专利名称：微量检测吩嗪-1-羧酸的毛细管电泳分析方法
技术领域：
本发明涉及一种微量检测吩嗪-l-羧酸的毛细管电泳分析方法，具体涉及一种 利用电堆积非水相毛细管富集电泳检测微量吩嗪-l-羧酸的方法，包括内标法和 外标法的定量分析。
技术背景吩嗪-l-羧酸是一种对小麦全蚀病、西瓜炭疽病和辣椒疫病等病原菌有着很 强抑制作用的抗生物质，吩嗪-l-羧酸的良好生物防治作用使人们开始致力于研 究开发新型的吩嗪-l-羧酸生物农药来替代污染严重的一些化学农药。申嗪霉素 是目前国内正广泛推广应用的一种微生物源农药，其主要有效成分为吩嗪-l-羧 酸，该农药对枯萎性根腐和茎腐病害的防治效果可达到80%以上。目前常用的吩嗪-l-羧酸检测技术主要为高效液相色谱法[朱栋华等，色谱， 2001， 19， 6:558-559; Slininger PJ， et al. Appl Microbiol. Biotechnol 1995. 43:794-800]，但此方法的最低检测限仅为30吗/mL，仍不能满足农药残留分析 及其他高精确度分析的要求。针对这种情况，有必要进行微量检测吩嗪一1一羧 酸的毛细管电泳方法的研究。电堆积富集技术是毛细管电泳中的一种在线样品浓縮技术，通过流体动力 学进样来实现。目前很少用于农药残留的分析。 发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出一种微量检测吩嗪-l-羧酸的 毛细管电泳分析方法，能对微量吩嗪-l-羧酸进行快速、简便的检测，提高检测 精度，以满足农药残留分析及各种高精度分析的需求。为实现上述目的，本发明利用电堆积非水相毛细管富集电泳检测微量吩嗪 -l-羧酸，在电泳条件下采用内标法或外标法定量分析样品中吩嗪-l-羧酸的浓度，其中内标法测量时将待测样品溶于含有150 250pg/mL吩嗪的甲醇溶液中再进 行电泳分析，外标法测量时将待测样品直接溶于甲醇溶液中再进行电泳分析。 本发明的方法具体为内标法将待测样品溶于含有150 250pg/mL吩嗪的甲醇溶液中，采用内径 为50~100nm的石英毛细管柱，长度为30 70cm;分离电压为15 25kV;检测 波长230 260nm;柱温23~28°C;缓冲液为5~20mM磷酸缓冲液，pH值6.0-7.0; 上样方式为10~20cm高度压差进样60 80s，定量分析样品中吩嗪-l-羧酸的浓度。外标法将待测样品溶于甲醇中，采用内径为50 100^im的石英毛细管柱， 长度为30~70cm;分离电压为15~25kV;检测波长230~260nm;柱温23~28°C; 缓冲液为5~20mM磷酸缓冲液，pH值6.0-7.0; 上样方式为10~20cm高度压差 进样60 80s，定量分析样品中吩嗪-l-羧酸的浓度。本发明的积极效果在于1、 本发明在检测的同时利用电堆积富集技术对吩嗪-l-羧酸进行了柱内富 集，提高了分析检测吩嗪-l-羧酸的精度，大大降低了方法的检测限，最低检测 限为0.03~0.05pg/mL， 最低定量限为0.08~0.15|ag/mL， 实现了对吩嗪-l-羧酸的微量检测。2、 本发明方法可以用于土壤、农产品和食品中吩嗪-l-羧酸的残留检测，以 及其他高精度分析中。3、 本发明方法准确简便，重复性好，当吩嗪-l-羧酸在0.075~30tig/mL之间， 均有较好的线性关系，线性相关系数大于0.98。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下实施例不 构成对本发明的限定。 实施例1:(一)仪器设备及原材料北京宾达1229 —高效毛细管电泳分析仪(配紫外监测器)，南京千谱 HW-2000色谱工作站，内径为50~100pm的石英毛细管柱，长度为30 70cm(河4北永年光学纤维厂)。甲醇(HPLC级)，三蒸水(电导率为0.082nS/cm)(二) 吩嗪-l-羧酸晶体的制备1. 将假单胞菌M18发酵后的发酵液用1.0M HC1酸化至pH=2.0，将处理好的 发酵液与3倍体积的氯仿混匀，振荡萃取，3000xg离心20分钟，取有机相蒸 发尽干，得吩嗪-l-羧酸粗提物。2. 将吩嗪-l-羧酸粗提物以氯仿为洗脱剂进行硅胶柱层析，每30分钟收集一瓶， 并进行HPLC检测，合并仅含吩嗪-l-羧酸单峰的洗脱液，浓縮尽干，并在真空 干燥箱中干燥，得吩嗪-l-羧酸黄绿色晶体。(三) 吩嗪-l-羧酸分析样品的制备1. 配制0.06~30pg/mL之间七个不同的浓度梯度的吩嗪-l-羧酸甲醇溶液，其中 含有200吗/mL吩嗪作为内标，同时配制不含内标的相应浓度吩嗪-l-羧酸甲 醇溶液用于外标法测量。2. 将步骤l中配制的溶液过46pm滤膜进行过滤。3. 电泳条件毛细管内径75jxm，长度59cm;分离电压20kV;检测波长254nm;柱温28 °C;缓冲液lOmM磷酸缓冲液，pH值6.6; 进样方式20cm高度压差进样75s。4. 测得内标法和外标法测量吩嗪-1 -羧酸的标准曲线分别为y=0.1397x+0.00515， y = 344539x +3255.7，线性相关系数分别为0.9994， 0.9990。实施例2:发酵液中吩嗪-l-羧酸的测定。取发酵10h后的假单胞菌M18发酵液180nL，添加1M HC1将pH值调整 至2.0。将处理好的发酵液与540pL的氯仿混匀，振荡萃取，12000xg离心5min，取出500pL有机相真空干燥，最后溶解于500pL含有200ng/mL吩嗪的甲醇溶 液，混匀。
在下列条件下分离电压20kV，检测波长254nrn缓冲液，柱温25°C， 10mM pH6.6磷酸缓冲液，20cm高度压差进样75s，毛细管内径75pm，长度59cm， 进行毛细管电泳分析，测得10h假单胞菌M18发酵液中的吩嗪-l-羧酸的浓 度为26.81pg/mL。
实施例3:吩嗪-l-羧酸土壤中残留的测定。
在25g 土壤中均匀施加lmL浓度1.5pg/mL的吩嗪-l-羧酸甲醇溶液，即施 药浓度为0.30mg/kg，将经过处理的土壤用lOOmL二氯甲垸进行超声提取，将 提取液进行固相萃取后，收集固相萃取洗脱液，浓縮尽干，真空干燥后获得待 测样品。
将待测样品溶解于5mL甲醇中，并过46pm滤膜进行过滤，将滤液在实施 例1中的电泳条件下进行分析，可测得提取液中的吩嗪-l-羧酸的浓度为 1.385吗/mL，此次提取的回收率为92.35%。
权利要求
1、一种微量检测吩嗪-1-羧酸的毛细管电泳分析方法，其特征在于在电泳条件下采用内标法或外标法定量分析样品中吩嗪-1-羧酸的浓度，其中内标法测量时将待测样品溶于含有150～250μg/mL吩嗪的甲醇溶液中再进行电泳分析，外标法测量时将待测样品直接溶于甲醇溶液中再进行电泳分析；所述电泳条件为采用内径为50～100μm的石英毛细管柱，长度为30～70cm；分离电压为15～25kV；检测波长230～260nm；柱温23～28℃；缓冲液为5～20mM磷酸缓冲液，pH值6.0～7.0；上样方式为10～20cm高度压差进样60～80s。
全文摘要
本发明涉及一种微量检测吩嗪-1-羧酸的毛细管电泳分析方法，包括内标法和外标法的定量分析。电泳条件为采用内径为50～100μm的石英毛细管柱，长度为30～70cm；分离电压为15～25kV；检测波长230～260nm；柱温23～28℃；缓冲液为5～20mM磷酸缓冲液，pH值6.0～7.0；上样方式为10～20cm高度压差进样60～80s，样品溶解于甲醇或者含有一定浓度内标物的甲醇溶液中。本发明重复性好，简便可行，在检测的同时利用电堆积富集技术对吩嗪-1-羧酸进行了柱内富集，大大降低了方法的检测限，当吩嗪-1-羧酸在0.075～30μg/mL之间，均有较好的线性关系。
文档编号G01N27/447GK101504386SQ200910047478
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月12日 优先权日2009年3月12日
发明者张雪洪, 彭华松, 威 王, 彬 高 申请人:上海交通大学