一种毛细管电泳检测凝血酶与g-四链体结合速率的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种毛细管电泳检测凝血酶与G-四链体结合速率的方法。
【背景技术】
[0002 ]检测凝血酶的常用方法有荧光法、发色底物法和Ral e i gh光散射法等，但这些方法操作繁琐、耗费的样品多，在微量样品的检测方面有很大的局限性。
[0003]荧光染料是一种可吸收紫外线或可见光并将其由短波长转化为较长波长的可见光并反射出来，可用肉眼看见其反射出来的明亮色彩。荧光染料由于其灵敏度高，操作方便，逐渐取代了放射性同位素作为检测标记，其广泛应用于荧光探针，细胞染色，特异性DNA染色等。
[0004]另一方面，毛细管电泳作为一种快速有效、高灵敏、低样品消耗的微分离技术，在生物分析领域具有广阔的应用前景。同时，通过将荧光检测与毛细管电泳相结合，大大提高了检测限，拓展了毛细管的应用。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是:现有技术中尚无良好的简单便捷检测凝血酶与G-四链体结合速率的方法。
[0006]为解决上述技术问题，本方法通过凝血酶与生物探针FAM-F29形成的G-四链体相互作用，利用毛细管电泳的方法分析检测，并计算复合物的峰面积在毛细管电泳中所占的电泳峰面积之比，绘制峰面积之比与时间的曲线，从而实现凝血酶与G-四链体结合速率的检测。
[0007]本方法所采用的技术方案为，一种毛细管电泳检测凝血酶与G-四链体结合速率的方法，步骤如下:
[0008](I)选取带有荧光染料的DNA序列FAM-F29 ；
[0009](2)将步骤(I)所述的FAM-F29在一定浓度的Na+、K+盐溶液中反应24小时，得到含有G -四链体结构的DNA荧光探针溶液；
[0010](3)将粉末状的凝血酶溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，稀释成不同浓度的凝血酶溶液；
[0011](4)将步骤(2)所述的G-四链体结构的DNA荧光探针溶液与等体积的步骤(3)所述的凝血酶溶液混合，得到凝血酶与G-四链体结构的DNA荧光探针复合物；
[0012](5)荧光毛细管电泳检测:将步骤(4)所述的复合物用荧光毛细管电泳检测，测定复合物通过检测通道峰面积与总的DNA通过检测通道的峰值面积之比，进行线性拟合，绘制峰面积比一时间的标准曲线，来检测凝血酶与G-四链体的结合速率。
[0013]作为优选，步骤(I)所述的荧光染料为6-FAM，5-FAM，TMRA，ΑΤΤ0-590中的一种。
[0014]进一步地，步骤(2)所述的在形成G-四链体结构中所用的Na+、K+的浓度均为5mM。
[0015]更进一步地，步骤(2)所述荧光探针中DNA序列为5’-AGT CCG TGG TAG GGC AGGTTA GGG TGA CT_3，。
[0016]本发明所取得的有益效果是，本发明提供的可用于检测凝血酶与G-四链体相互作用的方法，操作简单，可重复性高，进一步拓展了荧光探针在生物分析领域的应用。
【附图说明】
[0017]图1:凝血酶与G-四链体结构的DNA荧光探针(摩尔比10:1)不同混合时间后的电泳图(A:复合物的峰;B:未结合凝血酶的G-四链体结构的DNA荧光探针的电泳峰;a:G-四链体结构的DNA荧光探针，b-h:G-四链体结构的DNA荧光探针与凝血酶混合不同的时间的复合物)
[0018]图2:凝血酶与G-四链体结构的DNA荧光探针摩尔比为10:1，复合物的峰面积与总的峰面积比与时间的关系曲线。
【具体实施方式】
[0019]本发明将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为对本发明实施的限制。
[0020]实施例1
[0021]1、G_四链体结构的形成
[0022]将购买的FAM-F29先用8000rpm离心机离心2-3min，加入pH为7.4，浓度为50111]\1Tris-Hcl缓冲溶液35yL，使其浓度为ΙΟΟμΜ，然后用TBE缓冲溶液稀释到所需的浓度，取2yL稀释后的FAM-F29溶液，加入等体积的NaCl溶液，反应12小时，随后在上述混合溶液中加入4yL的KCl溶液，反应12小时，确保G-四链体结构的DNA荧光探针溶液的最终浓度为2yM，NaCl的最终浓度为5mM，KCl的最终浓度为5mM。
[0023]2、称取粉末状的凝血酶1.2mg，溶解于32yL，浓度为50mM，pH为7.4的Tris_HCl缓冲溶液中，得到浓度为ΙΟμΜ的凝血酶溶液，然后根据需要稀释成不同浓度。
[0024]3、取一定体积的上述G-四链体结构的DNA荧光探针与等体积的凝血酶(20μΜ)混合，凝血酶与G-四链体结构的DNA荧光探针的比例为10:1 (摩尔比)，在37°C恒温水浴下混合不同时间，得到凝血酶与G-四链体结构的DNA荧光探针复合物。
[0025]4、荧光毛细管电泳检测
[0026]所用的毛细管采用内径75μπι，全长60cm，有效长度35cm的石英毛细管，通过18kV的高压电源使待测样品及缓冲液在毛细管内流动。将步骤(3)所述混合液用荧光毛细管电泳检测。在一定时间范围内，随着时间的增加，复合物的峰面积逐渐增加(图1)。计算复合物与总峰面积(S_P1(3X与STotal )，计算峰面积比(Scomplex/STotal )(图2 )，进行线性拟合，得到的标准方程为y = 0.00263x+0.0229，发现反应时间在3min内，凝血酶与G-四链体复合物逐渐增加，3min之后基本保持不变。结果表明，在前3min内，每秒钟有0.26 %的复合物的产生。
[0027]方程式中，X为时间,ySScomplex/STotal;
[0028]实施例2
[0029]FAM-F29用荧光染料ATT0-590标记，其他步骤同实施例1。
[0030]结果表明，在前3min内，每秒钟有0.28%的复合物的产生。
[0031]以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术范围。
【主权项】
1.一种毛细管电泳检测凝血酶与G-四链体结合速率的方法，其特征在于:所述检测步骤如下: (1)选取带有荧光染料的DNA序列FAM-F29; (2)将步骤(I)所述的FAM-F29在5mM浓度的Na+、K+盐溶液中反应24小时，得到含有G-四链体结构的DNA荧光探针溶液； (3)将粉末状的凝血酶溶解于Tris-HCl缓冲溶液中，稀释成不同浓度的凝血酶溶液； (4)将步骤(2)所述的G-四链体结构的DNA荧光探针溶液与步骤(3)所述的凝血酶溶液混合，得到凝血酶与G-四链体结构的DNA荧光探针复合物； (5)荧光毛细管电泳检测:将步骤(4)所述的复合物用荧光毛细管电泳检测，测定混合物通过检测通道峰面积与总的DNA通过检测通道的峰值面积之比，进行线性拟合，绘制峰面积比一时间的标准曲线，对照标准曲线计算凝血酶与G-四链体结合的速率。2.如权利要求1所述的一种毛细管电泳检测凝血酶与G-四链体结合速率的方法，其特征在于:步骤(I)所述的荧光染料为6-FAM，5-FAM，TAMRA，ATT0-590中的一种。3.如权利要求1所述的一种毛细管电泳检测凝血酶与G-四链体结合速率的方法，其特征在于:步骤(I)所述的荧光染料中DNA序列为5’-AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTA GGG TGACT-3，。
【专利摘要】本发明属于生物分析技术领域，涉及一种毛细管电泳检测凝血酶与G‐四链体结合速率的方法，步骤如下：(1)设计5’端偶联荧光染料的DNA，形成含有G‐四链体结构的DNA荧光探针；(2)将G-四链体结构的DNA荧光探针与凝血酶混合，经荧光毛细管电泳检测，计算峰面积比(Scomplex/STotal)，得到峰面积比—时间标准曲线，得到凝血酶与G‐四链体复合物随时间变化的关系。本发明提供的毛细管电泳检测凝血酶与G‐四链体结合速率的方法，操作简单，可重复性高，能方便快捷的检测出凝血酶与G‐四链体的结合速率，进一步拓展了DNA荧光探针在生物分析领域的应用。
【IPC分类】G01N27/447, G01N21/64
【公开号】CN105548322
【申请号】CN201610058746
【发明人】王建浩, 顾亚琴, 柳丽, 丁淑敏, 付敏丽, 樊杰, 程永江, 邱琳, 蒋鹏举
【申请人】常州大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月28日