使用的无血清培养基)，或者可以是用血清替代物制备的无血清培养基。当用血清替代物制备无血清培养基时，可以通过添加市售血清替代物如SPS(血清蛋白质替代品(SerumProteinSubstitute))、KSR(KnockOut血清替代品(KnockOutSerumReplacement))和SSS(血清替代品补充物(serumsubstitutesupplement))来代替FBS到基础培养基而制备无血清培养基。血清替代物优选为SPS或KSR。作为用于制备无血清培养基的基础培养基，可以使用已知的培养基如α-MEM、DMEM、PRMI1640、199和StemPro-34SFM。在本发明的步骤(a)中，只要原始生殖细胞能够分化成功能卵母细胞，可用于无血清培养基的基础培养基不限于上述那些。例如，在消除性类固醇激素(例如雌激素或具有与雌激素相似的功能的因子)的影响的条件下，在小鼠原始生殖细胞的培养中使用SPS代替血清(例如FBS)时，其浓度可以在5％至20％(终浓度)的范围内，更优选10％(终浓度)。本领域技术人员可根据原始生殖细胞来源的动物物种、使用的基础培养基和使用的雌激素抑制剂来调整血清替代物的浓度。使用无血清培养基进行培养的时期可以设定为完成卵母细胞囊破裂和卵泡形成的时期。在步骤(a)中原始生殖细胞的培养过程中，可以始终使用无血清培养基。本领域技术人员根据原始生殖细胞来源的动物种类、使用的基础培养基和使用的雌激素抑制剂调整将含血清培养基更换为无血清培养基的时机。在不使用无血清培养基期间的培养优选用上述补充了血清(如FBS)的基础培养基进行培养。如上所述，在性腺培养中，培养可以始终用无血清培养基进行。基础培养基可以任意地包含其他因子，如抗坏血酸和青霉素，除非该因子抑制原始生殖细胞成为功能卵母细胞的培养。在用于从原始生殖细胞形成次级卵泡的培养中，也可以使用如上所述的两种或更多种基础培养基的组合。例如，根据本发明的一个实施方式，可以使用α-MEM作为用于从原始生殖细胞形成次级卵泡的培养的前半期的基础培养基，并且StemPro-34SFM可以用作培养的后半期的基础培养基。尽管从原始生殖细胞形成次级卵泡通常可以用一种基础培养基来实现，但优选改变基础培养基，因为这种培养基变化可以增强颗粒细胞的增殖并且可以使得在分离形成的次级卵泡时卵泡结构是不可破坏的。这种促进颗粒细胞增殖的效果是特别希望的，特别是从由来源于多能干细胞的PGCLC和来源于性腺的体细胞构成的细胞聚集体形成次级卵泡时。例如，在由来源于小鼠多能干细胞的PGCLC和来源于性腺的体细胞构成的细胞聚集体的培养中，使用α-MEM和StemPro-34SFM这两种基础培养基时，优选可以使用α-MEM培养基在聚集培养开始后第4天到第8天改变为StemPro-34SFM培养基，更优选在培养开始后第4天改变为StemPro-34SFM培养基。在来源于小鼠性腺的原始生殖细胞的培养中，在相同时期可以进行培养基的替换。在步骤(a)中原始生殖细胞的培养中，优选在培养板(例如6孔板)使用已知的插入膜(例如-COL膜)。在培养期间，用于培养的培养基的一半量可以隔日替换为新鲜培养基。本领域技术人员可以根据例如要培养的原始生殖细胞来源的动物种类等任意选择培养板、插入膜和培养基改变时间等。本发明的方法可通过进一步体外培养由步骤(a)获得的次级卵泡来产生功能GV期卵母细胞。由于步骤(a)中可获得的次级卵泡构成性腺或性腺的一部分或性腺样组织或性腺样组织的一部分，因此可以在通过使用钨等物理分离次级卵泡后对每个次级卵泡进行培养。在本发明的方法中，次级卵泡的体外培养包括(b)部分地切割颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合的步骤，其中卵母细胞、颗粒细胞层和膜细胞层构成产生的次级卵泡。在通过步骤(a)获得的次级卵泡中，卵母细胞具有被颗粒细胞层包围的结构，其进一步被膜细胞层包围。在步骤(b)中，构成卵泡的颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合被部分地切割。可以通过酶处理和/或物理处理来切割颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合。在优选的实施方式中，结合可以通过酶处理和物理处理的组合来切割。以下将以使用小鼠的实施方式作为示例进行解释。关于在小鼠次级卵泡中切割颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合的酶处理，例如，可以通过用含有0.1％胶原酶型-I的L15培养基(WorthingtonBiochemicals，295u/mg)在37℃下保持15分钟处理来进行小鼠次级卵泡的处理。可以进行物理地(例如用玻璃毛细管或移液管进行移液)切割颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合。切割颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合可以以膜细胞层的全部或一部分从卵泡分离的状态为标准进行。部分地切割颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合使得培养基能够渗入结合被切割的部分，并且培养基可以直接接触颗粒细胞。在使用来源于小鼠活体的原始生殖细胞并且没有进行如步骤(b)的部分地切割颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合的步骤的实验中，不能获得功能卵母细胞。优选在卵泡培养开始的第0天至第7天，更优选培养的第2天至第4天进行颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合的切割处理。优选在次级卵泡分离后不立即进行切断颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合的处理并进行约1至3天的预培养，并且这样的实施方式能够使卵泡粘附到插入膜以及可以使卵泡更加稳定。用于预培养的培养基可以是用于步骤(c)的相同培养基。在一个优选的实施方式中，可以将GDF9和/或BMP15添加到用于预培养的培养基中。将这些化合物添加到用于次级卵泡预培养的培养基中可以进一步增强颗粒细胞的增殖，尽管添加这些化合物不是必需的。在小鼠次级卵泡的预培养中，例如，αMEM培养基可以含有10ng/ml至20ng/ml范围内的GDF9和/或BMP15。尽管上面解释了使用小鼠的实施方式，但本领域技术人员可以根据原始生殖细胞来源的动物物种、使用的基础培养基和使用的酶，任意地调整实验条件，例如部分地切割颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合的时间以及酶处理的浓度和时期。根据本发明的方法在次级卵泡的体外培养中，包括在上述步骤(b)之后的(c)通过在含有高分子化合物的培养基中培养构成次级卵泡的卵母细胞、颗粒细胞层和膜细胞层，使卵母细胞分化为功能GV期卵母细胞的步骤。在根据本发明的次级卵泡的体外培养中，使用通过将高分子化合物添加至基础培养基而制备的培养基。基础培养基包括用于生殖细胞系培养的已知培养基，例如α-MEM、DMEM、PRMI1640和199。除了高分子化合物之外，基础培养基可具有适合于培养细胞的改动。例如，基础培养基可以任意地含有胎牛血清(FBS)，促卵泡激素(FollicleStimulatingHormone；FSH)等。在根据本发明的步骤(c)中，加入到培养基中的“高分子化合物”是具有几万至几百万分子量的有机化合物，并且它包括天然聚合物(生物聚合物等)和合成聚合物两者。特别是，本发明中使用的“高分子化合物”在培养时在培养基中优选具有例如对水的高溶解性、毒性极低、无pH不稳定性等特性，其原始特性长期保持稳定。用于本发明的高分子化合物包括例如合成聚合物、多糖、蛋白质、蛋白多糖等。合成聚合物包括例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP；约360,000分子量)和聚乙烯醇(PVA；约70,000-100,000分子量)。多糖包括例如葡聚糖(Dextran)、羟乙基化淀粉和纤维素衍生物(例如羟丙基甲基纤维素)。此外，多糖包括例如(400,000分子量)，其是蔗糖和糖胺聚糖(例如透明质酸和硫酸软骨素)的合成聚合物。蛋白质包括例如血清白蛋白(约69,000分子量)和包括例如硫酸软骨素蛋白聚糖的蛋白聚糖。在本发明中，优选的高分子化合物不限于PVP、羟丙基甲基纤维素和血清白蛋白。除了上述化合物之外，用于本发明的高分子化合物包括表现出相似性质的已知的化合物或将来发现或合成的化合物。可用于本发明的表现出“相似性质”的化合物是满足培养中使用要求的化合物，该化合物不损害卵母细胞的存活能力，包围卵母细胞的体细胞(如颗粒细胞和膜细胞)没有剥离，没有失去以卵母细胞为中心的结构(不发生不规则和广泛的细胞增殖)等，并且对分化成功能卵母细胞没有影响。添加的高分子化合物的浓度根据目标卵母细胞的动物种类而不同。例如，该化合物可以以约1至约12％(w/v)的浓度用于基础培养基。在小鼠中，该化合物可以优选以1至8％(w/v)，更优选1至4％，最优选2％(w/v)使用。在猪和牛中，该化合物可以优选以2至8％(w/v)，更优选2至4％(w/v)，最优选4％(w/v)使用。尽管高分子量的浓度足以实现本发明的目的，但是在其他范围内的浓度也可以完成该目的。具体而言，在低浓度下显示高粘度的化合物(例如羟丙基甲基纤维素和糖胺聚糖)可以以其他范围的浓度使用。例如，在猪或牛的卵母细胞的培养中，使用1％(w/v)的某种类型的羟丙基甲基纤维素的实验中，由卵母细胞和体细胞组成的复合体的形态类似于使用在2至4％(w/v)范围内的PVP(360,000分子量)的实验的良好结果，这意味着这样的浓度可以实现本发明的目的。事实上，高分子化合物(例如PVP和PVA)通常用于卵母细胞的培养基中。特别是，可以将其作为高分子替代物添加到不含胎牛血清或血清白蛋白的培养基中。在这种情况下，其有助于通过避免与培养板中的底表面或壁表面以及与用于胚胎手术的超细玻璃管的内外表面接触来防止卵母细胞受损。约0.1％至约0.4％范围内的浓度通常足以实现这样的目的，并且通常将浓度调节至在该范围内。当将血清加入到基础培养基中时，通常情况下不添加高分子化合物。相比之下，本发明可以通过将浓度增加至约1％至约12％来引起完全不同的效果，而常规使用的在约0.1％至约0.4％的范围内的浓度不能明确本发明的效果。因此，在本发明中，根据目标卵母细胞的动物种类，重要的是加入的高分子化合物是0.4％的常规使用浓度的2.5倍或更高。在猪或牛的卵母细胞的培养中，优选高分子化合物的添加是0.4％的常规使用浓度的约5至10倍或更高。在小鼠卵母细胞的培养中，优选高分子化合物的添加是0.4％的常规使用浓度的约2.5至5倍或更高。步骤(c)中次级卵泡培养的时期可以设定为从次级卵泡中的卵母细胞形成功能GV期卵母细胞的时期，这取决于用于培养的原始生殖细胞的动物物种。例如，在小鼠中，将通过步骤(a)得到的次级卵泡在步骤(c)中培养时，可以优选地进行例如从12天至16天的培养。如上所述，步骤(b)可以在次级卵泡培养开始时或之后的适当时机进行。根据本发明，上述步骤(a)至(c)能使原始生殖细胞体外分化成功能GV卵母细胞。在本说明书中，术语“功能GV期卵母细胞”是指(i)具有通过体外成熟而成熟为卵子的能力的GV期卵母细胞，和(ii)具有通过与精子受精发育成正常后代的能力的GV期卵母细胞，以及(iii)来源于后代具有产生正常下一代的能力的GV期卵母细胞。根据本发明的一个实施方式，还提供了通过体外成熟培养由上述卵泡的体外培养获得的GV期卵母细胞以恢复减数分裂来产生功能卵子的方法。在本说明书中，术语“卵子”是指达到并停止在第二次减数分裂(减数分裂II)的中期阶段的卵子。此外，在本说明书中，术语“功能卵子”是指(ii)具有通过与精子受精发育成正常后代的能力的卵子，和(iii)来源于后代具有产生正常下一代的能力的卵子。通过本发明的次级卵泡的体外培养获得的GV期卵母细胞可以通过使用通常用于未成熟卵母细胞的体外成熟的培养方法成熟至卵子，并且可以使用所获得的卵子。对于成熟培养的转变，一般来说，从完成培养卵母细胞发育的培养板中收集COC，使用用于成熟培养的培养基冲洗，并转移到最终用于成熟培养的培养基中。成熟培养基可以通过将基本因子(例如丙酮酸钠和抗生素)添加到用于培养生殖细胞系的已知基础培养基(如α-MEM和199)并通过进一步将促性腺激素、生长因子、血清、卵泡液等任意地添加到培养基而制备。对于卵母细胞的成熟培养优选的培养条件已被广泛研究并且在本领域中是已知的。培养板放置的培养箱可以在与常规使用的相同的条件下使用。以这种方式成熟的卵子除了用于常规的体外受精，还可以用于受体卵母细胞以产生孤雌生殖发育胚胎或克隆动物。本发明的一个方面提供了用于在体外将原始生殖细胞分化成功能卵母细胞或卵子的试剂盒。根据本发明的试剂盒可以包括性类固醇激素抑制剂(雌激素抑制剂和/或雄激素抑制剂)、无血清培养基、血清替代物、用于切割细胞间的结合的酶、或高分子化合物、或其组合。在优选的实施方式中，试剂盒包括选自由以下所组成的组的至少两种的组合：(1)性类固醇激素抑制剂(雌激素抑制剂和/或雄激素抑制剂)、无血清培养基或血清替代物，(2)用于切割细胞之间的结合的酶，或(3)高分子化合物。在更优选的实施方式中，试剂盒包括以下三种成分：(1)性类固醇激素抑制剂(雌激素抑制剂和/或雄激素抑制剂)、无血清培养基或血清替代物，(2)用于切割细胞之间的结合的酶，和(3)高分子化合物。该试剂盒可以包括器官培养或成熟培养所必需的其他试剂或仪器，如培养皿。使用下面的实施例更详细地解释本发明。本发明不限于下面描述的实施例的实施方式。本说明书中公开的出版物将通过引用并入。实施例在下面的实施例中，所有的动物都是从日本CLEA公司购买的。BDF1小鼠的12.5dpc胚胎是通过使DBA/2J雄性小鼠与C57BL/6N雌性小鼠交配而得到的。此外，作为对照区，使用BDF1(C57BL/6N×DBA/2J杂交)10日龄和成年雌性小鼠。另外，在下述实施例中，雄性BDF1小鼠用作精子供体。此外，在培育伪妊娠雌性小鼠时，使ICR雌性小鼠与结扎的ICR雄性小鼠交配。所有的试验都得到了东京农业大学动物实验委员会的批准。(1.性腺的体外器官培养)相对于基础培养基，用于器官培养的培养基是使用了以下面每个试验区的浓度补充有FBS(Gibco，美国生命技术公司)、SPS(SAGE体外受精)、KSR(Gibco，美国生命技术公司)、雌激素受体拮抗剂ICI182,780(7α,17β-[9-[(4,4,5,5,5-五氟戊基)亚磺酰基]壬基]雌-1,3,5(10)-三烯-3,17-二醇；Tocris生物科学)、4-羟基他莫昔芬(Sigma-Aldrich)和MPP(甲基哌啶子基吡唑；CaymanChemical)的培养基。基础培养基中(以下将该基本培养基称为α-MEM)，使用含有1.5mM2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(东京化学工业株式会社)，10单位/mL青霉素和10μg/mL链霉素(Sigma-Aldrich)的α-MEM培养基(Gibco，美国生命技术公司)。如下制备ICI182,780和4-羟基他莫昔芬。使用DMSO将ICI182,780和4-羟基他莫昔芬稀释至100mM以制备冷冻保存的储备物。使用DMSO将MPP稀释至10mM以制备冷冻保存的储备物。在使用前通过用DMSO稀释100mM储备液100倍而制备ICI182,780和4-羟基他莫昔芬的1mM溶液，并将其以每个试验区的指定终浓度加入到培养基中。在使用前将MPP加入培养基中，使最终浓度为1μM。在12.5dpc时，用于器官培养的性腺与来自雌性小鼠胚胎的中肾一起收集或不与来自雌性小鼠胚胎的中肾一起收集(图1a)。向用于器官培养的每个6孔培养板中加入2.2ml培养基。将-COL膜(3.0μm孔径，24mm直径；Corning)置于6孔培养板的每个孔中。将性腺转移到膜上并在37℃、5％CO2和95％空气下培养17天。每个孔中大约一半的培养基每隔一天用新鲜培养基更换。在性腺与中肾共同培养的实施例中，在器官培养的第7天从性腺移除中肾。根据以下描述的条件进行性腺的体外器官培养。在下面的每个条件下培养性腺共17天(图2)：(i)用含有10％FBS的α-MEM(α-MEM+FBS；FBS区)完整培养17天；(ii)用含有10％SPS的α-MEM(α-MEM+SPS；SPS区)完整培养17天；(iii)用含有10％KSR的α-MEM(α-MEM+KSR；KSR区)完整培养17天。(iv)用含有10％FBS的α-MEM培养4天，从第5天开始转换为用含有10％SPS的α-MEM培养6天，并且从第11天转换为用含有10％FBS的α-MEM培养直至第17天(α-MEM+FBS/SPS；FBS/SPS区)；(v)用含有10％FBS的α-MEM培养4天，从第5天开始转换为用加入10nM、100nM、1μM、5μM或10μM(终浓度)ICI的含有10％FBS的α-MEM培养6天，并且从第11天转换为用含有10％FBS的α-MEM培养直至第17天(α-MEM+FBS/10nMICI；FBS/10nMICI区，α-MEM+FBS/100nMICI；FBS/100nMICI区，α-MEM+FBS/1μMICI；FBS/1μMICI区，α-MEM+FBS/5μMICI；FBS/5μMICI区，或α-MEM+FBS/10μMICI；FBS/10μMICI区)；(vi)用含有10％FBS的α-MEM培养4天，从第5天开始转换为用加入1μM(终浓度)4-羟基他莫昔芬的含有10％FBS的α-MEM培养6天，并且从第11天转换为用含有10％FBS的α-MEM培养直至第17天(α-MEM+FBS/1μM他莫昔芬；FBS/1μM他莫昔芬区)；(vii)用含有10％FBS的α-MEM培养4天，从第5天开始转换为用加入1μM(终浓度)MPP的含有10％FBS的α-MEM培养6天，并且从第11天转换为用含有10％FBS的α-MEM培养直至第17天(α-MEM+FBS/1μMMPP；FBS/1μMMPP区)。在上述每个试验区的器官培养条件下，通过培养性腺获得卵巢。在光学显微镜下的获得的卵巢的图像显示在图3中。在(i)FBS区中获得的卵巢中，卵泡之间的边界不清楚，一部分膜细胞与相邻卵泡共用，表现出异常的卵泡形成(图3a)。另一方面，在(ii)SPS区中，FBS区中观察到的异常得到改善(图3b)。此外，在(ⅳ)FBS/SPS区中获得的卵巢中的异常得到改善。在(v)FBS/ICI区中获得的卵巢中，异常被显著改善，清楚地观察到每个卵泡的圆形(图3d)。从性腺的体外器官培养中获得的卵巢收集次级卵泡。比较每个试验区从一个卵巢获得的次级卵泡的数量，并且图4显示了其结果。在(i)FBS区中，从有或没有中肾的一个卵巢仅收集到约4-6个次级卵泡，而在(ii)SPS区中，从一个卵巢收集约12个次级卵泡。在(iii)KSR区中，从一个卵巢收集约15个次级卵泡。在(iv)FBS/SPS区中，从一个卵巢收集21个次级卵泡。另一方面，在(v)ICI添加区中，与ICI的浓度相关地，从一个卵巢收集的卵泡数量是17个(FBS/10nMICI区)、32个(FBS/100nMICI区)、44个(FBS/1μMICI区)、53个(FBS/5μMICI区)和82个(FBS/10μMICI区)，并且相对于FBS区，均显示出有意的增加(图4)。同样，在(vi)FBS/1μM他莫昔芬区中，从一个卵巢收集25个次级卵泡，并且在(vii)FBS/1μMMPP区中，从一个卵巢收集15个次级卵泡。(2.通过体外培养获得的卵巢的组织学分析)在(i)FBS区或(v)FBS/10μMICI区中培养17天的卵巢和出生后10天雌性小鼠的卵巢进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin)染色和层粘连蛋白免疫荧光染色。具体地说，将卵巢在室温下在含有1％多聚甲醛(PFA)/0.1％戊二醛的0.05M磷酸盐缓冲液中固定4小时。对于H&E染色，在常规方法后将卵巢包埋在石蜡块中，制备4μm厚的连续切片。H&E染色后，在IX71显微镜(奥林巴斯)下观察切片。为了对层粘连蛋白进行免疫染色，将卵巢切成四至八块，并分别将卵巢的组织切片在4℃下与1:100稀释的兔抗层粘连蛋白多克隆抗体(Abcam)一起反应3天。然后将卵巢的组织切片在4℃与1:500稀释的AlexaFluor488标记的山羊抗兔IgG抗体(MolecularProbes，美国生命技术公司)一起反应3天。使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；美国生命技术公司)将获得的卵巢组织切片进一步染色。在ZeissLSM710共聚焦显微镜下观察卵巢的组织切片。苏木精-伊红染色和层粘连蛋白免疫荧光染色的结果如图5所示。(v)FBS/10μMICI区的卵巢与来自出生后第10天的雌性小鼠的卵巢相同地，在Z轴上的所有面，层粘连蛋白均以圆形包围卵泡的方式局部存在。另一方面，在(i)FBS区中，几乎未观察到在Z轴上连续且环绕定位的层粘连蛋白。尽管(i)FBS部分的一些卵巢显示出环绕定位的层粘连蛋白，但在这些卵巢中观察到多卵母细胞卵泡(一种卵泡中存在多个卵母细胞的现象)(图5a)。然而，在(v)FBS/ICI区，这种现象很少(图5b)。在(v)FBS/ICI区中，显示与来自出生后第10天雌性小鼠的卵巢相同的图像(图5c)，并且卵泡形成得到改善。(3.次级卵泡的体外生长培养)通过来自胚胎的性腺的体外器官培养获得的次级卵泡被处理用于体外生长培养。本发明人揭示了向小鼠次级卵泡的体外生长(IVG)培养基中添加高分子化合物是有效的(专利文献1)。在本实施例中，培养是用补充有高分子化合物的PVP的培养基进行的。此外，发明人发现卵母细胞可以通过切割构成次级卵泡的颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合的一部分而发育成功能卵子。因此，在该实施例中，卵泡的体外培养包括部分地切割颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合的步骤。更具体地说，卵泡的体外培养如下进行。在上述“1.性腺的体外器官培养”的培养17天之后，将培养的性腺(卵巢)转移到L15培养基中，使用细钨针从性腺中分离性腺中形成的次级卵泡。次级卵泡在补充有2％(w/v)PVP、5％FBS和0.1IU/mLFSH(FOLLISTIMInjection50；MSD)的α-MEM中进一步培养。次级卵泡在Millicell膜(0.4-μm孔径，27-mm直径；MerckMillipore)上在35-mm培养皿(Falcon，Corning)中培养。在培养的第3天，将次级卵泡转移至含有0.1％I型胶原酶(WorthingtonBiochemicals)的L15培养基，并在37℃处理15分钟。然后，使用玻璃毛细管通过移液操作去除次级卵泡的膜细胞层。将50-60个次级卵泡在5％CO2和95％空气中、在37℃下、在培养基中在-COL或Millicell膜上再培养另外的9至13天。膜的内部和外部分别填充1mL和2mL培养基。大约一半的培养基每隔一天用新鲜培养基替换。根据上述的体外培养，从(ii)SPS区、(iv)FBS/SPS区和(v)FBS/ICI区的卵母细胞发育的约26-57％的卵泡从卵泡的体外生长培养开始的第12至第16天充分生长(在FBS/10μMICI区中通过体外培养获得的卵母细胞的平均直径为80.0μm(n＝85)，从活体获得的卵母细胞的平均直径是89.9μm(n＝74))。可以从这些卵泡中分离发育的卵丘细胞-卵母细胞复合体(COCs)(图6a和6b，以及图7)。(4.通过激素测定评估卵泡培养)为了评估次级卵泡的体外培养过程中的类固醇生成，测量培养基中的孕酮和雌二醇水平。更具体地说，通过(v)FBS/10μMICI区的器官培养获得的次级卵泡以上述3中所述的次级卵泡的体外生长培养相同的方式进行培养(胶原酶处理后的50-60个次级卵泡放置在一个-COL膜上并培养17天)。在体外生长培养的第3天后，每两天用新鲜培养基替换一半培养基。使用酶免疫测定试剂盒(Cayman)重复测量培养基中的黄体酮和雌二醇水平。根据制造商的说明进行酶免疫测定。结果如图8所示。如图8所示，培养基中黄体酮和雌二醇水平随时间而增加。这一结果表明，根据“3.次级卵泡的体外培养”方法体外生长培养的次级卵泡具有与活体内发育中的卵泡相同的类固醇生成能力。(5.通过次级卵泡的体外培养获得的卵母细胞中印迹基因位点的DNA甲基化分析)为了评估由上述的“3.次级卵泡的体外培养”获得的卵母细胞是否是功能卵母细胞，验证了个体发育所必需的甲基化印迹是否被正确修饰。具体来说，分析如下进行。从在FBS/10μMICI区获得的来源于GV期的体外生长培养的卵母细胞、以及从来源于本发明的体外培养方法的卵母细胞中获得的后代中分离DNA。然后用亚硫酸氢钠(Qiagen)处理分离的DNA以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。亚硫酸氢钠处理的DNA用下表1中所述的引物进行PCR。将PCR产物克隆到pGEM-TEasy载体(Promega)中并在ABIPRISM3100系统(AppliedBiosystems)上测序。使用QUMA软件(Kumaki,Y.等人，“QUMA:quantificationtoolformethylationanalysis.”NucleicAcidsRes36,W170-175,doi:10.1093/nar/gkn294(2008))在每个印迹基因位点对每个样品中至少20个质粒DNA克隆进行测序。[表1]DNA甲基化分析结果示于图9和图10中。图9显示了通过由表1中2nd表示的引物序列克隆的区域的H19和Igf2r在本发明的体外培养获得的卵母细胞中的甲基化状态。图10显示了从通过本发明的体外方法(#1和#2)获得的卵母细胞发育的后代中的DNA甲基化状态和从成年小鼠(#3)的GV期卵母细胞发育的后代中的DNA甲基化状态。在图9和10中的结果证实，即使在体外培养中也可以在卵子形成中建立母体甲基化印记。(6.体外成熟为卵子)为了评估由上述“3.次级卵泡的体外生长培养”获得的卵母细胞是否正常地完成了减数分裂，卵子的体外成熟培养如下进行。从由上述“3.次级卵泡的体外生长培养”获得的次级卵泡收集卵丘细胞-卵母细胞复合物(COCs)。然后，用含有5％FBS，0.1IU/mLFSH，1.2IU/mL绒毛膜促性腺激素(Gonatropin，ASKA制药)和4ng/mL表皮生长因子(Gibco，赛默飞世尔科技公司)的α-MEM培养COCs，持续17个小时。在用马CG(Serotropin；ASKA制药)注射后44小时从成年雌性小鼠收集对照COC。以与来源于体外的COCs相同的方式，将来自成年雌性小鼠的COCs(即，体内来源的COCs)用含有5％FBS，0.1IU/mLFSH，1.2IU/mL绒毛膜促性腺激素和4ng/mL表皮生长因子的α-MEM培养。作为体外成熟的结果，在(ii)SPS区，(iv)FBS/SPS区和(v)FBS/ICI区中，77-95％卵母细胞释放第一极体，并且直至第二减数分裂中期达成熟(图11b和c)。(7.核型分析)为了评估卵母细胞在体外成熟培养过程中是否正常进入减数分裂，如下进行卵母细胞核型分析。在第二次减数分裂中完全生长的卵母细胞在室温下在0.6％柠檬酸钠中培养5分钟，然后用Carnoy's溶液涂布在载玻片上。染色体用DAPI染色，并使用ZeissLSM710共焦显微镜(CarlZeiss)分析核型。作为核型分析的结果，卵母细胞是单倍体(N＝20)，它们的减数分裂正常进行(图11a)。(8.用体外成熟的卵子进行体外受精和胚胎移植)为了评估通过上述“6.体外成熟为卵子”的方法获得的卵子是否具有发育成为后代的能力，进行体外成熟的卵子的体外受精和胚胎移植。培养17小时后，将具有扩大的卵丘细胞的卵子转移到TYH培养基(LSIMedienceCorporation)中，并用附睾的精子进行受精。在(ii)SPS区，(iv)FBS/SPS区，(v)FBS/ICI区中，用于体外受精(IVF)的约27％至58％的卵子正常受精。正常情况下，将具有2个原核的受精卵在KSOM培养基中培养。在受精卵中，约83％至97％的胚胎发育至2-细胞期。通过培养发育至2-细胞期的胚胎在0.5dpc时被转移至假孕雌性小鼠(寄养母体)的输卵管中。后代通过自然方式分娩或在19.5dpc时剖宫产分娩。结果，大约14％到40％的转移的胚胎发育成后代。获得的后代是由寄养母体抚养的。后代在大约4周龄时断奶。该结果表明，尽管使用来自胚胎期的原始生殖细胞作为起始材料，但该方法可以高效产生后代。如上所述，还没有关于通过体外培养获得的卵子，其中原始生殖细胞被用作发育成后代的起始材料的报道。尽管有报道说从卵子获得了后代，该卵子通过来自新生儿的非生长期卵母细胞的培养获得，但是本说明书中的结果显著高于之前报道的从胚胎转移发育的后代的百分比(约5.7％)。在根据本发明的用于从原始生殖细胞产生功能卵子的体外培养方法中，从一个卵巢最多获得7只幼体，并且平均从一个卵巢获得0.3至3.3只幼体。幼体身体正常，并且正常发育。在体外培养分化和成熟的卵子中发育出的雄性和雌性小鼠在性成熟后可产生下一代(表2和图12)。表3显示了本实施例(试验区)中获得的幼体和使用来自活体(对照区)的卵母细胞获得的幼体的性别比(表2a)和出生体重(表2b)。[表2]ab试验区1.53±.538g对照区1.63±.638g(9.玻璃化保存和解冻)为了评估根据本发明的使原始生殖细胞分化成功能卵母细胞和卵子的方法是否可以应用于经冷冻保存的原始生殖细胞或玻璃化保存的胚胎的性腺，进行了以下实验。通过参考记载于Wang，X.等人，“Successfulinvitrocultureofpre-antralfolliclesderivedfromvitrifiedmurineovariantissue：oocytematuration，fertilization，andlivebirths.”Reproduction141，183-191(2011)中的方法，如下进行玻璃化保存和解冻。首先，配制含有4mg/mLBSA(Sigma-Aldrich)，10％(v/v)乙二醇(Wako)和10％(v/v)DMSO(Sigma-Aldrich)的L15培养基，作为用于玻璃化保存的溶液1。然后，配制含有4mg/mLBSA，17％(v/v)乙二醇，17％(v/v)DMSO和0.75M蔗糖(Wako)的L15培养基，作为用于玻璃化保存的溶液2。按照如下方法进行生殖组织的玻璃化保存。将从12.5dpc雌性胚胎采集的性腺切分成两到三块组织片。将获得的性腺组织浸入2mL的用于玻璃化保存的溶液1中。20分钟后，将性腺组织浸入2mL的用于玻璃化保存的溶液2中。3分钟后，将性腺组织转移至具有3μL的用于玻璃化保存的溶液2的冷冻管(Iwaki，AsahiGlassCo.)中并冷冻保存在液氮中。为了解冻玻璃化的性腺组织，将1mL的0.5M蔗糖溶液加入到冷冻管中，然后通过移液混合。然后每5分钟用0.25M，0.125M和0M蔗糖溶液依次洗涤性腺组织。解冻的性腺组织在上述“1.性腺的体外器官培养”的FBS/1μMICI区的条件下进行器官培养，并且从器官培养后的组织中分离的卵泡按照上述“6.通过体外培养成熟为卵子”中描述的方法进行体外培养。然后，通过“8.用体外成熟的卵子进行体外受精和胚胎移植”中描述的方法对获得的卵母细胞进行评估。与非玻璃化卵巢相比，从来源于玻璃化保存的卵巢的一个卵巢中获得的卵母细胞数量(可从一个卵巢获得约14个卵泡)减少。然而，如上所述的通过体外成熟培养该卵泡13至16天获得的卵母细胞在成熟培养后可以分化为卵子，并且该卵子可以发育成后代。表3显示了从由原始生殖细胞的体外培养获得的卵子、从由次级卵泡的体外培养获得的卵子、从由卵母细胞的体外成熟培养获得的卵子发育的后代的效率的比较结果。以下表3所示的所有试验区与上述实施例同样地，进行在次级卵泡的体外培养中部分地切割环绕卵母细胞的颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合的步骤(b)和在上述切割步骤之后在含有高分子化合物的培养基中培养卵母细胞和颗粒细胞复合物的步骤(c)。如上所述，在本申请之前，在以原始生殖细胞作为起始材料以获得卵子的体外培养方法中，不能获得功能卵子。然而，根据本发明的方法(SPS区，SPS/FBS区，FBA/1μMICI区，FBS/5μMICI区，FBS/10μMICI区，玻璃化FBS/1μMICI区)，该方法可以以原始生殖细胞为起始材料高效得产生后代。在下面的表3中，所描述的百分比值与所收集的COC数、成熟的卵母细胞数量、正常受精的卵子数量、发育为2-细胞的胚胎数量或出生的小鼠的数量一起显示了相对于收集的卵泡数量的每个比例(在GV区(对照区)，百分比的值显示了相对于收集的COC数量的每个比例)。[表3](10.用来源于多能干细胞的PGCLC产生功能GV期卵母细胞和功能卵子的体外培养方法)在该实施例中，进行实验以评估本发明的体外培养是否可以从来源于多能干细胞的PGCLC产生功能GV期卵母细胞和功能卵子。在该实施例中，由ES细胞和iPS细胞产生PGCLC的方法以与文献“HayashiK.等人，‘Reconstitutionofthemousegermcellspecificationpathwayinculturebypluripotentstemcells.’Cell,Aug19,146(4),519-32(2011)”中描述的方法相同的方式进行，除非另有说明。以与文献“HayashiK.,等人,‘OffspringfromOocytesDerivedfrominvitroPrimordialGermCell-likeCellsinMice.’Science338,971-975(2012)(非专利文献5)”中描述的方法相同的方式进行诱导多能干细胞分化后的PGCLC的纯化、从胚胎性腺制备体细胞、以及纯化的PGCLC和来源于胚胎性腺的细胞的聚集体的制备方法，除非另有说明。<I材料><I-1.ES细胞>本实施例中使用的ES细胞是由Blimp1-mVenus和Stella-ECFP(BVSC)诱导的小鼠(杰克逊实验室)胚泡建立的ES细胞系。Blimp1是PGC样细胞(PGCLC)标记基因，Stella是PGCLC和卵母细胞标记基因。本实施例中使用的ES细胞的核型是具有40条染色体(38XX)的雌性细胞的核型。<I-2.iPS细胞>在该实施例中，使用的iPS细胞是通过在12dpc将Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc引入来自小鼠胚胎的成纤维细胞获得(Okita等人,“GenerationofMouseInducedPluripotentStemCellsWithoutViralVectors”ScienceNov7；322(5903):949-53)。带有Blimp1-mVenus和Stella-ECFP的小鼠胚胎用于本实施例的iPS细胞制备。<I-3.胚胎性腺细胞>在该实施例中，在用于形成来源于PGCLCs的次级卵泡的体外培养之前制备PGCLCs和来源于性腺的体细胞的聚集体。在12dpc从雄性小鼠胚胎收集与PGCLCs聚集的体细胞。具体地说，在从小鼠胚胎中手术分离性腺后，通过用0.05％胰蛋白酶在37℃处理10分钟来解离构成性腺的细胞。然后，通过磁激活细胞分选去除来源于胚胎性腺的生殖细胞。除了使用被抗SSEA1抗体和抗CD31抗体包覆的磁珠(MiltenyiBiotec)之外，以与非专利文献5中的方法相同的方式进行磁激活细胞分选。<II.方法><II-1.从多能干细胞诱导PGCLC>根据文献“HayashiK.etal.,‘Reconstitutionofthemousegermcellspecificationpathwayinculturebypluripotentstemcells.’Cell,Aug19,146(4),519-32(2011)”中描述的方法从ES细胞或iPS细胞诱导PGCLC。用于诱导PGCLC的ES/iPS细胞在含有2i(PD0325901，0.4μM：Stemgent，圣地亚哥，加利福尼亚州；CHIR99021，3μM：Stemgent)和LIF(1000u/ml)的N2B27培养基中在无饲养的条件下培养2天(5％CO2，95％空气，37℃下进行。下列实验在相同条件下进行)。接下来，通过在含有激活素(20ng/ml)、bFGF(12ng/ml)和KSR(1％)的N2B27培养基中用人血浆衍生的纤连蛋白包被的培养皿培养2天，将ES/iPS细胞分化成上胚层样细胞(EpiLCs)。通过在无血清培养基(GK15；具有15％KSR、0.1mMNEAA、1mM丙酮酸钠、0.1mM2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素和2mML-谷氨酰胺的GMEM(Invitrogen))中在存在BMP4(500ng/ml；R&DSystems)、LIF(1000u/ml；Invitrogen)、SCF(100ng/ml；R&DSystems)和EGF(50ng/ml；R&DSystems)的情况下在低细胞结合96-孔培养皿(NUNC)中以漂浮状态培养EpiLC6天，并诱导分化成PGCLC。为了从未分化的细胞中分离分化的PGCLC，通过荧光激活细胞分选(FACS)用流式细胞仪(AriaII，BDBiosciences)从含有由ES细胞或iPS细胞诱导的PGCLC的细胞群分离BV阳性细胞(标志已分化的PGCLC)。在以下实施例中，术语“PGCLC”包括来源于ES细胞的PGCLC和来源于iPS细胞的PGCLC。来源于ES细胞的PGCLC和来源于iPS细胞的PGCLC分别在相同条件下用于以下实施例中。<II-2.PGCLC和来源于性腺的体细胞的聚集培养>根据非专利文献5中描述的方法进行PGCLC和来源于性腺的体细胞的聚集培养。特别地，PGCLC和来源于性腺的体细胞在包含维甲酸的GK15培养基(GMEM具有15％KSR、1×GlutaMax、1×青霉素/链霉素、100μM2-巯基乙醇和1μM维甲酸)中以1:100的比例混合。在低细胞结合96-孔培养皿(NUNC)上，以构成聚集体的细胞数量为约5500细胞/孔的比例的方式播种，并培养2天，以产生PGCLC和来源于性腺的体细胞的聚集体。<II-3.次级卵泡的产生>由以上<II-2.PGCLC和来源于性腺的体细胞的聚集培养>获得的PGCLC和来源于性腺的体细胞的聚集体通过以下的体外培养形成次级卵泡。在该实施例中，两种基础培养基用于培养PGCLC和来源于性腺的体细胞的聚集体。从培养的第0天到第4天，使用补充有2％胎牛血清(FCS)、150μM抗坏血酸、1×GlutaMax、1×青霉素/链霉素和55μM2-巯基乙醇的α-MEM(IVD-αMEM培养基)。从第5天起，使用补充有10％FCS、150μM抗坏血酸、1×GlutaMax、1×青霉素/链霉素和55μM2-巯基乙醇的StemPro-34SFM(IVD-SP培养基)(美国生命技术公司)。在PGCLC和来源于性腺的体细胞的聚集体培养的第7天至第10天期间，使用补充有ICI182,780(500nM)的IVD-SP培养基。在整个时期内，从PGCLC和来源于性腺的体细胞的聚集体形成次级卵泡的培养在-Col上进行，总共需要11至21天。结果，从PGCLC和来源于性腺的体细胞的聚集体开始培养的约第9天至第11天，可观察到次级卵泡(图13下部)。如图13所示，在从培养开始的第3周形成的次级卵泡中，未观察到Blimp1表达(原始生殖细胞标记基因)，并观察到强的Stella表达(卵母细胞标记基因)。<II-4.次级卵泡的体外生长培养>将通过上述<II-3.次级卵泡的产生>中获得的次级卵泡如下所示进行体外培养，尝试制备卵丘细胞-卵母细胞复合物(COC)。通过培养获得的次级卵泡在-Col上用钨物理分离。将分离的次级卵泡在IVG培养基(补充有5％FCS、2％聚乙烯吡咯烷酮(Sigma)、150μM抗坏血酸、1×GlutaMax、1×青霉素/链霉素、100μM2-巯基乙醇、55μg/ml丙酮酸钠和0.1ng/mlFSH的α-MEM)在GDF9(15ng/ml)和BMP15(15ng/ml)存在下在-Col上培养2天(图14A)。在培养的第3天，将次级卵泡转移到含有1mg/mlIV型胶原酶的L15培养基中，并在37℃下处理25分钟以部分地切割颗粒细胞层和膜细胞层之间的结合。然后，在-Col上在不含GDF9和BMP15的上述IVG培养基中连续培养次级卵泡(图14B和图14C)。结果，在第11天可以用玻璃毛细管从发育的次级卵泡分离COC(图14D)。<II-5.通过体外培养对卵子进行体外成熟>在<II-4.次级卵泡的体外生长培养>中获得的COC转移至IVM培养基(补充有5％FCS、25μg/ml丙酮酸钠、1×青霉素/链霉素、0.1IU/mlFSH、4ng/mlEGF和1.2IU/mlhCG的α-MEM)并培养16小时。然后，用透明质酸酶将卵丘细胞从卵子中解离出来，释放出第一极体的卵母细胞作为MII卵子用于体外受精。<II-6.用体外成熟的卵子进行体外受精和胚胎移植>获得的MII卵子与精液在IVF培养基(补充有4mg/ml牛血清白蛋白的HTF)中共培养。约6小时后，将受精卵转移至新鲜的IVF培养基中并培养1天。培养后，发育至2-细胞期的胚胎在0.5dpc时被转移至假孕雌性的输卵管中。后代在移植后第19天通过剖腹产获得。获得的后代由养母抚养，并发育至成体。结果，后代发育成身体正常成体(图15)。此外，发育至成体的雄性和雌性小鼠在性成熟后可以产生下一代。这表明根据本发明的体外培养方法可以从来源于ES细胞或iPS细胞的PGCLC产生功能GV期卵母细胞和卵子。序列表<110>学校法人东京农业大学（TokyoUniversityofAgriculture）国立研究开发法人农业·食品产业技术综合研究机构（NationalAgricultureandFoodResearchOrganization）国立大学法人九州大学（KyushuUniversity）<120>将原始生殖细胞分化为功能上成熟的卵母细胞的培养方法<150>JP2015-184513<151>2015-09-17<160>12<170>PatentInversion3.5<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>化学合成的Igf2r1st正向引物<400>1tagaggattttagtataattttaa24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>化学合成的Igf2r反向引物<400>2cacttttaaacttacctctcttac24<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>化学合成的Igf2r2nd正向引物<400>3gaggttaagggtgaaaagttgtat24<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>化学合成的H19正向引物<400>4tttgggtagtttttttagtt20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>化学合成H191st反向引物<400>5tcctaatctctaatctcaac20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>化学合成H192nd反向引物<400>6aaccccaacctctactttta20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>化学合成的Lit1正向引物<400>7taaggtgagtggtttaggat20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>化学合成的Lit1反向引物<400>8ccactataaacccacacata20<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>化学合成的Snrpn正向引物<400>9aatttgtgtgatgtttgtaattatttgg28<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>化学合成的Snrpn反向引物<400>10ataaaatacactttcactactaaaatcc28<210>11<211>26<212>DNA<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>化学合成的Peg1/Mest正向引物<400>11ttttagattttgagggttttaggttg26<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>化学合成的Peg1/Mest反向引物<400>12aatcccttaaaaatcatctttcacac26当前第1页1 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