一种肿瘤标志物afp磁微粒化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种肿瘤标志物甲胎蛋白（AFP）的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法，属于免疫检测分析【技术领域】。异硫氰酸荧光素（FITC）标记的AFP单克隆抗体和碱性磷酸酶（AP）标记的单克隆抗体与抗原结合，形成FITC标记抗体-抗原-AP标记抗体的夹心免疫复合物，类似“三明治”结构。随后加入连有抗FITC抗体的磁性微粒，通过抗FITC抗体与FITC的特异性结合使抗原抗体复合物连接在磁颗粒上，在外加磁场中直接沉淀，不需离心即可将免疫反应形成的复合物与未结合的其它物质分离。本发明试剂盒将化学发光与磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，本发明试剂盒具有更高的灵敏度、线性范围宽、快速等诸多优点，并且大大降低了产品成本，在临床检验等方面具有广阔的应用前景。
【专利说明】一种肿瘤标志物AFP磁微粒化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫检测分析【技术领域】，涉及检测血清中肿瘤标志物AFP含量的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]肿瘤标志物(tumor mark, TM)是指肿瘤细胞分泌或脱落到体液或组织中的物质，或是宿主对体内寄生物反应而产生并进入到体液或组织中的物质。目前临床上常用的肿瘤标志物大多是非特异性标志物，这些标志物在良性肿瘤和正常组织中也有出现，但在肿瘤发生时，其水平明显提高。由于这类标志物没有肿瘤特异性，因此又称为广谱性肿瘤标志物。
[0003]甲胎蛋白(a-Fetoprotein, AFP)是单一多聚体肽键糖蛋白，含590个氨基酸,分子量约为70KD，与血清白蛋白、维生素结合蛋白属同一基因家族。AFP主要在胎肝合成，其次是卵黄囊、胃肠道粘膜，肾脏也少量合成。AFP于胎儿6周开始合成，12-15周达到高峰。出生后1-2年降至成人水平。
[0004]AFP是诊断肝癌灵敏度高和特异性好的肿瘤标志物，是临床诊断原发性肝细胞癌的主要实验室指标，常用于原发性肝癌临床检查及普查。大部分肝癌患者呈持续性高水平升高，部分患者呈低水平增高。AFP的含量与肿瘤的大小、癌细胞的分化程度有一定的关系，其动态变化可用于观察病情进展状态，因而AFP对肝癌有早期诊断价值。检测肝癌患者血清AFP还可作为治疗效果的评价指标。一般急性肝病，可随病情好转AFP含量下降或正常，肝硬化可呈下降或持续低水平，肝癌则逐渐上升。另外，AFP阳性不是肝癌所独有的，其他组织的一些肿瘤，如胃癌、畸胎瘤、胰腺癌、结肠癌等以及妊娠期，甲胎蛋白也可升高。病毒性肝炎、肝硬变时甲胎蛋白也可见到阳性结果。
[0005]化学发光免疫检测技术于上个世纪80年代，继酶联免疫技术和放免技术之后发展起来的新兴技术，相对于后两者化学发光免疫技术具有高灵敏度、高特异性，操作简便、快速，标记结合物稳定，同时无放射性同位素损伤和污染等特点，因此近年来在临床检测分析中被广泛推广使用。
【发明内容】
[0006]本发明需要解决的技术问题在于提供一种AFP定量测定试剂盒及其检测方法，采用该试剂盒进行AFP检测具有较高的灵敏度和特异性，操作更简便，检测时间更短，能够克服现有技术中采用ELISA检测不够灵敏的缺点。
[0007]本发明提供了检测AFP化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括:磁微粒试剂；AFP校准品；AFP质控品；AFP抗试剂；清洗浓缩液；发光底物溶液；样本稀释液。
[0008]所述的磁微粒试剂为连接羊抗FITC抗体的磁微粒溶液；
所述的校准品及质控品为含有一定量AFP抗原的BSA缓冲液； 所述的抗试剂是由碱性磷酸酶(AP)标记的AFP单克隆抗体及异硫氰酸荧光素(FITC)标记的AFP单克隆抗体的混合液；
所述的清洗浓缩液是含有Tris、NaCl和表面活性剂等的缓冲液；
所述的发光底物溶液是含AMPH)发光液的缓冲液；
所述的样本稀释液是含有BSA的溶液。
[0009]本发明所提供的检测AFP的样品前处理方法，包括以下步骤:
1、样品前处理
对临床血清，3000rpm离心5分钟，取上层液即可进行分析测定。待测样品2_8°C存放不得超过48小时，若48小时未检测，应于_20°C以下保存，但不应超过30天。
[0010]2、实验前准备
实验前需将所有试剂放置至室温；准备好一次性平底试管和磁分离器及温育时用于覆盖磁分离器的塑料膜；调节水浴箱温度为37°C;准备化学发光测定仪，并仔细阅读仪器使用说明书。
[0011]3、试剂准备
实验前将试剂盒中各试剂置混匀仪上充分混匀；磁微粒试剂混匀后应为均匀悬浊液，无明显凝集。
[0012]4、利用上述检测AFP的化学发光免疫分析试剂盒检测样品。
[0013]本发明的检测方法如下:
(1)加样与免疫反应:在每一平底试管中加入30μ I AFP校准品(质控品或待测样本)；60 μ I抗试剂，混匀后，37°C温育30分钟；加入30 μ I磁微粒试剂，混匀后，37°C温育5分钟；
(2)洗涤:将平底试管在磁分离器上静置2分钟，然后弧线倾倒上清液，将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干；每管中加入300 μ I清洗液，混匀后，将平底试管在磁分离器上静置2分钟，然后弧线倾倒上清液，将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干；重复两次；
(3)加入发光底物溶液:每个试管加入200μ I发光底物；
(4)读取发光值:用化学发光仪测定每管的发光值；
(5)如遇到高值HOOK样本，为了避免出现高值HOOK效应，建议临床医师根据其余指标选择合适的稀释倍数对样品进行稀释。
[0014]本发明具有以下优点:
1、使用磁珠为固相，使免疫反应更接近液相，反应更充分和迅速，而且使结合的免疫复合物更加容易分离，降低了非特异性吸附。
[0015]2、使用的抗试剂为单克隆抗体混合物，使免疫反应的亲和力更高，而且单抗的生产批间差异相对小，更容易保证产品的批间稳定。
[0016]3、使用化学发光底物溶液，使检测的灵敏度得到了提高，而且线性范围更宽。
[0017]4、本方法的建立可以为其他试剂盒的开发提供一种方便、高灵敏度、准确性和稳定性的免疫检测方法。
[0018]本发明的主要创新之处在于:
1、本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了 一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数。
[0019]2、本发明的检测AFP的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒主要采用直接夹心法定量检测人血清等样品中AFP的含量；对样品的前处理要求低，前处理过程简单，能快速、高通量检测大批样品；采用了高特异的单克隆抗体和超顺磁、高分散、比表面积大的磁微粒子，主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。
[0020]3、本发明的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利，与市场上的酶联免疫试剂盒等相比，线性范围宽，有效避免钩状效应，不需样品稀释，适用于大批量样品筛选的定量。
[0021]
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为本发明的AFP化学发光免疫检测标准曲线，其中，横坐标为AFP的浓度，纵坐标为相对发光强度(RLU)。
[0023]
【具体实施方式】
[0024]实施例1
一、磁珠缓冲液配制操作规程:以配制IL为例:
1、根据配制量，选择合适容器，加入700ml的纯水；
2、称取Tris6.02g, NaN3 0.99g于容器中，混匀，室温搅拌2小时；
3、检测溶液？!1，应在10左右；
4、调制pH值为8.0；
5、量取Tween-202.76ml ;称取硫酸新霉素0.99g ;四环素0.03g ；BSA 4.97g于容器中，搅拌I小时，调pH值至8.0±0.05 ;
6、定容至1L，调pH值至8.0±0.05 ；
7、用0.22um滤器过滤，贮存于4°C。
[0025]二、磁微粒试剂的制备过程
将直径为0.1微米的四氧化三铁微球用戊二醛进行活化，室温混匀4小时后，用
0.01mol/L PBS pH7.4缓冲液清洗三次，并用该溶液进行悬浮，浓度为50-100mg/ml ;然后，每毫升悬液中加入羊抗FITC抗体100 μ g，于37°C混匀温育3-8小时；用等体积的0.01mol/L PBS 5%BSA ρΗ7.4 缓冲液于 37 °C 封闭 40 分钟；最后，用 0.5%BSA 0.02mol/L Tris-HClpH8.0缓冲液清洗三次，并用上述磁珠缓冲液配制一定浓度的工作液。
[0026]实施例2
一、碱性磷酸酶AP与抗AFP单克隆抗体的偶联
5mg/mL的APF单克隆抗体，加入20mmol/L活化剂N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二巯基)丙酸[STOP] 二甲亚砜溶液20 μ L，室温放置45分钟；通过S印hadex G25柱子除去活化剂，收集蛋白峰；每毫升活化的抗体溶液中加入500 μ L 24mg/mL 二硫苏糖醇(DTT)0.01 mol/LPBS pH7.4溶液，混匀后，室温放置30分钟；通过S印hadex G25柱子除去游离的二硫苏糖醇，收集蛋白峰。
[0027]将碱性磷酸酶溶于2mmol/L EDTA 20mmol/L Tris-HCl pH8.0溶液中，浓度 5 mg/mL ；加入0.10mg/mL Traunt试剂(巯基活化试剂)室温放置I小时；通过Sephadex G25柱子除去游离的活化剂，收集蛋白峰。
[0028]将活化的抗体和活化的碱性磷酸酶溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1混合，室温放置4小时，然后使用SuperdeUOO凝胶层析柱分离纯化，收集第一和第二峰，除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶，将连接物保存于4°C。
[0029]使用含0.1%牛血清白蛋白的Tris-HCl缓冲液，pH8.0稀释到1.0ug/mL作为抗体
工作液。
[0030]二、异硫氰酸荧光素FITC与抗AFP单克隆抗体的偶联
FITC分子与AFP单克隆抗体的偶联物是以常见的碱性液标记法对抗体进行标记。
[0031]实施例3
校准品/质控品的配制:
1、最高点:最高浓度点为X，目标点浓度为A，B，C，D，E，F，配制V体积溶液时，需加入原料的体积分别为:表1
【权利要求】
1.一种肿瘤标志物AFP磁微粒化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法，其特征在于:将羊抗FITC抗体与直径为0.1-5微米的磁微粒连接组成固相试剂，经捕捉反应体系中的FITC标记抗体、抗原以及酶标记抗体后形成固相-FITC标记抗体-抗原-酶标记抗体夹心复合物；所述的酶标记抗体中使用的酶是碱性磷酸酶AP ;所述的酶标试剂的偶联方法是将N-琥珀酰胺3- (2-吡啶二巯基)丙酸SPDP活化的抗体与Traunt’ s试剂活化的碱性磷酸酶以1:0.5-2的比例混合，并用凝胶层析柱分离纯化；所使用的底物溶液为环二氧乙烷类衍生物AMPPD。
2.如权利要求1所述的AFP磁微粒化学发光免疫分析试剂盒及其检测方法，其特征在于，该试剂盒包括:磁微粒试剂；AFP校准品；AFP质控品；AFP抗试剂；清洗浓缩液；发光底物溶液；样本稀释液； 所述的磁微粒试剂为连接羊抗FITC抗体的磁微粒溶液； 所述的校准品及质控品为含有一定量AFP抗原的BSA缓冲液； 所述的抗试剂是由碱性磷酸酶AP标记的AFP单克隆抗体及异硫氰酸荧光素FITC标记的AFP单克隆抗体的混合液； 所述的清洗浓缩液是含有Tris、NaCl和表面活性剂等的缓冲液； 所述的发光底物溶液是含AMPH)发光液的缓冲液； 所述的样本稀释液是含有BSA的溶液。
3.如权利要求1-2中任一项所述的试剂盒及其检测方法，其特征在于，所述试剂盒的使用方法如下: (1)加样与免疫反应:在每一平底试管中加入30μ I AFP校准品、质控品或待测样本；60 μ I抗试剂，混匀后，37°C温育30分钟；加入30 μ I磁微粒试剂，混匀后，37°C温育5分钟； (2)洗涤:将平底试管在磁分离器上静置2分钟，然后弧线倾倒上清液，将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干；每管中加入300 μ I清洗液，混匀后，将平底试管在磁分离器上静置2分钟，然后弧线倾倒上清液，将试管及磁分离器一同倒置在吸水纸上拍干；重复两次； (3)加入发光底物溶液:每个试管加入200μ I发光底物； (4)读取发光值:用化学发光仪测定每管的发光值。
4.如权利要求2所述的试剂盒及其检测方法，其特征在于，所述待测样本为高值HOOK样本时，根据需要使用样本稀释液对样本进行稀释。
【文档编号】G01N33/574GK104034892SQ201410282652
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月23日 优先权日:2014年6月23日
【发明者】李永锋, 陈国勇, 傅汝毅, 陶玲云, 蓝文苑 申请人:广西博士海意信息科技有限公司