一种检测喹烯酮的酶联免疫试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测喹烯酮的酶联免疫试剂盒，属于酶联免疫和兽药残留检测领域。本发明所提供的喹烯酮的酶联免疫试剂盒包括喹烯酮特异性抗体、喹烯酮代谢物与载体蛋白的偶联物、和酶标二抗。本发明的检测喹烯酮的酶联免疫试剂盒灵敏、快速、准确，主要用于大批样品的筛查；盒中的主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便，具有高特异性、高灵敏性、高精确性、高准确性等特点，可快速检测饲料及畜产品中残留的喹烯酮。
【专利说明】一种检测喹烯酮的酶联免疫试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于酶联免疫和兽药残留检测领域。具体涉及一种用于检测喹烯酮的酶联免疫试剂盒。
【背景技术】
[0002]喹烯酮(Quinocetone)分子式C18H14N203，属喹噁啉类药物，是中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所研制的畜禽抗菌、止泻、促生长新药，是我国在国际上首创的一类新兽药。该类药物对多种肠道致病菌(特别是革兰氏阴性菌)有抑制作用，可明显降低畜禽腹泻发生率，促进生长并提高饲料转化率。目前包括我国在内的许多国家和地区都广泛用作动物饲料添加剂。喹烯酮在畜牧业上广泛使用的同时，由于畜牧业生产者不熟悉药物的理化性质和药理毒理特点，存在一定的滥用情况，导致畜产品中喹烯酮及其主要代谢产物脱二氧喹烯酮残留超标，对人们的身体健康造成严重的潜在危胁。同时由于动物性产品具有不易储存、易变质等特点，为了保障消费者的身体健康，迫切需要建立一种快速、简便、价廉、灵敏、特异的喹烯酮及其主要代谢产物脱二氧喹烯酮的筛选方法。
[0003]现有的喹烯酮检测方法多为色谱法，但是这些方法的灵敏度受样品的净化、浓缩等步骤的影响较大；再者这些方法需要复杂的仪器，且过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。基于抗原抗体免疫反应的免疫学检测技术为小分子残留物的分析检测提供了一个新的途径。该技术研究的关键是半抗原分子的设计、合成和人工全抗原及抗体的制备。因为喹烯酮是小分子化合物，本身没有免疫原性，必须将其与大分子载体蛋白偶联得到具有免疫原性的人工抗原。
【发明内容】
[0004]本领域技术人员所知，喹恶啉类药物中残留标示物为3-甲基-喹恶啉-2-羧酸(MQCA)，喹烯酮拥有与喹乙醇相同的结构母核和相似的体内代谢途径，并且MQCA也是在饲喂过喹烯酮的动物组织中可以检出的、残留时间最长的代谢物。因此，本发明使用MQCA作为免疫半抗原来制备免疫原，进而用于检测反应组织内喹烯酮的含量。
[0005]本发明的目的在于提供一种快速检测喹烯酮的酶联免疫试剂盒。
[0006]本发明提供了一种快速检测喹烯酮的酶联免疫试剂盒，该试剂盒包括:喹烯酮特异性抗体、3-甲基-喹恶啉-2-羧酸(MQCA)-载体蛋白偶联物和酶标二抗。其中喹烯酮特异性抗体为兔抗喹烯酮的多克隆抗体，可用喹烯酮代谢物3-甲基-喹恶啉-2-羧酸(MQCA)与载体蛋白偶联物作为免疫原通过免疫动物(例如兔)制得。所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或钥孔铜兰蛋白(KLH)。所述的MQCA-载体蛋白偶联物采用化学方法偶联得到。所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶，所述酶标二抗可以用商品化的辣根过氧化物酶酶标二抗，也可以通过过碘酸钠法或戊二醛法将辣根过氧化物酶与二抗偶联制得。在本发明的一个优选实施方案中，所述酶标二抗为羊抗兔IgG抗体。用于制备所述酶标板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。载体的形式是微量反应板凹孔。
[0007]为方便现场检测和大量样本筛查，所述试剂盒还可以进一步包括MQCA-载体蛋白偶联物抗原或羊抗兔抗抗体(二抗包被)的酶标板、喹烯酮标准溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液和浓缩样品稀释液。
[0008]所述的洗涤液为0.05% -0.5%吐温-20磷酸盐缓冲液。所述的显色剂由显色剂A液和显色剂B液组成(例如，体积比为1:1)，显色剂A液为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B液为四甲基联苯胺或邻苯二胺或四甲基联苯胺。所述的浓缩样品稀释液为含0.1 %吐温-20的磷酸盐缓冲液。
[0009]另一方面，本发明还提供了一种检测样品中喹烯酮含量的方法，包括步骤:
(1)样品前处理；
(2)向包被有喹烯酮抗原的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入抗喹烯酮多克隆抗体，孵育后洗涤拍干，加入酶标记二抗，孵育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；
(3)分析检测结果。
[0010]本发明试剂盒的检测原理为:
将喹烯酮抗原吸附于固相载体上，加入样本或喹烯酮标准品溶液并加入喹烯酮抗体工作液，待测样品中喹烯酮和固相载体上包被的喹烯酮抗原竞争喹烯酮抗体，再加入酶标记抗抗体进行酶活性的放大作用，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中喹烯酮的量呈负相关，与标准曲线比较即可得出喹烯酮浓度范围。
[0011]有益效果:
本发明检测喹烯酮的试剂盒主要采用间接竞争酶联免疫测定法定性或定量样品中喹烯酮含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。
[0012]本发明该试剂盒采用高特异性的喹烯酮多克隆抗体，主要试剂以工作液形式提供，可以减少试剂盒的操作步骤，为使用者节省时间并降低因操作步骤冗繁造成的误差，本发明具有灵敏度高、特异性强、高精确度、高准确度、对仪器设备要求低、试剂保存时间长、自动化程度高、无放射性同位素污染的等优点，可在饲料及动物源性产品检测中发挥重要作用。
[0013]【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1-2，为喹烯酮酶联免疫检测试剂盒结构图。
[0015]图中1，试剂盒盒体；2，包被了喹乙醇抗原或抗喹烯酮特异性抗体的酶标板；3，系列标准溶液；4，为显色剂A ; , 5,为显色剂B ；6,为抗体溶液-J，为酶标二抗溶液；8，为酶标二抗稀释液；9，为浓缩洗涤液；10，为浓缩样品稀释液；11，为试剂瓶架。
[0016]【具体实施方式】
[0017]提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。[0018]实施例1免疫原的合成及免疫血清的制备 喹烯酮的代谢产物免疫原的制备
本领域技术人员所知，喹恶啉类药物中残留标示物为3-甲基-喹恶啉-2-羧酸(MQCA)，喹烯酮拥有与喹乙醇相同的结构母核和相似的体内代谢途径，并且MQCA也是在饲喂过喹烯酮的动物组织中可以检出的、残留时间最长的代谢物。因此，本发明使用MQCA作为免疫半抗原来制备免疫原，进而用于检测反应组织内喹烯酮的含量。可以采用本领域常规的方法合成MQCA-BSA作为免疫原，相关的合成方法有重氮偶联法、碳二亚胺法等。
[0019]免疫及特异性抗体的制备。
[0020]将喹烯酮-BSA偶联物用生理盐水稀释成lmg/ml溶液备用。选取6只体重2~
2.5Kg健康雄性新西兰大白兔。将偶联物与等量弗氏完全佐剂通过注射器对抽法混合成油包水的乳浊液，按lmg/Kg体重的量进行首次免疫，采取背部皮下多点注射。每隔两周加强免疫一次，用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，剂量及方法同首次免疫。从第三次免疫开始，每次免疫后10天，耳缘静脉取血1ml，进行抗体效价检测，当抗体效价不再升高时，不加佐剂进行最后一次(第7次)免疫，大腿肌肉注射，7天后颈动脉放血，室温凝固2h后4°C过夜，8000r/min离心10分钟，除去血块，血清部分用50 %饱和硫酸铵溶液沉淀，离心去上清液，沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，再用33%饱和硫酸铵溶液沉淀两次，沉淀物用尽可能少的磷酸缓冲液溶解，经透析后用S印hadexG-25M层析，即得多克隆抗体。
[0021]实施例2免疫检测方法的建立
2.1 ELISA方法确定 最佳包被浓度
将 1000 μ g/ml、100 μ g/ml、10 μ g/ml、5 μ g/ml、I μ g/ml、0.25 μ g/ml 系列浓度的卵清蛋白(OVA)-MQCA偶联物按每孔100 μ I包被酶标板，4°C包被24h，洗涤5次，拍干，按每孔200μ I封闭液4°C下封闭12h，洗涤3次，拍干。加入1: 500稀释的抗血清100 μ 1，室温作用2h，洗涤三次，立即加入100 μ I酶标羊抗兔抗体，室温作用30min，洗涤三次，加100 μ I底物液，室温避光作用15π?η，50μ I终止液终止反应，酶标仪检测A值(450nm)。同时设置空白对照孔(不加抗血清，只加其稀释液)和平行重复孔，取OD值为1.0左右时的包被浓度为最佳浓度。
【权利要求】
1.一种检测喹烯酮的酶联免疫试剂盒，其中包括:喹烯酮特异性抗体、3-甲基-喹恶啉-2-羧酸(MQCA)-载体蛋白偶联物和酶标二抗。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括包被了3-甲基-喹恶啉-2-羧酸(MQCA)-载体蛋白偶联物或羊抗兔抗体、喹烯酮标准溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液和浓缩样品稀释液。
3.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于:所述喹烯酮特异性抗体为以3-甲基-喹恶啉-2-羧酸(MQCA)-载体蛋白偶联物为免疫原制备的多克隆抗体。
4.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于:所述的载体蛋白为牛血清白 蛋白、卵清蛋白或钥孔铜兰蛋白(KLH)。
5.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于:所述的酶标二抗的酶为辣根过氧化物酶。
6.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于:所述的酶标二抗为羊抗兔IgG 抗体。
7.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于:所述的洗涤液为含有0.05% -0.5% 吐温-20磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于:所述的显色剂由显色剂A和显色 剂B组成，显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺。
9.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于:所述的浓缩样品稀释液为含0.1% 吐温-20的磷酸盐缓冲液。
10.一种检测样品中喹烯酮含量的方法，包括步骤: (1)样品前处理； (2)用权利要求1-9任一所述的试剂盒进行检测，向包被有3-甲基-喹恶啉-2-羧酸(MQCA)-载体蛋白偶联物的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入抗喹烯酮多克隆抗体，孵育后洗涤拍干，加入酶标记二抗，孵育后洗涤拍干，显色、终上，用酶标仪测定吸光度值； (3)分析检测结果。
【文档编号】G01N33/558GK104034888SQ201410282655
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月23日 优先权日:2014年6月23日
【发明者】李永锋, 陈国勇, 傅汝毅, 陶玲云, 蓝文苑 申请人:广西博士海意信息科技有限公司