本申请主张2015年11月9日提交的第62/252,971号美国临时申请的权益，所述申请以全文引用的方式并入本文中。
本发明涉及牛磺酸在微生物中的重组生产和在饲料组合物中的用途，具体地说用于水产养殖、动物饲料和人体营养。
背景技术：
牛磺酸(2-氨基乙磺酸)是在从鸟类到哺乳动物、从鱼类到植物、真菌和细菌等广泛范围生物中发现的2-碳(β)-胺基酸(mccusker等人(2014)《营养科学杂志(jnutrsci)》3:e39)。虽然一些蛋白质含有牛磺酸，但所述牛磺酸由于缺少羧基而不会形成肽键。实际上，牛磺酸是动物组织中所存在的含量最丰富的游离氨基酸(faa)，构成大脑中faa的19％，构成肾脏中faa的50％，且构成肌肉中faa的53％。(brosnan等人(2006)《营养学杂志(jnutr.)》136(6):16365-16405)
牛磺酸在许多基础细胞过程中是至关重要的，所述细胞过程包括渗透调节、膜稳定作用和抗氧化作用。(honjoh等人(2010)《氨基酸(aminoacids.)》38(4):1173-1183；takeuchi等人(2000)《生物化学与生物物理学报(biochimbiophysacta.)》1464(2):219-230)此外，牛磺酸还参与多种更复杂的生理功能，例如胆汁结合和钙信号传导。(salze等人(2015)《水产养殖(aquaculture)》437:215-229)。牛磺酸和亚牛磺酸也已表现出有助于蛋白质折叠(warskulat等人(2007)《酶学方法(methodsenzymol)》428:439-58；abe等人(2015)《氨基酸》47(5):909-15；fujii等人(2007)《生物化学杂志(jbiochem)》141(5):697-707)。
虽然在多种鱼类中可检测到高含量的牛磺酸，但一些牛磺酸已被认为是从鳟鱼到黑鱼的许多食肉性鱼类的条件性必需营养素，且已表明其补充增加鱼类的生长速率。(gibson等人(2007)《水产养殖》269(1-4):514-524；wu等人(2015)《水产养殖营养(aquacnutr.)》21(2):214-222)此外，牛磺酸补充似乎可以补足原料中鱼粉的减少，这是实现更可持续形式的水产养殖的重要目标。
对于猫来说，膳食牛磺酸通常是饲料的必要添加物。牛磺酸含量不足可能导致视网膜、视觉皮层和大脑发育的严重退行性改变。据报导，牛磺酸还具有抗癫痫特性。(ripps和shen(2012)《分子视觉(molecularvision)》18:2673-2786)
毫无疑问，通过大量已知合成机制化学合成牛磺酸是主要的生产手段。(salze等人(2015)《水产养殖》437:215-229)也已经描述了牛磺酸在植物细胞中的生物合成。(us2012/0222148a1)与先验信念相反，一系列近期公开案指出，多种细菌、真菌和藻类含有能够合成牛磺酸的个别酶类，或在一些情况下含有能够合成牛磺酸的完整合成代谢路径。(tevatia等人(2015)《藻类研究(algalres.)》9:21-26；agnello等人(2013)《acs化学生物(acschembiol.)》8(10):2264-2271)
需要一种组合的蛋白质/牛磺酸原料来服务于动物营养领域。在水产养殖中在幼鱼阶段期间此需求尤其迫切。相比于成鱼饲料在水中可能会停留更久的幼鱼饲料可由于消散而导致牛磺酸的显著损失。化学合成的结晶形态的牛磺酸尤其易受此过程影响。使轮虫富含牛磺酸是一个有效的解决方案(matsunari等人(2013)《鱼类科学(fishsci.)》79(5):815-821)，但却是一个潜在不经济的解决方案，因为活体饲料通常很昂贵。一个替代策略是将牛磺酸囊封在微米粒子中，例如囊封在脂质壁的胶囊中(langdon等人(2003)《水产养殖》227(1-4):259-275)。植物类生产系统可以通过使用细胞膜作为天然脂质胶囊来实现此目标。然而，此方法并非是完美的，因为用植物细胞直接喂养遭受植物类饲料中所发现的抗营养因子的影响。(francis等人(2001)《水产养殖》199(3-4):197-227)因此，需要一种使牛磺酸不溶解于水中同时避免涉及植物类生物合成或活体饲料的方案的水产养殖饲料。在本文中，本发明正好描述了这种解决方案。
技术实现要素：
在一个方面中，提供表达一或多种多核苷酸的非天然存在的微生物，所述一或多种多核苷酸表达用于产生牛磺酸的外源性酶。举例来说，非天然存在的微生物表达以下酶活性：(a)半胱胺(2-氨基乙烷硫醇)双加氧酶(ado)；(b)半胱氨酸双加氧酶(cdo)，和半胱氨酸亚磺酸脱羧酶(csad)或谷氨酸脱羧酶(gad)；(c)3-巯基丙酸双加氧酶(p3mdo)，和csad或gad；(d)l-丝氨酸脱水酶；硫酸腺嘌呤转移酶和腺苷酰硫酸激酶(apsk)和/或3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸合成酶(papss1))；3'-磷酸腺苷酰硫酸:2-氨基丙烯酸c-磺基转移酶(paps-as)，和csad或gad；(e)半胱氨酸(cysteate)合成酶，任选地l-丝氨酸脱水酶，和csad或gad；(f)l-半胱氨酸脱巯基酶(cd)活性；任选地胱硫醚γ-裂解酶(cgl)活性；硫酸腺嘌呤转移酶和apsk和/或papss1)；paps-as和csad或gad；(g)cd)活性；任选地cgl活性；半胱氨酸合成酶和csad或gad；(h)半胱氨酸磺基裂解酶(cuya)和csad或gad；(i)磷酸磺基乳酸合成酶(coma)、2-磷酸-3-磺基乳酸磷酸水解酶(comb)、磺基乳酸脱氢酶(comc)、天冬氨酸转氨酶(aspat)和csad或gad；(j)磺基乙醛乙酰基转移酶(xsc)和牛磺酸-丙酮酸转氨酶(tpa)；(k)coma、comb、comc、磺基丙酮酸脱羧酶(comde)和tpa；或(l)aspat、comde和tpa，其中所述酶活性中的至少一个由在微生物中表达的外源性多核苷酸编码。
在一些实施例中，非天然存在的微生物由选自以下的属的宿主细胞获得：甲基小杆菌属(methylobacterium)、甲基单胞菌属(methylomonas)、甲基杆菌属(methylobacter)、甲基球菌属(methylococcus)、甲基弯曲菌属(methylosinus)、甲基环孢菌属(methylocyctis)、甲基微菌属(methylomicrobium)、甲基单胞菌属、嗜甲基菌属(methylophilus)、甲基菌属(methylobacillus)、甲基小杆菌属、生丝微菌属(hyphomicrobium)、黄色杆菌属(xanthobacter)、杆菌属(bacillus)、副球菌属(paracoccus)、诺卡菌属(nocardia)、节杆菌属(arthrobacter)、红假单胞菌属(rhodopseudomonas)、假单胞菌属(pseudomonas)、念珠菌属(candida)、汉森酵母属(hansenula)、毕赤酵母属(pichia)、球拟酵母属(torulopsis)、红酵母属(rhodotorula)、埃希氏杆菌属(escherichia)和酵母菌属(saccharomyces)。举例来说，所述微生物可选自甲基小杆菌属、埃希氏杆菌属、酵母菌属和杆菌属。在一些实施例中，非天然存在的微生物是甲基营养型细菌。举例来说，非天然存在的微生物可以是甲基小杆菌属物种，例如(但不限于)扭脱甲基小杆菌(methylobacteriumextorquens)。
在一些实施例中，所述一或多种外源性多核苷酸为针对在微生物中的表达优化的密码子。在一些实施例中，所述一或多种外源性多核苷酸可操作地连结到用于在微生物中进行表达的启动子。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括一或多种基因的缺失，所述一或多种基因编码使牛磺酸或者牛磺酸前体半胱氨酸或磺基乙醛减少的酶；或包括一或多种基因的修饰，所述一或多种基因编码使牛磺酸、半胱氨酸或磺基乙醛减少的酶，使得使牛磺酸、半胱氨酸或磺基乙醛减少的一或多种酶的活性低于在衍生出所述非天然微生物的微生物亲代中的活性。在一些实施例中，使牛磺酸、半胱氨酸或磺基乙醛减少的一或多种酶包括牛磺酸脱氢酶、牛磺酸双加氧酶、xsc、cuya、tpa和/或γ-谷氨酰转移酶。
在一些实施例中，非天然存在的微生物经遗传修饰或人工预选，以相对于对应的未经修饰或未经选择微生物产生升高水平的类胡萝卜素化合物。举例来说，与衍生出产生类胡萝卜素的微生物的宿主细胞相比，所述微生物可产生升高水平的选自以下的一或多种类胡萝卜素化合物：β-胡萝卜素、番茄红素、视紫质、玉米黄素、叶黄素、角黄素、虾青素和紫菌红醚(sprilloxanthin)。
在一些实施例中，非天然存在的微生物积聚细胞内的牛磺酸和/或亚牛磺酸，其中牛磺酸和/或亚牛磺酸有助于一或多种天然和/或异源蛋白质的折叠，例如其目的是与衍生出所述非天然存在的微生物的亲代微生物相比增加酶活性和/或蛋白质产量，所述亲代微生物例如不包括一或多种外源性多核苷酸的亲代微生物。
在另一方面，提供产生包括牛磺酸和/或牛磺酸前体的生物质的方法，所述牛磺酸前体例如半胱氨酸、磺基乙醛和/或亚牛磺酸。所述方法包括在适合于微生物生长和产生牛磺酸和/或牛磺酸前体的外源性酶进行表达的条件下，在培养基中培养如本文所描述的非天然存在的微生物，其中包括牛磺酸和/或牛磺酸前体的生物质在培养基中产生。
在另一方面，提供一种饲料或营养补充物，其包括如本文中所描述产生的含牛磺酸和/或牛磺酸前体的生物质。
附图说明
图1描绘从半胱胺产生牛磺酸的生物合成途径的实施例。
图2描绘从l-半胱氨酸产生牛磺酸的生物合成途径的实施例。
图3描绘从l-半胱氨酸产生牛磺酸的生物合成途径的实施例。
图4描绘从l-丝氨酸产生牛磺酸的生物合成途径的实施例。
图5描绘从l-磷酸丝氨酸或l-丝氨酸产生牛磺酸的生物合成途径的实施例。
图6描绘从l-半胱氨酸产生牛磺酸的生物合成途径的实施例。
图7描绘从l-半胱氨酸产生牛磺酸的生物合成途径的实施例。
图8描绘从丙酮酸产生牛磺酸的生物合成途径的实施例。
图9描绘从磷酸烯醇丙酮酸产生牛磺酸的生物合成途径的实施例。
图10描绘从乙酰磷酸产生牛磺酸的生物合成途径的实施例。
图11描绘从磷酸烯醇丙酮酸产生牛磺酸的生物合成途径的实施例。
图12描绘通过牛磺酸-丙酮酸转氨酶产生牛磺酸的生物合成途径的实施例。
图13描绘牛磺酸和半胱氨酸降解途径。
具体实施方式
本文中描述的本发明解决了一个双重难题，即从便宜的原料产生牛磺酸以及囊封所述牛磺酸以避免其溶解在用于水产养殖的水中。描述了用于产生牛磺酸的微生物系统以及将牛磺酸囊封在天然脂质双层(微生物细胞)中的饲料产物。
本文中提供非天然存在的微生物，例如细菌、酵母菌、古细菌(archaea)，其能够产生牛磺酸和/或例如亚牛磺酸或半胱氨酸的牛磺酸前体。还提供对这种微生物进行工程改造和培养的方法、使用这种微生物产生牛磺酸的方法，以及产生含牛磺酸的组合物的方法，所述组合物例如含有所述微生物的饲料组合物或含有从这种生物回收的牛磺酸的组合物。
一个方面是关于水产养殖领域。另一方面是宠物食品领域，例如猫粮和狗粮。另一方面是人体营养和补充品的领域。更具体地说，提供水产养殖饲料、宠物食物和营养补充物组合物，其包括含牛磺酸的微生物生物质和完整的蛋白质营养，即含有所述蛋白质营养所投向的动物健康生长所必需的大部分或所有氨基酸。在一些实施例中，本文中的水产养殖饲料组合物含有微生物所产生的一或多种类胡萝卜素，所述微生物产生牛磺酸和/或牛磺酸前体，例如亚牛磺酸或半胱氨酸。微生物生物质可与其它成分混合以形成饲料的部分或全部，或可作为富含蛋白质的粉末直接使用。
另一方面是关于工业蛋白质生产领域。例如甜菜碱、甘氨酸、n-氧化三甲胺(tmao)和牛磺酸的渗透剂可有助于蛋白质折叠(warskulat等人(2007)《酶学方法》428:439-58；abe等人(2015)《氨基酸》47(5):909-15；fujii等人(2007)《生物化学杂志》141(5):697-707)。经工程改造以积聚细胞内牛磺酸作为化学伴随蛋白的微生物可产生较高产量或更多相关活性蛋白质。作为抗氧化剂，牛磺酸、亚牛磺酸和它们的前体还通过经由氧化限制蛋白质失活而提升蛋白质活性(oliveira等人(2010)《药理报道(pharmacologicalreports)》62:185-193；aruoma等人(1988)《生物化学杂志(biochemj)》256:251-55；bucolo等人(2016)《眼科学学报(actaophthalmologic)》95(256)；patel等人(2016)《经验毒性病理学(exptoxicpathol)》68(2-3):103-12；fontana等人(2004)《神经化学研究(neurochemicalresearch)》29(1):111-116)。
定义
除非本文另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。singleton等人的《微生物学与分子生物学词典(dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology)》(第二版，约翰威利父子公司(johnwileyandsons)，纽约(1994))，和hale与markham)的《哈珀柯林斯生物学词典(theharpercollinsdictionaryofbiology)》(哈珀永久(harperperennial)，纽约(ny)(1991))向技术人员提供了本发明中所用的许多术语的通用词典。类似于或等效于本文中所描述的任何方法和材料可用于实践或测试本发明。
除非另外指明，否则本发明的实践将采用所属领域技术范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术。以下文献中充分解释了这些技术，例如：《分子克隆实验指南(molecularcloning:alaboratorymanual)》，第二版(sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(oligonucleotidesynthesis)》(m.j.gait编，1984)；《现代分子生物学实验技术(currentprotocolsinmolecularbiology)》(f.m.ausubel等人编，1994)；《pcr：聚合酶链反应(pcr:thepolymerasechainreaction)》(mullis等人编，1994)；以及《基因转移和表达实验指南(genetransferandexpression:alaboratorymanual)》(kriegler，1990)。
本文中所提供的数值范围包括界定所述范围的数目。
除非另外指明，否则分别地，核酸以5'到3'定向从左到右书写；氨基酸序列以氨基到羧基定向从左到右书写。
除非上下文另外明确规定，否则“一(a/an)”和“所述”包括多个指示物。
如本文中所使用，术语“多核苷酸”是指具有任何长度和任何三维结构和单链或多链(例如单链、双链、三重螺旋等)的聚合物形式的核苷酸，其含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的类似物或经修饰形式，包括经修饰核苷酸或碱基或它们的类似物。由于遗传密码被简并，因此多于一个密码子可用于编码一种特定氨基酸，且本发明涵盖编码特定氨基酸序列的多核苷酸。可以使用任何类型的经修饰核苷酸或核苷酸类似物，只要多核苷酸在使用条件下保持所要功能性即可，包括增加核酸酶抗性的修饰(例如脱氧、2'-o-me、硫代磷酸酯等)。还可以出于检测或捕获的目的并入标记，例如放射性或非放射性标记或锚定物，例如生物素。术语多核苷酸还包括肽核酸(pna)。多核苷酸可以是天然存在的或非天然存在的。术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用。多核苷酸可以含有rna、dna或两者和/或其经修饰形式和/或类似物。核苷酸序列可以间杂有非核苷酸组分。一或多个磷酸二酯键可被替代性连接基团替换。这些替代性连接基团包括(但不限于)其中磷酸酯被替换为p(o)s(“硫代酸酯”)、p(s)s(“二硫代酸酯”)、(o)nr.sub.2(“酰胺化物”)、p(o)r、p(o)or'、co或ch.sub.2(“甲缩醛”)的实施例，其中各r或r'独立地为h或任选地含有醚(--o--)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳醛基的经取代或未经取代烷基(1至20个c)。多核苷酸中所有的键不需要都一致。多核苷酸可以是线性或环状的或包括线性和环状部分的组合。
如本文中所使用，“多肽”是指由氨基酸构成的组合物，并且被所属领域的技术人员认为是蛋白质。在本文中使用氨基酸残基的常规一字母或三字母密码。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可为线形或分支，其可包括经修饰的氨基酸，并且其可间杂有非氨基酸。所述术语还涵盖天然修饰或通过例如双硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵或修饰(例如与标记组分结合)等介入来修饰的氨基酸聚合物。定义内还包括例如含有氨基酸的一或多种类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域中已知的其它修饰的多肽。
如本文中所用，“载体”是指被设计成将核酸引入到一或多种细胞类型中的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒子以及其类似者。
如本文中所使用，术语“表达”是指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。所述过程包括转录与翻译两者。
如本文中所使用，“表达载体”是指含有dna编码序列(例如基因序列)的dna构建体，所述编码序列可操作地连接到能够在宿主中表达所述编码序列的一或多个合适控制序列。所述控制序列包括影响转录的启动子、控制所述转录的任选的操纵序列、编码合适mrna核糖体结合位点的序列和控制转录与翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体粒子或仅是潜在基因组插入物。在被转移到合适宿主中之后，载体可独立于宿主基因组进行复制和起作用，或在一些例子中其自身可整合到基因组中。质粒是表达载体的最常用的形式。然而，本发明旨在包括表达载体的提供等效功能并且在本领域中是已知或变得已知的所述其它形式。
“启动子”是指使rna聚合酶结合以起始基因转录所涉及的调节序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。“诱导型启动子”是在环境或发育调节条件下具有活性的启动子。
术语“以可操作方式连接”是指指定要素的允许所述指定要素共同运作以产生效应的的并列或排列。举例来说，如果启动子控制编码序列的转录，那么所述启动子可操作地连接于所述编码序列。
“在转录控制下”是本领域中充分理解的术语，其是指多核苷酸序列的转录取决于其可操作地连接于有助于起始转录或促进转录的要素。
“在翻译控制下”是本领域中充分理解的术语，其是指在mrna已经形成之后发生的调节过程。
“基因”是指dna区段，其涉及产生多肽且包括编码区之前和之后的区域以及个别编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
如本文中所使用，术语“宿主细胞”是指其中可转染有产生多肽的重组表达载体以表达所述多肽的细胞或细胞系。宿主细胞包括单一宿主细胞的子代，并且子代可能由于自然、偶然或故意的突变而未必与初始亲代细胞完全相同(在形态或总基因组dna互补序列方面)。宿主细胞包括在体内经表达载体转染或转化的细胞。
术语“重组”是指已经被修饰以改变其序列或表达特性的遗传物质(即，核酸、所述核酸编码的多肽和包括所述多核苷酸的载体和细胞)，例如通过使编码序列突变以产生经改变的多肽、使编码序列与另一基因的编码序列融合、使基因处于不同启动子的控制下、在异源生物体中表达基因、以降低或升高水平表达基因、以不同于其天然表达谱的方式条件性地或构成性地表达基因，等等。通常，重组的核酸、多肽和基于其的细胞已由人类操纵，使得其与在自然中发现的相关核酸、多肽和细胞不相同。
“信号序列”是指结合到蛋白质的n端部分的氨基酸序列，其有助于成熟形式的所述蛋白质从细胞分泌。成熟形式的细胞外蛋白质缺少信号序列，所述信号序列在分泌过程期间断开。
术语“选择性标记物”或“可选择标记物”是指能够在宿主细胞中表达的使得容易选择含有所引入核酸或载体的那些宿主的基因。可选择标记物的实例包括(但不限于)赋予宿主细胞以代谢优势(例如营养优势)的抗微生物物质(例如潮霉素、博莱霉素(bleomycin)或氯霉素)和/或基因。
术语“衍生自”涵盖术语“源自”、“获自”、“可获自”、“分离自”和“产生自”，并且一般来说指示一种指定物质在另一种指定物质中找到其来源或具有可以参考另一种指定物质描述的特征。
术语“培养”是指使细胞(例如微生物细胞)群体在合适的生长条件下、在液态或固态培养基中生长。
提及多核苷酸或蛋白质的术语“异源性”或“外源性”是指并非天然存在于指定细胞(例如宿主细胞)中的多核苷酸或蛋白质。预期所述术语涵盖由天然存在的基因、突变基因和/或合成基因编码的蛋白质。相反，提及多核苷酸或蛋白质的术语“同源性”是指天然存在于细胞中的多核苷酸或蛋白质。
在将核酸序列插入细胞中的上下文中，术语“引入”包括“转染”、“转化”或“转导”并且是指将核酸序列并入至真核或原核细胞中，在所述真核或原核细胞，核酸序列可并入至所述细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体dna)中，转化成能独立复制的复制子或暂时表达。
“转染”或“转化”是指外源性多核苷酸插入至宿主细胞中。外源性多核苷酸可以维持为未整合的载体，例如质粒，或者可以整合到宿主细胞基因组中。术语转染(transfecting或transfection)既定涵盖用于将核酸引入到宿主细胞中的所有常规技术。转染技术的实例包括(但不限于)磷酸钙沉淀、deae-葡聚糖介导的转染、脂质体转染、电穿孔和微注射。
如本文中所使用，术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”是指非天然(例如异源性)核酸序列整合到其基因组中或作为经过多个代维持的游离质粒的细胞。
如本文所使用的术语“提取的”、“离析的”、“纯化的”和“分离的”是指从其天然相关联的至少一种组分中去除的物质(例如，蛋白质、核酸或细胞)。举例来说，这些术语可以指如其自然状态下所见(例如完整生物系统)通常附有物质的组分大体上或基本上不含所述物质。
“信号序列”(又称为“前序列”、“信号肽”、“前导序列”或“前导肽”)是指新生多肽的氨基端处的氨基酸序列，所述氨基酸序列将所述多肽靶向分泌路径，并且其在内质网膜中被易位后从所述新生多肽断裂。
相关(和衍生)蛋白质涵盖“变体”蛋白质。变体蛋白质与亲代蛋白质和/或彼此有少量氨基酸残基不同。在一些实施例中，不同氨基酸残基的数目为约1、2、3、4、5、10、20、25、30、35、40、45或50中的任一个。在一些实施例中，变体有约1到约10个氨基酸不同。或者或另外，变体可以与参考蛋白质或核酸具有指定的序列一致性程度，例如如使用序列比对工具(例如blast、align和clustal)测定(参看下文)。举例来说，变体蛋白质或核酸与参考序列的氨基酸序列一致性可为至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至99.5％。
如本文中所使用，术语“类似序列”是指相对于参考蛋白质提供类似功能、三级结构和/或保守残基的蛋白质内的多肽序列。举例来说，在含有α螺旋或β片层结构的抗原决定基区域中，类似序列中的替代氨基酸维持相同结构元件。在一些实施例中，提供使得变体酶相对于所述变体衍生自的亲代蛋白质展现类似或改进功能的类似序列。
如本文中所使用，“同源性蛋白质”是指与参考蛋白质具有类似功能和/或结构的蛋白质。同源物可以来自进化相关或不相关的物种。在一些实施例中，同源物具有与参考蛋白质类似的四级、三级和/或一级结构，由此潜在地允许用来自同源物的类似区段或片段来替代参考蛋白质中的区段或片段，其相比于用来自非同源性蛋白质的序列替代所述区段或片段来说对参考蛋白质的结构和/或功能的破坏减少。
如本文中所使用，“野生型”、“天然”和“天然存在的”蛋白质为在自然界中可见的那些蛋白质。术语“野生型序列”是指自然界中可见或天然存在的氨基酸或核酸序列。在一些实施例中，野生型序列是蛋白质工程改造项目(例如制造变体蛋白质)的起点。
在至少两个核酸或多肽的上下文中，短语“大体上类似”和“大体上相同”通常意味着相比于参考(例如野生型)多核苷酸、多肽或多肽的区域或结构域，包括具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至99.5％序列一致性的序列的多核苷酸、多肽或多肽的区域或结构域。多肽的区域或结构域可含有例如较长多肽序列内的至少约20、50、100或200个氨基酸。序列一致性可以使用例如blast、align和clustal的已知程序，使用标准参数测定。(参看例如altshul等人(1990)《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》215:403-410；henikoff等人(1989)《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.)》89:10915；karin等人(1993)《美国国家科学院院刊》90:5873；和higgins等人(1988)《基因(gene)》73:237)。用于进行blast分析的软件通过美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)公开可用。此外，数据库可以使用fasta搜索(person等人(1988)《美国国家科学院院刊》85:2444-2448)。在一些实施例中，大体上相同多肽不同之处仅在于一或多个保守氨基酸取代。在一些实施例中，大体上相同多肽是免疫交叉反应性的。在一些实施例中，大体上相同核酸分子在严格条件下(例如在中等到高严格度范围内)彼此杂交。
术语“类胡萝卜素”在本领域中理解为是指衍生自类异戊二烯途径中间产物的结构上不同类别的色素。类胡萝卜素生物合成中的定型步骤是由香叶基香叶基焦磷酸形成八氢番茄红素。类胡萝卜素可以是非环状的或环状的，并且可或可不含有氧，使得术语类胡萝卜素包括胡萝卜素和叶黄素两者。一般来说，类胡萝卜素为具有在形式上衍生自五碳化合物ipp的共轭多烯碳骨架的烃类化合物，包括三萜(c30二脱辅基类胡萝卜素(diapocarotenoid))和四萜(c40类胡萝卜素)以及它们的氧化衍生物，和具有c35、c50、c60、c70、c80长度或其它长度的其它化合物。多种类胡萝卜素具有较强的光吸收特性，并且其长度范围可超过c2oo，c3o二脱辅基类胡萝卜素通常由六个类异戊二烯单元构成，所述类异戊二烯单元的连接方式为使得类异戊二烯单元结构在分子中心处翻转，使得两个中央甲基处于1、6位置关系，且其余非末端甲基处于1、5位置关系。这种c3o类胡萝卜素可通过以下过程在形式上衍生自具有较长中央共轭双键链的非环状c3oh42结构：(i)氢化、(ii)脱氢、(iii)环化、(iv)氧化、(v)酯化/糖基化，或这些过程的任何组合。c40类胡萝卜素通常由八个类异戊二烯单元组成，所述类异戊二烯单元的连接方式为使得类异戊二烯单元的结构在分子中心处翻转，使得两个中央甲基处于1、6位置关系，且其余非末端甲基处于1、5位置关系。这种c40类胡萝卜素可通过以下过程在形式上衍生自具有较长中央共轭双键链的非环状c40h56结构：(i)氢化、(ii)脱氢、(iii)环化、(iv)氧化、(v)酯化/糖基化，或这些过程的任何组合。c40类胡萝卜素的类别还包括由碳骨架重新排列或通过去除此结构的一部分(缩甲醛)而产生的某些化合物。在自然界中已经识别出超过600种不同的类胡萝卜素。类胡萝卜素包括(但不限于)：环氧玉米黄质、金盏花红素、金盏花黄质、虾青素、角黄素、辣椒玉红素(capsorubrin)、β-隐黄质、a-胡萝卜素、β-胡萝卜素、β,ψ-胡萝卜素、δ-胡萝卜素、ε-胡萝卜素、海胆酮(echinenone)、3-羟基海胆酮、3'-羟基海胆酮、γ-胡萝卜素、ψ-胡萝卜素、4-酮基-y-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素、a-隐黄质、脱氧屈曲黄素(deoxyflexixanthin)、藻硅黄素(diatoxanthin)、7,8-二脱氢虾青素、二脱氢番茄红素、岩藻黄质、岩藻黄质醇(fucoxanthinol)、异海绵烯(isorenieratene)、β-异海绵烯、莴苣黄素(lactucaxanthin)、叶黄素、番茄红素、粘菌酮(myxobactone)、新黄质(neoxanthin)、链孢红素、羟基链孢红素、多甲藻素、八氢番茄红素、视紫红质(rhodopin)、视紫红质葡糖苷、4-酮基-玉红黄质、管藻黄质、球形烯(spheroidene)、球形烯酮(spheroidenone)、螺菌黄素、红酵母烯(torulene)、4-酮基-红酵母烯、3-羟基-4-酮基-红酵母烯、脲内酯(uriolide)、乙酸脲内酯、玉米黄素-β-二糖苷、玉米黄素和c30类胡萝卜素。另外，类胡萝卜素化合物包括这些分子的衍生物，可包括羟基-、甲氧基-、氧代-、环氧基-、羧基-或醛官能团。此外，所包括的类胡萝卜素化合物包括酯(例如糖苷酯、脂肪酸酯)和硫酸盐衍生物(例如酯化叶黄素)。
“类异戊二烯途径”在本领域中理解为是指产生或利用五碳代谢物焦磷酸异戊酯(ipp)的代谢途径。如本文所论述，两个不同的途径可产生共同的类异戊二烯前体ipp，所述两个途径为“甲羟戊酸途径”和“非甲羟戊酸途径”。术语“类异戊二烯途径”足够广义涵盖这两个类型的途径。由ipp生物合成类异戊二烯通过若干五碳异戊二烯亚基的聚合发生。衍生自ipp的类异戊二烯代谢物的化学结构变化极大，包括环状和非环状分子两种。类异戊二烯代谢物包括(但不限于)单萜、倍半萜、二萜、固醇和多萜醇，例如类胡萝卜素。
术语“类异戊二烯化合物”是指经由以焦磷酸异戊烯酯(ipp)开始的途径所衍生，且通过长度可为5、10、15、20、30或40个碳的异戊二烯单元的头尾缩合所形成的任何化合物。此处术语“类异戊二烯色素”是指通常具有较强光吸收特性的一种类异戊二烯化合物。
术语“饲料预混合”是指在进行处理之前，任选地在高温下将水产养殖饲料或动物/宠物食物组分粗混合到呈团粒或薄片形式的水产养殖饲料或动物或宠物食物组合物中。
水产养殖饲料组合物用于生产“水产养殖产品”，其中所述产品为通常售出供人类食用的可收获、可养殖物种(例如长须鲸、甲壳动物)。举例来说，鲑鱼在水产养殖中密集地生产且因此为水产养殖产品。水产养殖组合物还可用作水产养殖饲料生物体的饲料，例如小鱼，如磷虾、轮虫等等，其为例如食肉鱼类的较大水产养殖生物体的食物源。另外，本文中所描述的水产养殖组合物可用作并非意图作为其它生物体的食物的观赏鱼类、虾、业余水产养殖等的饲料。
术语“水产养殖肉类产品”是指意图用于人类食用的食物产品，其包括来自如上定义的水产养殖产品的至少一部分肉。水产养殖肉类产品可以是例如整个鱼或从鱼切割下来的鱼片，其中的每一个都可作为食物食用。在一些实施例中，这种产品可被称作鱼类或海鲜产品。
术语“生物质”是指微生物细胞物质。生物质可以是天然产生的，或可以由天然宿主或重组生产宿主的发酵产生。生物质可呈完整细胞、完整细胞裂解物、均质化细胞、部分水解细胞物质和/或部分纯化细胞物质(例如微生物产生的油)的形式。
术语“经处理生物质”是指已经受例如干燥、巴氏灭菌(pasteurization)、破裂等其它处理的生物质，所述处理中的每一个在下文更详细地论述。
术语“c-1碳基质”是指缺少碳碳键的任何含碳分子。实例为甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、甲酸酯、甲基化胺(例如，单甲基胺、二甲基胺和三甲基胺)、甲基化硫醇和二氧化碳。
术语“c1代谢剂”是指具有使用单一碳基质作为能量和生物质的唯一来源的能力的微生物。c1代谢剂通常将为能够生长的甲基营养生物和/或甲烷氧化菌。
术语“甲基营养生物”是指能够氧化不含碳碳键的有机化合物的生物体。在甲基营养生物能够氧化ch4的情况下，所述甲基营养生物也为甲烷氧化菌。
术语“甲烷氧化菌”是指能够利用甲烷作为基质的原核生物。甲烷到二氧化碳的完全氧化通过需氧的降解途径发生。适用于本发明的甲烷氧化菌的典型实例包括(但不限于)甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属和甲基弯曲菌属。
术语“高生长甲烷氧化类细菌菌株”是指能够使用甲烷作为其唯一的碳和能量来源而生长的细菌。
微生物
提供非天然存在的微生物，其用于产生牛磺酸或牛磺酸前体亚牛磺酸、半胱氨酸或磺基乙醛。本文中非天然存在的(例如重组)微生物包括例如细菌、酵母菌、古细菌，其已被工程改造以表达用于生物合成牛磺酸或牛磺酸前体的至少一种(即，一或多种)酶，并且当在适合于微生物生长和牛磺酸产生的条件下被培养时产生牛磺酸或牛磺酸前体。
如本文所描述的非天然存在的微生物包括一或多种外源性多核苷酸，其编码并表达用于生物合成牛磺酸或牛磺酸前体半胱氨酸、磺基乙醛或亚牛磺酸的一或多种酶或酶活性。所述外源性多核苷酸可以包括用于生物合成牛磺酸或牛磺酸前体的一或多种酶或酶活性的一或多个编码序列，所述一或多个编码序列可操作地连接于用于在非天然存在的微生物中进行表达的一或多个启动子。所述启动子可包括(但不限于)p_r(例如seqidno:42)、p_lac(例如seqidno:41)、p_tac(例如seqidno:39)、p_taca(例如seqidno:40)、pmxaf(例如seqidno:43)、p_rrnb和p_t7。在一些实施例中，多核苷酸为针对在微生物中的表达加以优化的密码子。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码用于牛磺酸生物合成的一或多种酶或酶活性的一或多种外源性和/或内源性多核苷酸，如本文所描述，所述多核苷酸已被修饰以用于改进稳定性和/或活性，所述改进是相对于所述多核苷酸衍生自的宿主细胞中的酶或酶活性的稳定性和/或活性，或是相对于酶或酶活性的野生型稳定性和/或活性。举例来说，非天然存在的微生物可表达牛磺酸生物合成酶的变体，所述变体相比于其衍生自的野生型酶来说具有更高的稳定性和/或活性。
在一些实施例中，如本文所描述的非天然存在的微生物所衍生自的宿主细胞具有一或多种内源性牛磺酸、半胱氨酸或磺基乙醛降解活性，例如(但不限于)牛磺酸脱氢酶、tpa、cuya、γ-谷氨酰转移酶、xsc和/或牛磺酸双加氧酶。在一些实施例中，非天然存在的微生物包括一或多种基因的缺失，所述一或多种基因编码牛磺酸、半胱氨酸或磺基乙醛降解酶。在一些实施例中，非天然存在的微生物所来自的宿主细胞包括编码牛磺酸、半胱氨酸或磺基乙醛降解酶的一或多种基因的修饰，使得所述酶的牛磺酸、半胱氨酸或磺基乙醛降解活性在非天然存在的微生物中比在所述微生物衍生自的宿主细胞中更低。在一些实施例中，宿主细胞为扭脱甲基小杆菌，且衍生自所述宿主细胞的非天然存在的微生物包括在宿主细胞中编码γ-谷氨酰转移酶的基因的缺失或修饰。
在某些实施例中，宿主细胞包括所描述途径中的内源性基因中的一或多个。在某些实施例中，宿主细胞经修饰，使得产生将化合物和牛磺酸前体转移远离牛磺酸生物合成途径的酶的一或多种基因阻断或缺失。在某些实施例中，一或多种阻断或缺失的基因选自参与牛磺酸、半胱氨酸或磺基乙醛降解的基因。在某些实施例中，宿主细胞为自发突变体，其生长速率相对于对应的非突变体加快。在某些实施例中，宿主细胞在选自光缺乏、养分缺乏、氮缺乏、高盐或抑制宿主细胞生长的化学物质的逆境条件下培养，其中所述逆境条件诱发基因表达的改变，从而使牛磺酸或牛磺酸前体产生增加。
在一些实施例中，非天然存在的微生物或所述非天然存在的微生物所衍生自的宿主细胞经遗传修饰或人工预选，以相对于对应的未经修饰或未经选择微生物产生升高水平的一或多种类胡萝卜素化合物。一或多种类胡萝卜素化合物可包括(但不限于)β-胡萝卜素、番茄红素、玉米黄素、叶黄素、角黄素、视紫红质、虾青素和/或紫菌红醚。wo2015/021352a2中提供了产生升高水平的一或多种类胡萝卜素化合物的宿主细胞的非限制性实例和产生这种微生物的方法。
可衍生出所述非天然存在的微生物的属的非限制性实例包括甲基小杆菌属、甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基弯曲菌属、甲基环孢菌属、甲基微菌属、甲基单胞菌属、嗜甲基菌属、甲基菌属、甲基小杆菌属、生丝微菌属、黄色杆菌属、杆菌属、副球菌属、诺卡菌属、节杆菌属、红假单胞菌属、假单胞菌属、念珠菌属、汉森酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、红酵母属、埃希氏杆菌属和酵母菌属。可衍生出所述非天然存在的微生物的微生物物种的非限制性实例包括扭脱甲基小杆菌(例如，am1、dm4、cm4、pa1或bj001菌株(之前被称为甲基小杆菌属(methylobacteriumpopuli)))、耐辐射甲基小杆菌(methylobacteriumradiotolerans)、球化甲基小杆菌(methylobacteriumnodulans)、甲基小杆菌物种4-46和大肠杆菌(escherichiacoli)。
在一些实施例中，非天然存在的微生物是甲基营养型细菌。
半胱胺到牛磺酸的转化
在一些实施例中，提供表达2-氨基乙醇(半胱胺)双加氧酶(ado)(ec1.13.11.19)的外源性酶活性的非天然存在的微生物，所述酶将半胱胺转化成亚牛磺酸，以用于生物合成牛磺酸，如图1中所示。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码ado的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述ado包括或其组成为seqidno:44中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:44具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码ado的多核苷酸包括或其组成为seqidno:45或seqidno:57中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:45或seqidno:57具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:57。
在一些实施例中，非天然存在的微生物为包括编码ado的外源性多核苷酸的甲基小杆菌属、埃希氏杆菌属、酵母菌属或杆菌属微生物。
经由cdo将半胱氨酸转化为牛磺酸
在一些实施例中，提供表达一或多种外源性酶活性的非天然存在的微生物，其经由酶半胱氨酸双加氧酶(cdo)将半胱氨酸转化为牛磺酸，所述一或多种外源性酶活性例如用于生物合成牛磺酸的cdo/csad或gad途径的外源性酶。图2中示意性地示出用于牛磺酸生物合成的cdo/csad或gad途径。
在一些实施例中，表达cdo/csad或gad途径的外源性酶活性的非天然存在的微生物不属于埃希氏杆菌属或大肠杆菌物种。在一些实施例中，所述非天然存在的微生物不属于酵母菌属或酿酒酵母菌(saccharomycescerevisiae)物种。
提供包括以下酶或酶活性的非天然存在的微生物：半胱氨酸双加氧酶(cdo)(ec1.13.11.20)；以及半胱氨酸亚磺酸脱羧酶(csad)(ec4.1.1.29)，其中这些酶或酶活性中的至少一个由微生物已经转化有的外源性多核苷酸编码。在一些实施例中，cdo和csad酶或酶活性由微生物中的一或多种外源性多核苷酸(例如一种或两种外源性多核苷酸)编码。在一些实施例中，cdo和csad酶或酶活性中的一个由微生物中的外源性多核苷酸编码，且另一活性在所述非天然存在的微生物所衍生自的宿主细胞中内源性地表达，即不由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性csad活性，且cdo由微生物中的外源性多核苷酸编码。在一个实施例中，微生物表达内源性cdo活性，且csad由微生物中的外源性多核苷酸编码。
提供包括以下酶或酶活性的非天然存在的微生物：半胱氨酸双加氧酶(cdo)(ec1.13.11.20)；以及谷氨酸脱羧酶(gad)(ec4.1.1.15)，其中这些酶或酶活性中的至少一个由微生物已经转化有的外源性多核苷酸编码。在一些实施例中，cdo和gad酶或酶活性由微生物中的一或多种外源性多核苷酸(例如一种或两种外源性多核苷酸)编码。在一些实施例中，cdo和gad酶或酶活性中的一个由微生物中的外源性多核苷酸编码，且另一活性在所述非天然存在的微生物所衍生自的宿主细胞中内源性地表达，即不由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性gad活性，且cdo由微生物中的外源性多核苷酸编码。在一个实施例中，微生物表达内源性cdo活性，且gad由微生物中的外源性多核苷酸编码。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码cdo的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述cdo包括或其组成为seqidno:15中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:15具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码cdo的多核苷酸包括或其组成为seqidno:16、seqidno:50或seqidno:58中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:16、seqidno:50或seqidno:58具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:58。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码cdo的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述cdo包括或其组成为seqidno:35中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:35具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码cdo的多核苷酸包括或其组成为seqidno:36、seqidno:51或seqidno:59中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:36、seqidno:51或seqidno:59具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seq.no:51或seqidno:59。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码csad的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述csad包括或其组成为seqidno:11中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:11具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码csad的多核苷酸包括或其组成为seqidno:12、seqidno:53或seqidno:54中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:12、seqidno:53或seqidno:54具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:53或seqidno:54。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码gad的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述gad包括或其组成为seqidno:13中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:13具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码gad的多核苷酸包括或其组成为seqidno:14中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:14具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子。
在一个实施例中，提供了包括编码cdo和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物。在另一实施例中，提供了包括编码cdo和gad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码cdo的外源性多核苷酸的非天然存在的埃希氏杆菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码cdo和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的埃希氏杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码cdo的外源性多核苷酸的非天然存在的酵母菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码cdo和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的酵母菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码csad的外源性多核苷酸的非天然存在的杆菌属微生物。
经由p3mdo将半胱氨酸转化为牛磺酸
在一些实施例中，提供表达一或多种外源性酶活性的非天然存在的微生物，其经由酶3-巯基丙酸双加氧酶(p3mdo)将半胱氨酸转化为牛磺酸，所述一或多种外源性酶活性例如用于生物合成牛磺酸的p3mdo/csad或gad途径的外源性酶。图3中示意性地示出用于牛磺酸生物合成的p3mdo/csad或gad途径。
提供包括以下酶或酶活性的非天然存在的微生物：3-巯基丙酸双加氧酶(mdo；p3mdo)(ec1.13.11.-)；以及半胱氨酸亚磺酸脱羧酶(csad)(ec4.1.1.29)，其中这些酶或酶活性中的至少一个由微生物已经转化有的外源性多核苷酸编码。在一些实施例中，p3mdo和csad酶或酶活性由微生物中的一或多种外源性多核苷酸(例如一种或两种外源性多核苷酸)编码。在一些实施例中，p3mdo和csad酶或酶活性中的一个由微生物中的外源性多核苷酸编码，且另一活性在所述非天然存在的微生物所衍生自的宿主细胞中内源性地表达，即不由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性csad活性，且p3mdo由微生物中的外源性多核苷酸编码。在一个实施例中，微生物表达内源性p3mdo活性，且csad由微生物中的外源性多核苷酸编码。
提供包括以下酶或酶活性的非天然存在的微生物：3-巯基丙酸双加氧酶(mdo；p3mdo)(ec1.13.11.-)；以及谷氨酸脱羧酶(gad)(ec4.1.1.15)，其中这些酶或酶活性中的至少一个由微生物已经转化有的外源性多核苷酸编码。在一些实施例中，p3mdo和gad酶或酶活性由微生物中的一或多种外源性多核苷酸(例如一种或两种外源性多核苷酸)编码。在一些实施例中，p3mdo和gad酶或酶活性中的一个由微生物中的外源性多核苷酸编码，且另一活性在所述非天然存在的微生物所衍生自的宿主细胞中内源性地表达，即不由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性gad活性，且p3mdo由微生物中的外源性多核苷酸编码。在一个实施例中，微生物表达内源性p3mdo活性，且gad由微生物中的外源性多核苷酸编码。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码p3mdo的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述p3mdo包括或其组成为seqidno:33中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:33具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码p3mdo的多核苷酸包括或其组成为seqidno:34或seqidno:60中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:34或seqidno:60具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:60。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码csad的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述csad包括或其组成为seqidno:11中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:11具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码csad的多核苷酸包括或其组成为seqidno:12、seqidno:53或seqidno:54中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:12、seqidno:53或seqidno:54具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:53或seqidno:54。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码gad的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述gad包括或其组成为seqidno:13中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:13具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码gad的多核苷酸包括或其组成为seqidno:14中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:14具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子。
在一个实施例中，提供了包括编码p3mdo和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物。在另一实施例中，提供了包括编码p3mdo和gad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码p3mdo的外源性多核苷酸的非天然存在的埃希氏杆菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码p3mdo和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的埃希氏杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码p3mdo的外源性多核苷酸的非天然存在的酵母菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码p3mdo和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的酵母菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码p3mdo的外源性多核苷酸的非天然存在的杆菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码p3mdo和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的杆菌属微生物。
丝氨酸到牛磺酸的转化
在一些实施例中，提供表达用于生物合成牛磺酸的丝氨酸/硫酸途径的一或多种外源性酶活性的非天然存在的微生物。图4中示意性地示出用于牛磺酸生物合成丝氨酸/硫酸途径。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括引起丝氨酸在微生物中积聚的一或多个突变。举例来说，使用核酮糖单磷酸(rump)以用于从甲醇进行碳同化的甲基营养型菌株可以包括hpra(羟基丙酮酸还原酶)的缺失或突变，所述缺失或突变阻断丝氨酸循环的完成，从而引起丝氨酸积聚。
提供包括以下酶或酶活性的非天然存在的微生物：l-丝氨酸脱水酶(ec4.3.1.17)；硫酸腺嘌呤转移酶(ec2.7.7.4)和腺苷酰硫酸激酶(aps激酶)(ec2.7.1.25)，和/或3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸合成酶(papss1)(ec2.7.7.4/ec2.7.1.25)；3'-磷酸腺苷酰硫酸:2-氨基丙烯酸c-磺基转移酶(paps-as)(ec2.8.2.-)；以及半胱氨酸亚磺酸脱羧酶(csad)(ec4.1.1.29)，其中这些酶或酶活性中的至少一个由微生物已转化有的外源性多核苷酸编码。在一些实施例中，l-丝氨酸脱水酶；硫酸腺嘌呤转移酶和aps激酶和/或papss1；paps-as；以及csad酶或酶活性由微生物中的一或多种外源性多核苷酸(例如一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种外源性多核苷酸)编码。在一些实施例中，l-丝氨酸脱水酶、硫酸腺嘌呤转移酶、aps激酶、papss1、paps-as和csad酶或酶活性中的一个、两个、三个、四个、五个或六个由微生物中的一或多种外源性多核苷酸编码，且其余活性在所述非天然存在的微生物所衍生自的宿主细胞中内源性地表达，即不由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性l-丝氨酸脱水酶活性，且硫酸腺嘌呤转移酶和aps激酶和/或papss1、paps-as和csad由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性l-丝氨酸脱水酶、硫酸腺嘌呤转移酶，且aps激酶活性和paps-as和csad由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性l-丝氨酸脱水酶、硫酸腺嘌呤转移酶、aps激酶和csad活性，且paps-as由外源性多核苷酸表达。
提供包括以下酶或酶活性的非天然存在的微生物：l-丝氨酸脱水酶(ec4.3.1.17)；硫酸腺嘌呤转移酶(ec2.7.7.4)和腺苷酰硫酸激酶(aps激酶)(ec2.7.1.25)，和/或3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸合成酶(papss1)(ec2.7.7.4/ec2.7.1.25)；3'-磷酸腺苷酰硫酸:2-氨基丙烯酸c-磺基转移酶(paps-as)(ec2.8.2.-)；以及谷氨酸脱羧酶(gad)(ec4.1.1.15)，其中这些酶或酶活性中的至少一个由微生物已转化有的外源性多核苷酸编码。在一些实施例中，l-丝氨酸脱水酶；硫酸腺嘌呤转移酶和aps激酶和/或papss1；paps-as；以及gad酶或酶活性由微生物中的一或多种外源性多核苷酸(例如一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种外源性多核苷酸)编码。在一些实施例中，l-丝氨酸脱水酶、硫酸腺嘌呤转移酶、aps激酶、papss1、paps-as和gad酶或酶活性中的一个、两个、三个、四个、五个或六个由微生物中的一或多种外源性多核苷酸编码，且其余活性在所述非天然存在的微生物所衍生自的宿主细胞中内源性地表达，即不由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性l-丝氨酸脱水酶活性，且硫酸腺嘌呤转移酶和aps激酶和/或papss1、paps-as和gad由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性l-丝氨酸脱水酶、硫酸腺嘌呤转移酶、aps激酶活性，且paps-as和gad由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性l-丝氨酸脱水酶、硫酸腺嘌呤转移酶、aps激酶和gad活性，且paps-as由外源性多核苷酸表达。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码l-丝氨酸脱水酶的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述l-丝氨酸脱水酶包括或其组成为seqidno:1中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:1具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码l-丝氨酸脱水酶的多核苷酸包括或其组成为seqidno:2中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:2具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码硫酸腺嘌呤转移酶的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述硫酸腺嘌呤转移酶包括或其组成为seqidno:3和seqidno:5中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:3或seqidno:5具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码硫酸腺嘌呤转移酶的多核苷酸包括或其组成为seqidno:4和seqidno:6中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:4或seqidno:6具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码aps激酶的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述aps激酶包括或其组成为seqidno:7中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:7具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码aps激酶的多核苷酸包括或其组成为seqidno:8或seqidno:62中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:8或seqidno:62具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:62。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码papss1的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述papss1包括或其组成为seqidno:31中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:31具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码papss1的多核苷酸包括或其组成为seqidno:32或seqidno:63中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:32或seqidno:63具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:63。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码paps-as的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述paps-as包括或其组成为seqidno:9中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:9具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码paps-as的多核苷酸包括或其组成为seqidno:10或seqidno:61中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:10或seqidno:61具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:61。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码csad的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述csad包括或其组成为seqidno:11中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:11具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码csad的多核苷酸包括或其组成为seqidno:12、seqidno:53或seqidno:54中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:12、seqidno:53或seqidno:54具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:53或seqidno:54。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码gad的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述gad包括或其组成为seqidno:13中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:13具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码gad的多核苷酸包括或其组成为seqidno:14中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:14具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子。
在一个实施例中，提供了包括编码以下的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物：硫酸腺嘌呤转移酶和aps激酶，和/或papss1；paps-as；以及csad。在一个实施例中，提供了包括编码paps-as和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物。在另一实施例中，提供了包括编码以下的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物：硫酸腺嘌呤转移酶和aps激酶，和/或papss1；paps-as；以及gad。在一个实施例中，提供了包括编码paps-as和gad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码paps-as的外源性多核苷酸的非天然存在的埃希氏杆菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码papss1和paps-as的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的埃希氏杆菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码papss1、paps-as和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的埃希氏杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码paps-as的外源性多核苷酸的非天然存在的酵母菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码papss1和paps-as的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的酵母菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码papss1、paps-as和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的酵母菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码paps-as的外源性多核苷酸的非天然存在的杆菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码papss1和paps-as的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的杆菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码papss1、paps-as和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的杆菌属微生物。
磷酸丝氨酸或丝氨酸到牛磺酸的转化
在一些实施例中，提供一种非天然存在的微生物，其表达用于经由酶类半胱氨酸合成酶将磷酸丝氨酸转化成牛磺酸的一或多种外源性酶活性，所述酶例如用于生物合成牛磺酸的半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)/csad或gad途径的酶；和/或其表达经由酶类l-丝氨酸脱水酶、半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)和csad/gad将丝氨酸转化成牛磺酸的一或多种外源性酶活性。图5中示意性地示出用于牛磺酸生物合成的半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)/csad或gad途径和l-丝氨酸脱水酶半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)/csad或gad途径。
提供包括以下酶或酶活性的非天然存在的微生物：半胱氨酸合成酶，例如ma_3297(ec2.5.1.76)；任选地l-丝氨酸脱水酶(ec4.3.1.17)；以及半胱氨酸亚磺酸脱羧酶(csad)(ec4.1.1.29)，其中这些酶或酶活性中的至少一个由微生物已转化有的外源性多核苷酸编码。在一些实施例中，半胱氨酸合成酶、任选地l-丝氨酸脱水酶和csad酶或酶活性由微生物中的一或多种外源性多核苷酸(例如一种、两种或三种外源性多核苷酸)编码。在一些实施例中，半胱氨酸合成酶、l-丝氨酸脱水酶或csad酶或酶活性中的一个由微生物中的外源性多核苷酸编码，且其余活性在所述非天然存在的微生物所衍生自的宿主细胞中内源性地表达，即不由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性csad及任选地l-丝氨酸脱水酶活性，且半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)由微生物中的外源性多核苷酸编码。在一个实施例中，微生物表达内源性半胱氨酸合成酶，且csad由微生物中的外源性多核苷酸编码。
提供包括以下酶或酶活性的非天然存在的微生物：半胱氨酸合成酶，例如ma_3297(ec2.5.1.76)；任选地l-丝氨酸脱水酶(ec4.3.1.17)；以及谷氨酸脱羧酶(gad)(ec4.1.1.15)，其中这些酶或酶活性中的至少一个由微生物已转化有的外源性多核苷酸编码。在一些实施例中，半胱氨酸合成酶、任选地l-丝氨酸脱水酶和gad酶或酶活性由微生物中的一或多种外源性多核苷酸(例如一种、两种或三种外源性多核苷酸)编码。在一些实施例中，半胱氨酸合成酶、l-丝氨酸脱水酶或gad酶或酶活性中的一个由微生物中的外源性多核苷酸编码，且其余活性在所述非天然存在的微生物所衍生自的宿主细胞中内源性地表达，即不由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性gad及任选地l-丝氨酸脱水酶活性，且半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)由微生物中的外源性多核苷酸编码。在一个实施例中，微生物表达内源性半胱氨酸合成酶，且gad由微生物中的外源性多核苷酸编码。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码半胱氨酸合成酶的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述半胱氨酸合成酶包括或其组成为seqidno:17中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:17具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码半胱氨酸合成酶的多核苷酸包括或其组成为seqidno:18、seqidno:52或seqidno:64中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:18、seqidno:52或seqidno:64具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:52或seqidno:64。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码l-丝氨酸脱水酶的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述l-丝氨酸脱水酶包括或其组成为seqidno:1中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:1具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码l-丝氨酸脱水酶的多核苷酸包括或其组成为seqidno:2中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:2具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码csad的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述csad包括或其组成为seqidno:11中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:11具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码csad的多核苷酸包括或其组成为seqidno:12、seqidno:53或seqidno:54中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:12、seqidno:53或seqidno:54具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:53或seqidno:54。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码gad的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述gad包括或其组成为seqidno:13中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:13具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码gad的多核苷酸包括或其组成为seqidno:14中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:14具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子。
在一个实施例中，提供了包括编码半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物。在另一实施例中，提供了包括编码半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)和gad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)及任选地l-丝氨酸脱水酶的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的埃希氏杆菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)、任选地l-丝氨酸脱水酶和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的埃希氏杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)及任选地l-丝氨酸脱水酶的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的酵母菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)、任选地l-丝氨酸脱水酶和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的酵母菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)及任选地l-丝氨酸脱水酶的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的杆菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)、任选地l-丝氨酸脱水酶和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的杆菌属微生物。
经由cgl/cd；paps-as和csad或gad将半胱氨酸转化为牛磺酸
在一些实施例中，提供表达一或多种外源性酶活性的非天然存在的微生物，其经由以下酶类将半胱氨酸转化为牛磺酸：胱硫醚γ-裂解酶(cgl)/l-半胱氨酸脱巯基酶(cd)、3'磷酸腺苷酰硫酸:2-氨基丙烯酸c-磺基转移酶(paps-as)和半胱氨酸亚磺酸脱羧酶(csad)或谷氨酸脱羧酶(gad)。图6中示意性地示出用于牛磺酸生物合成的此途径。已经发现若干蛋白质具有l-半胱氨酸脱巯基酶(cd)活性(ec4.4.1.1)，包括胱硫醚γ-裂解酶(cgl)、色氨酸酶、半胱氨酸合成酶和maly(awano等人(2005)《应用与环境微生物学(applenvironmicrobiol)》71(7):4149-52.)。在一些实施例中，单一酶包括cgl活性和cd活性两者。在其它实施例中，cgl活性和cd活性由两种单独的酶提供。在一些实施例中，通过一种酶提供cd活性，并且缺少cgl活性。当存在cgl活性时，其可经由产生l-半胱氨酸而提供更大通量，所述l-半胱氨酸充当cd活性的基质。在一些实施例中，提供包括cgl活性和cd活性两者的第一酶以及仅包括cd活性的第二酶。
提供包括以下酶或酶活性的非天然存在的微生物：胱硫醚γ-裂解酶(cgl)/l-半胱氨酸脱巯基酶(cd)(ec4.4.1.1)；硫酸腺嘌呤转移酶(ec2.7.7.4)和腺苷酰硫酸激酶(aps激酶)(ec2.7.1.25)，和/或3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸合成酶(papss1)(ec2.7.7.4/ec2.7.1.25)；3'-磷酸腺苷酰硫酸:2-氨基丙烯酸c-磺基转移酶(paps-as)(ec2.8.2.-)；以及半胱氨酸亚磺酸脱羧酶(csad)(ec4.1.1.29)，其中这些酶或酶活性中的至少一个由微生物已转化有的外源性多核苷酸编码。在一些实施例中，cgl/cd；硫酸腺嘌呤转移酶和aps激酶和/或papss1；paps-as；以及csad酶或酶活性由微生物中的一或多种外源性多核苷酸(例如一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种外源性多核苷酸)编码。在一些实施例中，cgl/cd、硫酸腺嘌呤转移酶、aps激酶、papss1、paps-as和csad酶或酶活性中的一个、两个、三个、四个、五个或六个由微生物中的一或多种外源性多核苷酸编码，且其余活性在所述非天然存在的微生物所衍生自的宿主细胞中内源性地表达，即不由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性活性，且硫酸腺嘌呤转移酶和aps激酶和/或papss1、paps-as和csad由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性cgl/cd和硫酸腺嘌呤转移酶、aps激酶活性，且paps-as和csad活性由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性cgl/cd、硫酸腺嘌呤转移酶、aps激酶和csad活性，且paps-as由外源性多核苷酸表达。
提供包括以下酶或酶活性的非天然存在的微生物：胱硫醚γ-裂解酶(cgl)/l-半胱氨酸脱巯基酶(cd)(ec4.4.1.1)；硫酸腺嘌呤转移酶(ec2.7.7.4)和腺苷酰硫酸激酶(aps激酶)(ec2.7.1.25)，和/或3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸合成酶(papss1)(ec2.7.7.4/ec2.7.1.25)；3'-磷酸腺苷酰硫酸:2-氨基丙烯酸c-磺基转移酶(paps-as)(ec2.8.2.-)；以及谷氨酸脱羧酶(gad)(ec4.1.1.15)，其中这些酶或酶活性中的至少一个由微生物已转化有的外源性多核苷酸编码。在一些实施例中，cgl/cd、硫酸腺嘌呤转移酶和aps激酶和/或papss1、paps-as以及gad酶或酶活性由微生物中的一或多种外源性多核苷酸(例如一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种外源性多核苷酸)编码。在一些实施例中，cgl/cd、硫酸腺嘌呤转移酶、aps激酶、papss1、paps-as和gad酶或酶活性中的一个、两个、三个、四个、五个或六个由微生物中的一或多种外源性多核苷酸编码，且其余活性在所述非天然存在的微生物所衍生自的宿主细胞中内源性地表达，即不由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性活性，且硫酸腺嘌呤转移酶和aps激酶和/或papss1、paps-as和gad由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性cgl/cd、硫酸腺嘌呤转移酶和aps激酶活性，且paps-as和gad活性由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性cgl/cd、硫酸腺嘌呤转移酶、aps激酶和gad活性，且paps-as由外源性多核苷酸表达。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码cgl/cd的一或多种外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述cgl/cd包括或其组成为seqidno:46、seqidno:70和/或seqidno:72中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:46、seqidno:70和/或seqidno:72具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码cgl/cd的多核苷酸包括或其组成为seqidno:47、seqidno:65、seqidno:71和/或seqidno:73中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:47、seqidno:65、seqidno:71和/或seqidno:73具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:65。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码硫酸腺嘌呤转移酶的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述硫酸腺嘌呤转移酶包括或其组成为seqidno:3和seqidno:5中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:3或seqidno:5具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码硫酸腺嘌呤转移酶的多核苷酸包括或其组成为seqidno:4或seqidno:6中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:4或seqidno:6具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码aps激酶的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述aps激酶包括或其组成为seqidno:7中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:7具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码aps激酶的多核苷酸包括或其组成为seqidno:8或seqidno:62中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:8或seqidno:62具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:62。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码papss1的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述papss1包括或其组成为seqidno:31中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:31具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码papss1的多核苷酸包括或其组成为seqidno:32或seqidno:63中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:32或seqidno:63具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:63。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码paps-as的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述paps-as包括或其组成为seqidno:9中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:9具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码paps-as的多核苷酸包括或其组成为seqidno:10或seqidno:61中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:10或seqidno:61具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:61。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码csad的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述csad包括或其组成为seqidno:11中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:11具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码csad的多核苷酸包括或其组成为seqidno:12、seqidno:53或seqidno:54中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:12、seqidno:53或seqidno:54具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:53或seqidno:54。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码gad的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述gad包括或其组成为seqidno:13中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:13具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码gad的多核苷酸包括或其组成为seqidno:14中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:14具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子。
在一个实施例中，提供了包括编码以下的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物：cgl/cd、硫酸腺嘌呤转移酶和aps激酶，和/或papss1；paps-as，以及csad。在一个实施例中，提供了包括编码cgl/cd、paps-as和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物。在另一实施例中，提供了包括编码以下的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物：cgl/cd；硫酸腺嘌呤转移酶和aps激酶，和/或papss1、paps-as以及gad。在一个实施例中，提供了包括编码cgl/cd、paps-as和gad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码paps-as的外源性多核苷酸的非天然存在的埃希氏杆菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码papss1和paps-as的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的埃希氏杆菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码papss1、paps-as和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的埃希氏杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码paps-as的外源性多核苷酸的非天然存在的酵母菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码papss1和paps-as的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的酵母菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码papss1、paps-as和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的酵母菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码paps-as的外源性多核苷酸的非天然存在的杆菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码papss1和paps-as的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的杆菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码papss1、paps-as和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的杆菌属微生物。
经由cgl/cd和半胱氨酸合成酶将半胱氨酸转化为牛磺酸
在一些实施例中，提供表达一或多种外源性酶活性的非天然存在的微生物，其经由以下酶类将半胱氨酸转化为牛磺酸：胱硫醚γ-裂解酶/l-半胱氨酸脱巯基酶、半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)和半胱氨酸亚磺酸脱羧酶(csad)或谷氨酸脱羧酶(gad)。图7中示意性地示出用于牛磺酸生物合成的cgl/cd、半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)、csad或gad途径。已经发现若干蛋白质具有l-半胱氨酸脱巯基酶(cd)活性(ec4.4.1.1)，包括胱硫醚γ-裂解酶(cgl)、色氨酸酶、半胱氨酸合成酶和maly(awano等人(2005)《应用与环境微生物学(applenvironmicrobiol)》71(7):4149-52.)。在一些实施例中，单一酶包括cgl活性和cd活性两者。在其它实施例中，cgl活性和cd活性由两种单独的酶提供。在一些实施例中，通过一种酶提供cd活性，并且缺少cgl活性。当存在cgl活性时，其可经由产生l-半胱氨酸而提供更大通量，所述l-半胱氨酸充当cd活性的基质。在一些实施例中，提供包括cgl活性和cd活性两者的第一酶以及仅包括cd活性的第二酶。
提供包括以下酶或酶活性的非天然存在的微生物：胱硫醚γ-裂解酶(cgl)/l-半胱氨酸脱巯基酶(cd)(ec4.4.4.1)；半胱氨酸合成酶，例如ma_3297(ec2.5.1.76)；以及半胱氨酸亚磺酸脱羧酶(csad)(ec4.1.1.29)，其中这些酶或酶活性中的至少一个由微生物已转化有的外源性多核苷酸编码。在一些实施例中，cgl/cd、半胱氨酸合成酶和csad酶或酶活性由微生物中的一或多种外源性多核苷酸(例如一种、两种、三种或四种外源性多核苷酸)编码。在一些实施例中，cgl/cd、半胱氨酸合成酶和csad酶或酶活性中的一或多个由微生物中的一或多种外源性多核苷酸编码，且其余活性在所述非天然存在的微生物所衍生自的宿主细胞中内源性地表达，即不由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性csad活性，且cgl/cd和半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)由微生物中的外源性多核苷酸编码。在一个实施例中，微生物表达内源性cgl/cd和csad活性，且半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)由微生物中的外源性多核苷酸编码。
提供包括以下酶或酶活性的非天然存在的微生物：胱硫醚γ-裂解酶(cgl)/l-半胱氨酸脱巯基酶(cd)(ec4.4.4.1)；半胱氨酸合成酶，例如ma_3297(ec2.5.1.76)；以及谷氨酸脱羧酶(gad)(ec4.1.1.15)，其中这些酶或酶活性中的至少一个由微生物已转化有的外源性多核苷酸编码。在一些实施例中，cgl/cd、半胱氨酸合成酶和gad酶或酶活性由微生物中的一或多种外源性多核苷酸(例如一种、两种、三种或四种外源性多核苷酸)编码。在一些实施例中，cgl/cd、半胱氨酸合成酶和gad酶或酶活性中的一或多个由微生物中的一或多种外源性多核苷酸编码，且其余活性在所述非天然存在的微生物所衍生自的宿主细胞中内源性地表达，即不由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性gad活性，且cgl/cd和半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)由微生物中的外源性多核苷酸编码。在一个实施例中，微生物表达内源性cgl/cd和gad活性，且半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)由微生物中的外源性多核苷酸编码。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码cgl/cd的一或多种外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述cgl/cd包括或其组成为seqidno:46、seqidno:70和/或seqidno:72中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:46、seqidno:70和/或seqidno:72具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码cgl/cd的多核苷酸包括或其组成为seqidno:47、seqidno:65、seqidno:71和/或seqidno:73中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:47、seqidno:65、seqidno:71和/或seqidno:73具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:65。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码半胱氨酸合成酶的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述半胱氨酸合成酶包括或其组成为seqidno:17中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:17具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码半胱氨酸合成酶的多核苷酸包括或其组成为seqidno:18、seqidno:52或seqidno:64中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:18、seqidno:52或seqidno:64具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:52或seqidno:64。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码csad的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述csad包括或其组成为seqidno:11中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:11具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码csad的多核苷酸包括或其组成为seqidno:12、seqidno:53或seqidno:54中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:12、seqidno:53或seqidno:54具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:53或seqidno:54。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码gad的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述gad包括或其组成为seqidno:13中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:13具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码gad的多核苷酸包括或其组成为seqidno:14中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:14具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子。
在一个实施例中，提供了包括编码cgl/cd、半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物。在另一实施例中，提供了包括编码cgl/cd、半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)和gad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码cgl/cd和半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的埃希氏杆菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码cgl/cd、半胱氨酸合成酶和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的埃希氏杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码cgl/cd和半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的酵母菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码cgl/cd、半胱氨酸合成酶和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的酵母菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码半胱氨酸合成酶(例如ma_3297)和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的杆菌属微生物。
丙酮酸到牛磺酸的转化
在一些实施例中，提供表达外源性酶活性的非天然存在的微生物，其经由酶类l-半胱氨酸磺基裂解酶(cuya)将丙酮酸转化为牛磺酸，所述外源性酶活性例如用于生物合成牛磺酸的l-半胱氨酸磺基裂解酶(cuya)/csad或gad途径的外源性酶。图8中示意性地示出用于牛磺酸生物合成的cuya/csad或gad途径。
提供包括以下酶或酶活性的非天然存在的微生物：l-半胱氨酸磺基裂解酶(cuya)(ec4.4.1.25)；以及半胱氨酸亚磺酸脱羧酶(csad)(ec4.1.1.29)，其中这些酶或酶活性中的至少一个由微生物已经转化有的外源性多核苷酸编码。在一些实施例中，cuya和csad酶或酶活性由微生物中的一或多种外源性多核苷酸(例如一种或两种外源性多核苷酸)编码。在一些实施例中，cuya和csad酶或酶活性中的一个由微生物中的外源性多核苷酸编码，且另一活性在所述非天然存在的微生物所衍生自的宿主细胞中内源性地表达，即不由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性csad活性，且cuya由微生物中的外源性多核苷酸编码。在一个实施例中，微生物表达内源性cuya活性，且csad由微生物中的外源性多核苷酸编码。
提供包括以下酶或酶活性的非天然存在的微生物：l-半胱氨酸磺基裂解酶(cuya)(ec4.4.1.25)；以及谷氨酸脱羧酶(gad)(ec4.1.1.15)，其中这些酶或酶活性中的至少一个由微生物已经转化有的外源性多核苷酸编码。在一些实施例中，cuya和gad酶或酶活性由微生物中的一或多种外源性多核苷酸(例如一种或两种外源性多核苷酸)编码。在一些实施例中，cuya和gad酶或酶活性中的一个由微生物中的外源性多核苷酸编码，且另一活性在所述非天然存在的微生物所衍生自的宿主细胞中内源性地表达，即不由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性gad活性，且cuya由微生物中的外源性多核苷酸编码。在一个实施例中，微生物表达内源性cuya活性，且gad由微生物中的外源性多核苷酸编码。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码cuya的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述cuya包括或其组成为seqidno:37中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:37具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码cuya的多核苷酸包括或其组成为seqidno:38或seqidno:66中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:38或seqidno:66具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:66。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码csad的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述csad包括或其组成为seqidno:11中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:11具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码csad的多核苷酸包括或其组成为seqidno:12、seqidno:53或seqidno:54中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:12、seqidno:53或seqidno:54具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:53或seqidno:54。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码gad的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述gad包括或其组成为seqidno:13中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:13具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码gad的多核苷酸包括或其组成为seqidno:14中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:14具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子。
在一个实施例中，提供了包括编码cuya和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物。在另一实施例中，提供了包括编码cuya和gad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码cuya的外源性多核苷酸的非天然存在的埃希氏杆菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码cuya和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的埃希氏杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码cuya的外源性多核苷酸的非天然存在的酵母菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码cuya和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的酵母菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码cuya的外源性多核苷酸的非天然存在的杆菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码cuya和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的杆菌属微生物。
经由csad或gad将磷酸烯醇丙酮酸转化为牛磺酸
在一些实施例中，提供表达一或多种外源性酶活性的非天然存在的微生物，其经由以下酶类将磷酸烯醇丙酮酸转化为牛磺酸：磷酸磺基乳酸合成酶(coma)、2-磷酸-e-磺基乳酸脱氢酶(comb)、磺基乳酸脱氢酶(comc)和天冬氨酸转氨酶(aspat)，所述一或多种外源性酶活性例如用于生物合成牛磺酸的coma/comb/comc/aspat/csad或gad途径的一或多种外源性酶。图9中示意性地示出用于牛磺酸生物合成的coma/comb/comc/aspat/csad或gad途径。
提供包括以下酶或酶活性的非天然存在的微生物：磷酸磺基乳酸合成酶(coma)(ec4.4.1.19)、2-磷酸-3-磺基乳酸磷酸水解酶(comb)(ec3.1.3.71)、磺基乳酸脱氢酶(comc)(ec1.1.1.337)、天冬氨酸转氨酶(aspat)(ec2.6.1.1)和半胱氨酸亚磺酸脱羧酶(csad)(ec4.1.1.29)，其中这些酶或酶活性中的至少一个由所述微生物已经转化有的外源性多核苷酸编码。在一些实施例中，coma、comb、comc、aspat和csad酶或酶活性由微生物中的一或多种外源性多核苷酸(例如一种、两种、三种、四种或五种外源性多核苷酸)编码。在一些实施例中，coma、comb、comc、aspat和csad酶或酶活性中的一或多个由微生物中的一或多种外源性多核苷酸编码，且其余活性在所述非天然存在的微生物所衍生自的宿主细胞中内源性地表达，即不由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性csad和aspat活性，且coma、comb和comc由微生物中的外源性多核苷酸编码。在一个实施例中，微生物表达内源性aspat活性，且coma、comb、comc和csad由微生物中的外源性多核苷酸编码。
提供包括以下酶或酶活性的非天然存在的微生物：磷酸磺基乳酸合成酶(coma)(ec4.4.1.19)、2-磷酸-3-磺基乳酸磷酸水解酶(comb)(ec3.1.3.71)、磺基乳酸脱氢酶(comc)(ec1.1.1.337)、天冬氨酸转氨酶(aspat)(ec2.6.1.1)和谷氨酸脱羧酶(gad)(ec4.1.1.15)，其中这些酶或酶活性中的至少一个由所述微生物已经转化有的外源性多核苷酸编码。在一些实施例中，coma、comb、comc、aspat和gad酶或酶活性由微生物中的一或多种外源性多核苷酸(例如一种、两种、三种、四种或五种外源性多核苷酸)编码。在一些实施例中，coma、comb、comc、aspat和gad酶或酶活性中的一或多个由微生物中的一或多种外源性多核苷酸编码，且其余活性在所述非天然存在的微生物所衍生自的宿主细胞中内源性地表达，即不由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性gad和aspat活性，且coma、comb和comc由微生物中的外源性多核苷酸编码。在一个实施例中，微生物表达内源性aspat活性，且coma、comb、comc和gad由微生物中的外源性多核苷酸编码。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码coma的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述coma包括或其组成为seqidno:19中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:19具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码coma的多核苷酸包括或其组成为seqidno:20或seqidno:67中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:20或seqidno:67具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:67。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码comb的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述comb包括或其组成为seqidno:21中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:21具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码comb的多核苷酸包括或其组成为seqidno:22或seqidno:68中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:22或seqidno:68具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:68。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码comc的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述comc包括或其组成为seqidno:23中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:23具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码comc的多核苷酸包括或其组成为seqidno:24或seqidno:69中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:24或seqidno:69具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:69。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码csad的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述csad包括或其组成为seqidno:11中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:11具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码csad的多核苷酸包括或其组成为seqidno:12、seqidno:53或seqidno:54中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:12、seqidno:53或seqidno:54具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:53或seqidno:54。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码gad的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述gad包括或其组成为seqidno:13中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:13具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码gad的多核苷酸包括或其组成为seqidno:14中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:14具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子。
在一个实施例中，提供了包括编码coma、comb、comc和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物。在另一实施例中，提供了包括编码coma、comb、comc和gad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码coma、comb和comc的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的埃希氏杆菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码coma、comb、comc和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的埃希氏杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码coma、comb和comc的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的酵母菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码coma、comb、comc和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的酵母菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码coma、comb和comc的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的杆菌属微生物。在一个实施例中，提供了包括编码coma、comb、comc和csad的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的杆菌属微生物。
乙酰磷酸到牛磺酸的转化
在一些实施例中，提供非天然存在的微生物，其表达用于将乙酰磷酸转化为牛磺酸的一或多种外源性酶活性，例如用于生物合成牛磺酸的xsc/tpa途径的酶。图10中示意性地示出牛磺酸生物合成的xsc/tpa途径。
提供包括以下酶或酶活性的非天然存在的微生物：磺基乙醛乙酰基转移酶(xsc)(ec2.3.3.15)；以及牛磺酸-丙酮酸转氨酶(tpa)(ec2.6.1.77)，其中这些酶或酶活性中的至少一个由所述微生物已经转化有的外源性多核苷酸编码。在一些实施例中，xsc和tpa酶或酶活性由微生物中的一或多种外源性多核苷酸(例如一种或两种外源性多核苷酸)编码。在一些实施例中，xsc和tpa酶或酶活性中的一个由微生物中的外源性多核苷酸编码，且另一活性在所述非天然存在的微生物所衍生自的宿主细胞中内源性地表达，即不由外源性多核苷酸表达。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码xsc的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述xsc包括或其组成为seqidno:48中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:48具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码xsc的多核苷酸包括或其组成为seqidno:49中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:49具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码tpa的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述tpa包括或其组成为seqidno:27中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:27具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码tpa的多核苷酸包括或其组成为seqidno:28或seqidno:56中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:28或seqidno:56具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:56。
在一个实施例中，提供了包括编码xsc和tpa的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码xsc和tpa的外源性多核苷酸的非天然存在的埃希氏杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码xsc和tpa的外源性多核苷酸的非天然存在的酵母菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码xsc和tpa的外源性多核苷酸的非天然存在的杆菌属微生物。
经由tpa将磷酸烯醇丙酮酸转化为牛磺酸
在一些实施例中，提供表达一或多种外源性酶活性的非天然存在的微生物，其经由以下酶类将磷酸烯醇丙酮酸转化为牛磺酸：磷酸磺基乳酸合成酶(coma)、2-磷酸-e-磺基乳酸脱氢酶(comb)、磺基乳酸脱氢酶(comc)、磺基丙酮酸脱羧酶(comde)和牛磺酸-丙酮酸转氨酶(tpa)，所述一或多种外源性酶活性例如用于生物合成牛磺酸的coma/comb/comc、comde/tpa途径的一或多种外源性酶。图11中示意性地示出用于牛磺酸生物合成的此途径。
提供包括以下酶或酶活性的非天然存在的微生物：磷酸磺基乳酸合成酶(coma)(ec4.4.1.19)、2-磷酸-3-磺基乳酸磷酸水解酶(comb)(ec3.1.3.71)、磺基乳酸脱氢酶(comc)(ec1.1.1.337)、磺基丙酮酸脱羧酶(comde)(ec4.1.7.9)和牛磺酸-丙酮酸转氨酶(tpa)(ec2.6.1.77)，其中这些酶或酶活性中的至少一个由所述微生物已经转化有的外源性多核苷酸编码。在一些实施例中，coma、comb、comc、comde和tpa酶或酶活性由微生物中的一或多种外源性多核苷酸(例如一种、两种、三种、四种或五种外源性多核苷酸)编码。在一些实施例中，coma、comb、comc、comde和tpa酶或酶活性中的一或多个由微生物中的一或多种外源性多核苷酸编码，且其余活性在所述非天然存在的微生物所衍生自的宿主细胞中内源性地表达，即不由外源性多核苷酸表达。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码coma的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述coma包括或其组成为seqidno:19中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:19具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码coma的多核苷酸包括或其组成为seqidno:20或seqidno:67中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:20或seqidno:67具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:67。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码comb的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述comb包括或其组成为seqidno:21中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:21具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码comb的多核苷酸包括或其组成为seqidno:22或seqidno:68中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:22或seqidno:68具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:68。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码comc的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述comc包括或其组成为seqidno:23中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:23具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码comc的多核苷酸包括或其组成为seqidno:24或seqidno:69中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:24或seqidno:69具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:69。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码comde的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述comde包括或其组成为seqidno:25中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:25具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码comde的多核苷酸包括或其组成为seqidno:26或seqidno:55中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:26或seqidno:55具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:55。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码tpa的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述tpa包括或其组成为seqidno:27中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:27具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码tpa的多核苷酸包括或其组成为seqidno:28或seqidno:56中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:28或seqidno:56具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:56。
在一个实施例中，提供了包括编码coma、comb、comc和comde以及tpa的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码coma、comb、comc、comde和tpa的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的埃希氏杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码coma、comb、comc、comde和tpa的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的酵母菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码coma、comb、comc、comde和tpa的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的杆菌属微生物。
经由aspat、comde和tpa将半胱氨酸转化为牛磺酸
半胱氨酸，其为上文所描述的一些生物合成途径(参见图4、图5、图6、图7和图8)中的中间产物，其经由替代或补充csad或gad的以下酶转化成牛磺酸：天冬氨酸转氨酶(aspat)(ec2.6.1.1)，其将半胱氨酸转化为磺基丙酮酸；磺基丙酮酸脱羧酶(comde)(ec4.1.7.9)，其将磺基丙酮酸转化为磺基乙醛；以及牛磺酸-丙酮酸转氨酶(tpa)(ec2.67.1.77)，其将磺基乙醛转化为牛磺酸。图12中示意性地示出此途径。
提供包括以下酶或酶活性的非天然存在的微生物：天冬氨酸转氨酶(aspat)(ec2.6.1.1)；磺基丙酮酸脱羧酶(comde)(ec4.1.7.9)；以及牛磺酸-丙酮酸转氨酶(tpa)(ec2.67.1.77)，其中这些酶或酶活性中的至少一个由所述微生物已经转化有的外源性多核苷酸编码，且任选地用于产生半胱氨酸(如图12中所示出)的其它酶活性是所述微生物内生的或由所述微生物已经转化有的外源性多核苷酸编码。
在一些实施例中，aspat、comde和tpa酶或酶活性中的一或多个由微生物中的外源性多核苷酸编码，且其余活性在所述非天然存在的微生物所衍生自的宿主细胞中内源性地表达，即不由外源性多核苷酸表达。在一个实施例中，微生物表达内源性aspat活性，且comde和tpa由微生物中的外源性多核苷酸编码。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码comde的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述comde包括或其组成为seqidno:25中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:25具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码comde的多核苷酸包括或其组成为seqidno:26或seqidno:55中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:26或seqidno:55具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:55。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码tpa的外源性多核苷酸或其变体或同源物，所述tpa包括或其组成为seqidno:27中描绘的氨基酸序列。在一些实施例中，所述外源性多核苷酸对包括或其组成为与seqidno:27具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，编码tpa的多核苷酸包括或其组成为seqidno:28或seqidno:56中描绘的多核苷酸序列，或与seqidno:28或seqidno:56具有至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸序列为针对在微生物中的表达加以优化的密码子，例如seqidno:56。
在一个实施例中，提供了包括编码comde和tpa的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的甲基小杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码comde和tpa的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的埃希氏杆菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码comde和tpa的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的酵母菌属微生物。
在一个实施例中，提供了包括编码comde和tpa的一或多种外源性多核苷酸的非天然存在的杆菌属微生物。
增加牛磺酸积聚或牛磺酸生物合成中的中间产物积聚的突变
在一些实施例中，提供一种非天然存在的微生物，其如上文所描述产生牛磺酸，且进一步包括降解牛磺酸的途径中的突变，和/或降解牛磺酸生物合成的中间产物的途径(例如半胱氨酸降解途径)中的突变。在一些实施例中，微生物包括一或多种内源性基因序列的缺失，所述基因序列编码使牛磺酸或牛磺酸生物合成中的中间产物(例如半胱氨酸或磺基乙醛)减少的酶，由此增加牛磺酸在微生物中的积聚。图13中示意性地示出牛磺酸和半胱氨酸降解途径。牛磺酸降解途径中的酶的实例包括(但不限于)牛磺酸脱氢酶(tdh)、牛磺酸双加氧酶(tdo/taud)、γ-谷氨酰转移酶和牛磺酸-丙酮酸转氨酶(tpa)。半胱氨酸降解途径中的酶的非限制性实例为半胱氨酸磺基裂解酶(cuya)。磺基乙醛降解途径中的酶的非限制性实例为磺基乙醛乙酰基转移酶(xsc)。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码牛磺酸脱氢酶(tdh)(ec1.4.99.2)的基因序列的一或多个突变或缺失，由此相比于所述微生物所衍生自的宿主细胞降低或消除微生物中tdh的活性。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码牛磺酸双加氧酶(tdo)/taud(ec1.14.11.17)的基因序列的一或多个突变或缺失，由此相比于所述微生物所衍生自的宿主细胞降低或消除微生物中tdo/taud的活性。在一个实施例中，提供具有编码tdo/taud的基因序列的一或多个突变或缺失的埃希氏杆菌属微生物，由此降低或消除所述微生物中所述酶的活性。在一个实施例中，提供具有编码tdo/taud的基因序列的一或多个突变或缺失的酵母菌属微生物，由此相比于所述微生物所衍生自的宿主细胞降低或消除微生物中所述酶的活性。在一个实施例中，提供具有编码tdo/taud的基因序列的一或多个突变或缺失的杆菌属微生物，由此相比于所述微生物所衍生自的宿主细胞降低或消除微生物中所述酶的活性。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码半胱氨酸磺基裂解酶(cuya)(ec4.4.1.25)的基因序列的一或多个突变或缺失，由此相比于所述微生物所衍生自的宿主细胞降低或消除微生物中cuya的活性。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码γ-谷氨酰转移酶(ec2.3.2.2)的基因序列的一或多个突变或缺失，由此相比于所述微生物所衍生自的宿主细胞降低或消除微生物中γ-谷氨酰转移酶的活性。在一个实施例中，提供具有编码γ-谷氨酰转移酶的基因序列的一或多个突变或缺失的甲基小杆菌属微生物，由此降低或消除所述微生物中所述酶的活性。在一个实施例中，提供具有编码γ-谷氨酰转移酶的基因序列的一或多个突变或缺失的埃希氏杆菌属微生物，由此相比于所述微生物所衍生自的宿主细胞降低或消除微生物中所述酶的活性。在一个实施例中，提供具有编码γ-谷氨酰转移酶的基因序列的一或多个突变或缺失的杆菌属微生物，由此相比于所述微生物所衍生自的宿主细胞降低或消除微生物中所述酶的活性。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码牛磺酸-丙酮酸转氨酶(tpa)(ec2.6.1.77)的基因序列的一或多个突变或缺失，由此相比于所述微生物所衍生自的宿主细胞降低或消除微生物中牛磺酸-丙酮酸转氨酶的活性。
在一些实施例中，非天然存在的微生物包括编码磺基乙醛乙酰基转移酶(xsc)(ec2.3.3.15)的基因序列的一或多个突变或缺失，由此相比于所述微生物所衍生自的宿主细胞降低或消除微生物中磺基乙醛乙酰基转移酶的活性。
微生物的转化
许多用于在宿主细胞中引入和表达外源性多核苷酸的转化方案和构建体是本领域中已知的。
在某些实施例中，遗传修饰将利用自由复制的质粒载体来进行克隆。这些载体可包括经研发用于甲基小杆菌属的较小incp载体。这些载体可包括用于克隆的pcm62、pcm66或phc41。(marx、c.j.和m.e.lidstrom，《微生物学(microbiology)》，(2001)147:2065-2075；chou,h.-h.等人，《公共科学图书馆-遗传学(plosgenetics)》，(2009)5:e1000652)
在某些实施例中，遗传修饰将利用自由复制的表达质粒，例如pcm80、pcm160、phc90或phc91。(marx、c.j.和m.e.lidstrom，《微生物学》，(2001)147:2065-2075；chou,h.-h.等人，《公共科学图书馆-遗传学》，(2009)5:e1000652)
在某些实施例中，遗传修饰将利用自由复制的表达质粒，所述表达质粒具有回应于诱导分子的水平的能力，所述诱导分子例如二甲氨基二硫代甲酸铜(cumate)或无水四环素。这些表达质粒包括phc115、plc290、plc291。(chou,h.-h.等人，《公共科学图书馆-遗传学》，(2009)5:e1000652；chubiz,l.m.等人，《bmc研究笔记(bmcresearchnotes)》，(2013)6:183)
在某些实施例中，遗传修饰将利用可再循环的抗生素标记系统，例如cre-lox系统。所述系统可以包括经研发用于扭脱甲基小杆菌属的pcm157、pcm158、pcm184、pcm351系列质粒的使用。(marx、c.j.和m.e.lidstrom，《生物技术》，(2002)33:1062-1067)
在某些实施例中，遗传修饰将利用可再循环的抗生素标记系统，例如cre-lox系统。所述系统可以包括经研发用于扭脱甲基小杆菌属的pcm157、pcm158、pcm184、pcm351系列质粒的使用(marx、c.j.和m.e.lidstrom，《生物技术》，(2002)33:1062-1067)。
在某些实施例中，遗传修饰将利用转座子诱变。所述转座子诱变可以包括例如pcm639(d'argenio、d.a.等人，《细菌学杂志(journalofbacteriology)》，(2001)183:1466-1471)的mini-tn5传递系统，其在扭脱甲基小杆菌属中得以证实。(marx、c.j.等人，《细菌学杂志》，(2003)185:669-673)
在某些实施例中，遗传修饰将利用直接引入到染色体位点中的表达系统。所述表达系统可以包括经研发用于扭脱甲基小杆菌属am1的pcm168、pcm172和phc01质粒。(marx、c.j.和m.e.lidstrom，《微生物学》，(2001)147:2065-2075；lee,m.-c.等人，《进化(evolution)》，(2009)63:2813-2830)
在某些实施例中，遗传修饰将利用基于sacb的系统用于等位基因的无标记交换，这是因为sacb表达提供蔗糖敏感度。所述系统可以包括最初用扭脱甲基小杆菌属进行测试的pcm433载体。(marx、c.j.等人，《bmc研究笔记》，(2008)1:1)
微生物培养基
提供了产生牛磺酸和/或牛磺酸前体的方法。所述方法包括在适合于微生物生长和如本文所描述的用于牛磺酸生物合成的酶进行表达的条件下，在培养基中培养如本文所描述的非天然存在的微生物，其中包括牛磺酸和/或牛磺酸前体的生物质在培养基中产生。在微生物还产生一或多种类胡萝卜素化合物(例如微生物已经遗传修饰或人工预选以产生升高水平的一或多种类胡萝卜素化合物)的实施例中，产生包括牛磺酸和/或牛磺酸前体以及一或多种类胡萝卜素化合物的生物质。
所述培养基包括碳源、氮源、无机物质(例如无机盐)，和微生物生长所需要的任何其它物质(例如维生素、氨基酸等)。
碳源可以包括：糖，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇和麦芽糖；有机酸，例如乙酸、反丁烯二酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙酮酸、丙二酸和抗坏血酸；醇类，例如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丁醇和甘油；油或脂肪，例如大豆油、米糠油、橄榄油、玉米油、芝麻油、亚麻籽油以及其类似者。所添加的碳源的量根据碳源的种类而变化，例如每升培养基约1g到约100g或约2g到约50g。
在一些实施例中，将c1碳基质提供给能够将这种基质转化为有机产物的微生物(例如，甲基小杆菌属、甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基弯曲菌属、甲基环孢菌属、甲基微菌属的微生物)。在某些实施例中，c1碳基质是选自甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、甲基化胺、甲基化硫醇和二氧化碳。在某些实施例中，c1碳基质是选自甲醇、甲醛和甲基化胺。在某些实施例中，c1碳基质是甲醇。
氮源可以包括单独或组合形式的硝酸钾、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、氨、尿素以及其类似者。所添加的氮源的量根据氮源的种类而变化，例如每升培养基约0.1g到约30g或约1g到约10g。
无机盐可以包括单独或以组合形式的磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸铁、硫酸亚铁、氯化铁、氯化亚铁、硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化锌、硫酸铜、氯化钙、碳酸钙、碳酸钠、硫酸钠以及其类似者。无机盐的量根据无机盐的种类而变化，例如每升培养基约0.001g到约10g。
可以包括单独或组合形式的特定必需物质，例如维生素、核酸、酵母提取物、蛋白胨、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、黄豆粕、干酵母等。所使用的特定必需物质的量根据物质的种类而变化，例如每升培养基约0.2g到约200g或约3g到约10g。
在一些实施例中，培养基的ph被调整为约2到约12或约6到约9的ph。培养基可进一步包括用以将培养基维持在所要ph的一或多种缓冲液。许多缓冲液是本领域中已知的，并且包括磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、pipes、hepes和tris缓冲液。本领域的普通技术人员可以容易地确定用于给定微生物的合适缓冲液。针对甲基小杆菌属，lee等人((2009)《进化》，63:2813-2830)描述的一种常用培养基为磷酸盐缓冲培养基，其由以下构成：1ml痕量金属溶液(向1升去离子水中按次序添加以下物质：12.738gedta二钠盐二水合物、4.4gzns0-7h20、1.466gcaci2-2h2o、1.012gmnci2-4h20、0.22g(nh4)6mo7o24-4h20、0.314gcuso4-5h20、0.322gcocl2-6h20和0.998gfe3(so4)2-7h20；每次添加后维持ph5.0)；100ml磷酸盐缓冲液(25.3gk2hpo4和22.5gnah2po4溶于1升去离子水中)；100ml硫酸盐溶液(5g(nh4)2(so4)和0.98gmg(so4)2溶于1升去离子水中)；以及799ml去离子水。将所有组分单独加热除菌，且随后合并在一起。最近研发出的与扭脱甲基小杆菌属一起使用的替代培养基利用有机缓冲液，且具有柠檬酸螯合的痕量金属混合物。培养在通过摇晃或通气/搅拌提供的好氧条件下，在15到40℃且优选地在20到35℃的温度下进行，通常持续1到20天，且优选地持续1到4天。甲基小杆菌属的惯例是30℃。制作m-pipes培养基的方案描述于delaney等人(2013)《公共科学图书馆·综合(plosone)》(8:e62957)的表s1中。ussn61/863,701中的图2示出针对与扭脱甲基小杆菌属一起使用优化的培养基的示例性配方。
为了产生微生物(例如甲基小杆菌属)的高浓度培养基，可能有利的是使用分批进料方法。可在0.5％到1％v/v(约120到240mm)下充分容许甲醇，且由此可重复使用此步骤大小的添加物。关键地，在甲醇上进行培养的期间ph水平下降，使得例如koh或naoh的碱的使用将为变得重要，以将ph维持在约6.5。可经由物理搅拌(例如叶轮)、经由鼓入经过滤空气或纯氧或其组合来实现通气。为了降低生产成本，缓冲液可从磷酸盐或pipes更换成碳酸盐缓冲培养基。
可从培养基中分离出微生物细胞，例如通过例如离心或过滤的常规手段。所述细胞可完整地分离，或可以裂解以释放其内含物以供萃取或进一步处理。可以使细胞或培养基经受使用合适溶剂的萃取。
作为分子伴侣和抗氧化剂的细胞内牛磺酸
经工程改造以产生高水平牛磺酸或亚牛磺酸的微生物细胞具有含量增加的一种重要渗透物，已知其促进蛋白质折叠且减少氧化(warskulat等人(2007)《酶学方法》428:439-58；abe等人(2015)《氨基酸》47(5):909-15；fujii等人(2007)《生物化学杂志》141(5):697-707)；oliveira等人(2010)《药理报道》62:185-193；aruoma等人(1988)《生物化学杂志》256:251-55；bucolo等人(2016)《眼科学学报》95(256)；patel等人(2016)《经验毒性病理学》68(2-3):103-12；fontana等人(2004)《神经化学研究》29(1):111-116)。当微生物细胞用于表达相关蛋白质时，细胞内牛磺酸或亚牛磺酸可有助于增加蛋白质折叠或通过氧化减少蛋白质失活。由此，使用经工程改造以积聚细胞内牛磺酸或亚牛磺酸的微生物可增加相关蛋白质的产量和/或比活性。
产生有助于蛋白质折叠的细胞内牛磺酸和/或亚牛磺酸具有成本和效益的双重潜在益处。在活体内产生牛磺酸或亚牛磺酸应当比从外部添加牛磺酸或亚牛磺酸更便宜。如果同时考虑较高水平的牛磺酸或亚牛磺酸，细胞内蛋白质生产也可更具效益。从细胞培养基转运到细胞中一般需要培养基中具有较高浓度的这些基质和/或需要细胞能量以用于主动转运。
含有牛磺酸和牛磺酸前体的组合物
提供用于水产养殖或作为动物饲料或作为人体营养补充物的饲料组合物以及制备饲料组合物的方法，所述饲料组合物含有来自如本文所描述的非天然存在的微生物的经处理或未经处理生物质。
所述饲料组合物或营养补充物包括通过非天然存在的微生物产生的牛磺酸和/或一或多种牛磺酸前体，例如半胱氨酸、磺基乙醛和/或亚牛磺酸。在一些实施例中，通过微生物产生的牛磺酸和/或牛磺酸前体囊封于饲料组合物或补充物中的微生物中，例如囊封于微生物的细胞膜的脂质双层中。在一些实施例中，通过微生物生物催化剂产生的牛磺酸和/或牛磺酸前体排出到培养基中，并且例如使用层析或其它分离和纯化程序进一步加以纯化。在一些实施例中，以化学方式从生产微生物萃取牛磺酸和/或牛磺酸前体。
牛磺酸和/或牛磺酸前体可由微生物聚积和囊封或可以输出到细胞外部。输出所需要的条件可为在微生物生长期间连续的，或可以通过限制营养素(例如生物素)或通过提供微生物生长抑制剂(例如抗生素或表面活性剂)来加以刺激。
在一些实施例中，从含有微生物细胞和微生物产生的牛磺酸的培养基中分离并纯化牛磺酸和/或牛磺酸前体的方法可使用离子交换，例如离子交换树脂。在一些实施例中，可通过离心、浓缩或过滤来分离微生物细胞，且牛磺酸和/或牛磺酸前体浓缩到例如至少约80％纯度。
在某些实施例中，并入到饲料或营养补充物组合物中的生物质可呈无水形式或大体上无水形式，例如含有少于约20％、10％、5％或2％的水分。在某些实施例中，例如通过滤波、沉降或离心，通过去除大体上全部上清液来分离培养基。在某些实施例中，例如通过使用清洁剂或超声波，培养基的收集和生物质的进一步处理不包括细菌裂解步骤。在某些实施例中，经处理的微生物细胞维持大体上完整的细胞膜。在一些实施例中，绝大部分(例如超过约5％、10％、20％、30％、50％或80％)的细菌细胞可在经处理生物质中维持生存力。
饲料组合物可含有至少约1重量％的生物质。在某些实施例中，饲料组合物针对鱼类、海鲜、人类或其它动物的食用加以优化。举例来说，饲料可以包括epa、dha和一或多种必需氨基酸中的一或多个。
还提供制备饲料组合物的方法。在一些实施例中，所述方法包括：(a)在适当的培养基中培养如上文所描述的至少一种非天然存在的微生物；(b)浓缩培养基以提供生物质；(c)任选地提供其它饲料组分；以及(d)从生物质产生饲料组合物。在某些实施例中，步骤(b)包括离心。在某些实施例中，步骤(b)包括使生物质沉淀。在某些实施例中，步骤(b)包括过滤。在某些实施例中，所述方法进一步包括在步骤(a)之后用化学试剂(例如表面活性剂或溶剂)对生物质进行预处理，以使生物质的细胞膜破裂。在某些实施例中，所述方法进一步包括在步骤(a)之后以机械方式使生物质的细胞膜破裂。
其中可并有富含如本文所描述产生的牛磺酸和/或牛磺酸前体的单细胞蛋白质的饲料的实例包括(例如)：宠物食品，例如猫粮、狗粮等等；用于观赏鱼类、养殖鱼类或甲壳动物等的饲料；用于农场饲养动物(包括家畜并且进一步包括水产养殖中饲养的鱼类或甲壳动物)的饲料。生物质的状态可呈完整细胞、裂解或经部分处理。本文中所描述产生的牛磺酸和/或牛磺酸前体和/或其它卡路里或营养补充物也可以并入到供人类食用的食物或维生素补充物中。其中并入有如本文所描述产生的牛磺酸和/或牛磺酸前体的食物或饲料材料优选地是作为既定接收方的生物体适口的。所述食物或饲料材料可具有目前已知用于食物材料的任何物理性质(例如固体、液体、柔软的)。在一些实施例中，如本文所描述产生的饲料将经历粒化过程，例如经历包合率小于约1％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％或75％的热或冷挤出工艺。在其它情形中，富含牛磺酸和/或牛磺酸前体的蛋白质可直接100％地食用，或与呈液体形式、烘焙物形式或其它形式的另一物质混合，以形成(包括但不限于)不同类型的片剂、胶囊、可饮用剂、含漱剂等。
还提供生产鱼类或海鲜的方法，包括养殖鱼类或海鲜，以及向所述鱼类或海鲜提供包括如本文所描述的饲料组合物的饲料。
以下实例旨在进行说明，而非限制本发明。
实例
实例1
方法：
利用标准分子克隆技术和密码子经优化、合成衍生的dna来构建表达质粒(参见表1)。将这些质粒转化到扭脱甲基小杆菌属或大肠杆菌属bl21(de3)中。
在基于choi等人的(1989)《微生物学生物工程应用(applmicrobiolbioeng)》(17:392-6)的基本培养基中培养扭脱甲基小杆菌属菌株。用0.5％甲醇、10ug/ml甲氯苄啶(trimethoprim)和50ug/ml卡那霉素(kanamycin)修改所述培养基。为了进行表达，在250ml锥形瓶中将饱和的扭脱甲基小杆菌属培养基稀释100倍，稀释成25ml的新制培养基，并在30℃下以200rpm进行摇晃。在24小时和36小时时，向培养基中加入另外0.5％甲醇并用0.0125ng/ul到0.05ng/ul的无水四环素(atc)进行诱导。在48小时与52小时之间收集扭脱甲基小杆菌属培养基。离心之后，将细菌沉淀物用1/20x磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤一次并在-20℃下冷冻。
在用100ug/ml羧苄青霉素和125um异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)修改的lb(每升10g胰蛋白胨、10gnacl、5g酵母提取物)中培养大肠杆菌属培养基。稀释100倍至500倍之后，在30℃下以200rpm摇晃大肠杆菌属培养基12至24个小时。离心之后，将细菌沉淀物用1/20xpbs洗涤一次并在-20℃下冷冻。
为了诱导伴侣蛋白以帮助蛋白质折叠，向大肠杆菌属或扭脱甲基小杆菌属属的培养基中添加5到10mm的甜菜碱(bet)或苄醇(ba)，如marco等人(2005)《细胞应激与伴侣蛋白(cellstress&chaperones)》(10(4):329-339)中所描述。
为了萃取细胞内的游离氨基酸，将冷冻的细菌沉淀物再悬浮于1:1的甲醇:水中，并使用干冰/乙醇浆液和水浴超声发生器使其经受3至4次冻结-融化循环。在离心之后，利用所提供的方案，使用watersaccq-tagultrachemistry试剂盒(176001235)衍生萃取的上清液。在装备有3100mass光谱光度计的watersacquityh-classuplc上分析所衍生的样品。将样品与用牛磺酸、亚牛磺酸和l-半胱氨酸修改的所包括氨基酸标准物进行比较。通过与标准物样品在相同滞留时间下匹配正常所衍生氨基酸质量的质谱离子的存在，证实了牛磺酸或亚牛磺酸的存在。结果在表2中。
结果：
表1.用于牛磺酸和亚牛磺酸产生的表达构建体
表2.细胞内牛磺酸或亚牛磺酸的检测结果和浓度
氨基酸和核苷酸序列
seqidno:1
描述：l-丝氨酸脱水酶
别名：mext_3740、a9vxe2
长度：453
类型：蛋白质
生物体：扭脱甲基小杆菌属pa1
seqidno:2
描述：l-丝氨酸脱水酶
别名：mext_3740、a9vxe2
长度：1362
类型：dna
生物体：扭脱甲基小杆菌属pa1
seqidno:3
描述：硫酸腺苷酰基转移酶亚基1
别名：mext_2232
长度：469
类型：dna
生物体：扭脱甲基小杆菌属pa1
seqidno:4
描述：硫酸腺苷酰基转移酶亚基1
别名：mext_2232
长度：1410
类型：dna
生物体：扭脱甲基小杆菌属pa1
seqidno:5
描述：硫酸腺苷酰基转移酶亚基2
别名：mext_2233
长度：309
类型：蛋白质
生物体：扭脱甲基小杆菌属pa1
seqidno:6
描述：硫酸腺苷酰基转移酶亚基2
别名：mext_2233
长度：930
类型：dna
生物体：扭脱甲基小杆菌属pa1
seqidno:7
描述：腺苷酰硫酸激酶
别名：cysc、nc_000913.3
长度：204
类型：蛋白质
生物体：大肠杆菌属k-12
seqidno:8
描述：腺苷酰硫酸激酶
别名：cysc、nc_000913.3
长度：606
类型：dna
生物体：大肠杆菌属k-12
seqidno:9
描述：paps-as
别名：qo19p5
长度：322
类型：蛋白质
生物体：金牛鸵球藻(ostreococcustauri)
seqidno:10
描述：paps-as
别名：ot_ostta05g01260
长度：696
类型：dna
生物体：金牛鸵球藻
seqidno:11
描述：csad
别名：ref|wp_006454033.1
长度：488
类型：蛋白质
生物体：聚球藻属(synechococcus)pcc7335物种
seqidno:12
描述：csad
别名：ref|wp_006454033.1
长度：1467
类型：dna
生物体：聚球藻属pcc7335物种
seqidno:13
描述：gada
长度：466
类型：蛋白质
生物体：大肠杆菌属k12菌株mg1655亚种
seqidno:14
描述：gada
长度：1401
类型：dna
生物体：大肠杆菌属k12菌株mg1655亚种
seqidno:15
描述：cdo
别名：cdoa、bsu31140、o32085、cdo_bacillus
长度：160
类型：蛋白质
生物体：枯草杆菌(bacillussubtilis)
seqidno:16
描述：cdo
别名：cdoa、bsu31140、o32085、cdo_bacillus
长度：486
类型：dna
生物体：枯草杆菌
seqidno:17
描述：ma_3297
长度：416
类型：蛋白质
生物体：乙酸甲烷八叠球菌属(methanosarcinaacetivorans)c2a菌株
seqidno:18
描述：ma_3297
长度：1251
类型：dna
生物体：乙酸甲烷八叠球菌属c2a菌株
seqidno:19
描述：coma
别名：磷酸磺基乳酸合成酶
长度：252
类型：蛋白质
生物体：斯氏甲烷球形菌属(methanosphaerastadtmanae)dsm3091
seqidno:20
描述：coma
别名：磷酸磺基乳酸合成酶
长度：759
类型：dna
生物体：斯氏甲烷球形菌属dsm3091
seqidno:21
描述：comb1
长度：342
类型：蛋白质
生物体：斯氏甲烷球形菌属dsm3091
seqidno:22
描述：comb1
长度：342
类型：dna
生物体：斯氏甲烷球形菌属dsm3091
seqidno:23
描述：comc
别名：磺基乳酸脱氢酶
长度：342
类型：蛋白质
生物体：甲烷小杆菌属(methanobacterium)mb1物种
seqidno:24
描述：comc
别名：磺基乳酸脱氢酶
长度：342
类型：dna
生物体：甲烷小杆菌属mb1物种
seqidno:25
描述：comde
别名：磺基丙酮酸脱羧酶
长度：397
类型：蛋白质
生物体：乙酸甲烷八叠球菌属c2a菌株
seqidno:26
描述：comde
别名：磺基丙酮酸脱羧酶
长度：1164
类型：dna
生物体：乙酸甲烷八叠球菌属c2a菌株
seqidno:27
描述：牛磺酸-丙酮酸转氨酶(tpa)
长度：463
类型：蛋白质
生物体：混浊红球菌属(rhodococcusopacus)
seqidno:28
描述：牛磺酸-丙酮酸转氨酶(tpa)
长度：1393
类型：dna
生物体：混浊红球菌属
seqidno:29
描述：γ-谷氨酰转移酶/谷胱甘肽水解酶/γ-谷氨酰转肽酶
别名：mext_1030
长度：1393
类型：蛋白质
生物体：扭脱甲基小杆菌属pa1
seqidno:30
描述：γ-谷氨酰转移酶/谷胱甘肽水解酶/γ-谷氨酰转肽酶
别名：mext_1030
长度：1878
类型：dna
生物体：扭脱甲基小杆菌属pa1
seqidno:31
描述：papss1：双功能3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸合成酶1
别名：e1c8p2
长度：624
类型：蛋白质
生物体：原鸡属(gallusgallus)
seqidno:32
描述：papss1：双功能3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸合成酶1
别名：e1c8p2
长度：1875
类型：dna
生物体：原鸡属
seqidno:33
描述：p3mdo
别名：q9i0n5、pa2602
长度：201
类型：蛋白质
生物体：绿脓杆菌属(pseudomonasaeruginosa)pao1
seqidno:34
描述：p3mdo
别名：q9i0n5、pa2602
长度：606
类型：dna
生物体：绿脓杆菌属pao1
seqidno:35
描述：哺乳类动物的cdo
别名：p21816、cdo_rat
长度：200
类型：蛋白质
生物体：褐家鼠(rattusnorvegicus)
seqidno:36
描述：哺乳类动物的cdo
别名：p21816、m35266.1、cdo_rat
长度：603
类型：dna
生物体：褐家鼠
seqidno:37
描述：cuya
长度：339
类型：蛋白质
生物体：波默罗伊鲁杰氏菌属(ruegeriapomeroyi)
seqidno:38
描述：cuya
长度：1020
类型：dna
生物体：波默罗伊鲁杰氏菌属
seqidno:39
描述：启动子p_tac
长度：74
类型：dna
生物体：扭脱甲基小杆菌属
seqidno:40
描述：启动子p_taca
长度：80
类型：dna
生物体：扭脱甲基小杆菌属
seqidno:41
描述：启动子p_lac
长度：33
类型：dna
生物体：扭脱甲基小杆菌属
seqidno:42
描述：启动子p_r
长度：109
类型：dna
生物体：噬菌体16-3
seqidno:43
描述：启动子pmxaf
长度：109
类型：dna
生物体：扭脱甲基小杆菌属
seqidno:44
描述：ado(2-氨基乙醇双加氧酶)
别名：gm237、np_001005419.2
长度：256
类型：蛋白质
生物体：小家鼠(musmusculus)
seqidno:45
描述：ado(2-氨基乙醇双加氧酶)
别名：gm237、np_001005419.2
长度：771
类型：dna
生物体：小家鼠
seqidno:46
描述：胱硫醚γ-裂解酶
别名：mccb、bsu27250
长度：379
类型：蛋白质
生物体：枯草杆菌168
seqidno:47
描述：胱硫醚γ-裂解酶
别名：mccb、bsu27250
长度：1140
类型：dna
生物体：枯草杆菌168
seqidno:48
描述：磺基乙醛乙酰基转移酶
别名：xsc
长度：593
类型：蛋白质
生物体：脱氮副球菌属(paracoccusdenitrificans)
seqidno:49
描述：磺基乙醛乙酰基转移酶
别名：xsc
长度：1782
类型：dna
生物体：脱氮副球菌属
seqidno:50
描述：cdo
别名：cdoa、bsu31140、o32085、cdo_bacillus
长度：486
类型：dna
密码子优化：大肠杆菌属
seqidno:51
描述：哺乳类动物的cdo
别名：p21816、m35266.1、cdo_rat
长度：1482
类型：dna
密码子优化：大肠杆菌属
seqidno:52
描述：ma_3297
长度：1251
类型：dna
密码子优化：大肠杆菌属
seqidno:53
描述：csad
别名：ref|wp_006454033.1
长度：1467
类型：dna
密码子优化：大肠杆菌属
seqidno:54
描述：csad
别名：ref|wp_006454033.1
长度：1467
类型：dna
密码子优化：扭脱甲基小杆菌属
seqidno:55
描述：comde
别名：磺基丙酮酸脱羧酶
长度：1164
类型：dna
密码子优化：扭脱甲基小杆菌属
seqidno:56
描述：牛磺酸-丙酮酸转氨酶(tpa)
长度：1393
类型：dna
密码子优化：扭脱甲基小杆菌属
seqidno:57
描述：ado(2-氨基乙醇双加氧酶)
别名：gm237、np_001005419.2
长度：771
类型：dna
密码子优化：扭脱甲基小杆菌属
seqidno:58
描述：cdo
别名：cdoa、bsu31140、o32085、cdo_bacillus
长度：486
类型：dna
密码子优化：扭脱甲基小杆菌属
seqidno:59
描述：哺乳类动物的cdo
别名：p21816、m35266.1、cdo_rat
长度：603
类型：dna
密码子优化：扭脱甲基小杆菌属
seqidno:60
描述：p3mdo
别名：q9i0n5、pa2602
长度：606
类型：dna
密码子优化：扭脱甲基小杆菌属
seqidno:61
描述：paps-as
别名：ot_ostta05g01260
长度：696
类型：dna
密码子优化：扭脱甲基小杆菌属
seqidno:62
描述：腺苷酰硫酸激酶
别名：cysc、nc_000913.3
长度：606
类型：dna
密码子优化：扭脱甲基小杆菌属
seqidno:63
描述：papss1：双功能3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸合成酶1
别名：e1c8p2
长度：1875
类型：dna
密码子优化：扭脱甲基小杆菌属
seqidno:64
描述：ma_3297
长度：1251
类型：dna
类型：dna
密码子优化：扭脱甲基小杆菌属
seqidno:65
描述：胱硫醚γ-裂解酶(cgl)
别名：mccb、bsu27250
长度：1140
类型：dna
密码子优化：扭脱甲基小杆菌属
seqidno:66
描述：cuya
长度：1020
类型：dna
密码子优化：扭脱甲基小杆菌属
seqidno:67
描述：coma
别名：磷酸磺基乳酸合成酶
长度：759类型：dna
密码子优化：扭脱甲基小杆菌属
seqidno:68
描述：comb1
长度：342
类型：dna
密码子优化：扭脱甲基小杆菌属
seqidno:69
描述：comc
别名：磺基乳酸脱氢酶
类型：dna
密码子优化：扭脱甲基小杆菌属
seqidno:70
描述：胱硫醚-β-裂解酶/l-半胱氨酸脱巯基酶
别名：metc
长度：395
类型：蛋白质
生物体：大肠杆菌属
seqidno:71
描述：胱硫醚-β-裂解酶/l-半胱氨酸脱巯基酶
别名：metc
长度：1188
类型：dna
生物体：大肠杆菌属
seqidno:72
描述：具有l-半胱氨酸脱巯基酶活性的半胱氨酸合成酶b
别名：cysm
长度：303
类型：蛋白质
生物体：大肠杆菌属
seqidno:73
描述：具有l-半胱氨酸脱巯基酶活性的半胱氨酸合成酶b
别名：cysm
长度：912
类型：dna
生物体：大肠杆菌属
尽管已出于清楚理解的目的通过说明和实例相当详细地描述前述发明，但所属领域的技术人员将显而易见的是，可在不脱离所附权利要求书中所叙述的本发明的精神或范围的情况下实践某些改变和修改。因此，所述描述不应被解释为限制本发明的范围。
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