基于目标物诱导的邻近结合构建荧光信号扩增生物传感平台检测腺苷的方法
【专利摘要】本发明公开了一种双功能探针，包含：用于特异性识别腺苷的两段腺苷适体；用于为切刻酶提供酶切位点；用于为切刻/聚合反应提供模板的聚合/切刻模板和用于连接所述的两段腺苷适体的辅助碱基；本发明还公开了一种检测腺苷的试剂以及检测方法。可以实现免标记高灵敏检测腺苷，方法的检测限为8.4×10?8mol·L?1，达到人尿样中腺苷含量检测要求，具有检测人尿样中腺苷含量的潜力和潜在的实际应用价值。
【专利说明】
基于目标物诱导的邻近结合构建黄光信号扩増生物传感平台 检测腺昔的方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种W目标物诱导的邻近结合为基础的巧光信号扩增生物传感平台 用于免标记灵敏检测腺巧的方法。
【背景技术】
[0002] 腺巧(AD)是一种内源性核巧，能够调节中枢神经系统、周围神经系统和免疫系统 的正常运行，是美国食品药品管理局(抑A)批准的治疗阵发性室上性屯、动过速(PSVT)药物。 此外，腺巧的表达水平与肿瘤的发生、发展阶段具有密切关系，是肿瘤的潜在生物标志物。 因此，定量检测腺巧在疾病的早期诊断和临床治疗方面具有重要意义。
[0003] 传统的腺巧检测方法，如放射性免疫法、毛细管电泳法和高效液相色谱法，已经用 于腺巧的检测。然而，运些检测方法存在不同程度的局限性，例如，放射性免疫法须进行放 射性标记，危害健康、污染环境;毛细管电泳法需要复杂的样品预处理，且检测结果重现性 差、灵敏度低；高效液相色谱法需要大量样品。因此，需要构建新的简便、安全、高灵敏度和 重现性好的腺巧定量检测策略。其中，基于适体的巧光法成为一种有效的腺巧检测方法。
[0004] 目前基于适体与腺巧的选择性结合来检测腺巧的相关研究主要有:Liu课题组和 Wang课题组分别设计了阻滞型探针，通过腺巧取代下与适体结合的阻滞链，引发扩增反应 得到可检测的巧光信号，进行腺巧的检测。然而，在此种结合作用中，阻滞链和目标物与适 体链之间存在竞争，不利于目标物的有效结合。Yu课题组设计了分裂型探针用于腺巧的检 测，该方法将腺巧适体分为两部分，分别设计在两个探针中，腺巧能够使分裂的适体相互靠 近，使探针形成复合双链结构，引发聚合酶辅助的信号扩增，在插入染料后得到巧光信号。 然而，在此种结合方式中，分裂的适体各自游离在溶液中，局部浓度低，不利于有效结合腺 巧，进而影响检测效果。
[0005] 因此，亟需设计适体局部浓度高的新型探针构建巧光生物传感平台用于腺巧的检 测。
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种基于目标物诱导的邻 近结合构建巧光信号扩增生物传感平台检测腺巧的方法，该方法可W实现免标记高灵敏检 测腺巧，方法的检测限为8.4Xl(T8mol . [1，达到人尿样中腺巧含量检测要求，具有检测人 尿样中腺巧含量的潜力和潜在的实际应用价值。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[000引本发明的第一方面，提供一种双功能探针(di-probe )，包含：
[0009]两段腺巧适体，所述腺巧适体用于特异性识别腺巧，当体系中不存在腺巧时，两段 腺巧适体不能结合，不会引发后续的扩增反应;而当体系中存在腺巧时，腺巧能够与其适体 特异性结合，引起适体的邻近结合，进而引发聚合/切刻反应；
[0010] 切刻识别位点，所述切刻识别位点用于为切刻酶提供酶切位点；
[0011] 聚合/切刻模板，所述聚合/切刻模板用于为聚合/切刻反应提供模板；
[0012] 辅助碱基，所述辅助碱基用于连接所述的两段腺巧适体。
[0013] 所述双功能探针的核巧酸序列为W下之一：
[0014] (l)SEQ ID N0.1所示的核巧酸序列；或
[0015] (2)与SEQ ID No. 1所示的核巧酸序列具有90% W上同源性且功能相同的核巧酸 序列。
[0016] 优选的，所述双功能探针的核巧酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
[0017] GGG AGT TGA GTG CTG AGG ATG CGG AGG AAG GT TTT TT AC CTG GGG GAG TAT (沈Q ID NO.l);
[0018] 其中，正常字体为聚合/切刻模板，斜体为切刻识别位点，加粗为两段腺巧适体，斜 体加粗为辅助碱基。
[0019] 上述双功能探针在检测腺巧中的应用也是本发明的保护范围。
[0020] 本发明的第二方面，提供一种检测腺巧的试剂，包括：
[0021] 上述双功能探针、聚合酶、连接酶、切刻酶、锁式探针(pad-probe)和化T染料；
[0022] 所述锁式探针的核巧酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：
[0023] pad-probe：AGT GCT GAG GAA ACC CAA CCC GCC CTA CCC GCT GAG GAA ACC CAA CCC GCC CTA CCC GCT GAG GGA GTT G(沈Q ID N0.2)。
[0024] 所述切刻酶为化.BbvCI切刻酶。
[0025] 所述聚合酶为KF聚合酶和化i29聚合酶。
[00%] 所述连接酶为T4DNA连接酶。
[0027] 本发明的第=方面，提供一种检测腺巧的方法，步骤如下：
[0028] (1)制备不同浓度的腺巧，加入双功能探针，恒溫解育；使腺巧与双功能探针中的 适体充分结合，引起探针的杂交。
[0029] (2)向步骤（1)反应后的溶液中加入KF聚合酶和化.BbvCI切刻酶，构建聚合/切刻 反应体系，进行聚合/切刻反应，产生引物序列；
[0030] (3)向步骤(2)反应后的溶液中加入pad-probe、T4DNA连接酶，进行连接反应，再加 入化i29聚合酶和化.BbvCI切刻酶，进行指数型滚环扩增；
[0031] (4)向步骤(3)反应后的溶液中加入化T染料，解育，检测巧光强度，构建巧光强度 与腺巧浓度之间的线性方程，对待测样品，可通过测定样品的巧光强度，代入线性方程，计 算样品的腺巧浓度。
[0032] 步骤(1)中，所述恒溫解育的条件为:37°C恒溫解育120min。
[0033] 步骤(2)中，进行聚合/切刻反应体系的组成包括：10 XCutSmaパ缓冲液、dNTPs溶 液、KF聚合酶、Nt.抓vCI切刻酶和纯水。
[0034] 在本发明的一个【具体实施方式】中，所述聚合/切刻反应体系为：向lOiiL的双功能探 针与适体结合后的溶液中加入2.化L 10XCutSmaパ缓冲液、3.0化dNTPs溶液、0.2化L KF 聚合酶、0.2化L化.BbvCI切刻酶和4.化L纯水，组成20化体系。
[0035] 步骤(2)中，聚合/切刻反应的条件为:将聚合/切刻反应体系置于37°C恒溫箱中解 育30min;解育完成后置于干式恒溫器中，保持85°C加热25min，使聚合/切刻反应停止。
[0036] 步骤(3)中，进行指数型滚环扩增的条件为：向聚合/切刻反应后的溶液中加入T4 连接酶缓冲液、pad-probe、T4DNA连接酶和纯水，37°C恒溫解育60min;再加入lOXCutSmad 缓冲液、dNTPs溶液、Phi29聚合酶、Nt.抓vCI切刻酶和纯水，37°C恒溫解育ISOmin;反应完成 后置于干式恒溫器中，保持75°C加热25min，终止指数型滚环扩增反应。
[0037] 在本发明的一个【具体实施方式】中，进行指数型滚环扩增的具体条件为：向聚合/切 刻反应后的溶液中加入3.0化10XT4连接酶缓冲液、2.0化2.0Xl〇-5mol -L-i的pad- probe、0.3化L T4 DNA连接酶和4.化L纯水，组成30化体系，将样品置于37°C恒溫箱中解育 60min。后继续向样品中加入2.0化10XCutSmaパ缓冲液、5.0化dNTPs溶液、0.30化Phi29 聚合酶、0.4化L化.BbvCI切刻酶和2.化L纯水，组成40化体系，将样品置于37°C恒溫箱中解 育ISOmin。后将反应完成的各样品置于干式恒溫器中，保持75°C加热25min，终止指数型滚 环扩增反应。
[0038] 步骤(4)中，巧光强度检测的光谱条件为:激发波长为425nm，电压为700V，狭缝宽 度均为5. Onm，发射光谱记录范围为450~600nm，选择495nm处巧光发射强度为衡量标准。
[0039] 步骤（4)中，构建的巧光强度与腺巧浓度之间的线性方程为：F-F0 = 77.84C+ 12.98，相关系数R = 0.998。其中，F为含有腺巧待测样品的巧光强度，Fo为相同实验条件下 不含腺巧样品的巧光强度，C为样品中的腺巧浓度，mol ? [1。
[0040] 上述线性方程的线性范围为5.0Xl〇-7mol ? [1到2.0Xl0-5mol ? [1。
[0041] 本发明的基于目标物诱导的邻近结合构建巧光信号扩增生物传感平台检测腺巧 的原理为：
[0042] 本发明利用腺巧适体能够与腺巧选择性结合的性质，设计了一种双功能探针(di? probe) ，该双功能探针包含两段腺巧适体、切刻识别位点 、聚合 / 切刻模板和辅助碱基； 其 中，腺巧适体用于特异性识别腺巧，当腺巧与其适体结合后，能够引起适体的邻近结合，进 而引发聚合/切刻反应，产生大量的引物序列；产生的引物序列能够与加入的pad-probe部 分杂交，在连接酶和聚合酶的作用下，进行滚环扩增反应，获得的扩增产物又能够与pad- probe 部分杂交，在切刻酶的作用下 ，产生更多的引物序列 （引物序列与聚合模板互补 ），与 pad-probe部分杂交，如此循环，完成指数型滚环扩增。扩增后产物含有G-四倍体序列，在加 入化T染料后，能得到增强的巧光信号，因此，实现了目标物诱导的邻近结合引发巧光信号 扩增用于免标记灵敏检测腺巧。当体系中不含有腺巧时，di-probe不能结合，也就不会引发 后续的扩增反应。其检测的原理图具体如图1所示。
[0043] 本发明的关键在于设计的di-probe对体系中是否含有腺巧的区分能力，即当且仅 当腺巧存在时，di-probe才能发生结合反应。发明人发明人就di-probe中3'端与模板序列 互补的碱基个数对体系的检测效果的影响进行了考察，得到了对腺巧检测效果最优的双功 能探针，如SEQ ID N0.1所示。
[0044] 本发明的有益效果：
[0045] (1)本发明的双功能探针能够对腺巧进行特异性结合，无需进行标记，可用于体系 中腺巧的检测。
[0046] (2)本发明的检测方法可W实现免标记高灵敏检测腺巧，方法的检测限为8.4X icrVoi ? [1，达到人尿样中腺巧含量检测要求，具有检测人尿样中腺巧含量的潜力和潜在 的实际应用价值。
【附图说明】
[0047] 图1:目标物诱导的邻近结合构建巧光信号扩增生物传感平台用于灵敏检测腺巧 原理图；
[0048] 图2:di-probe的3'端与模板序列互补碱基个数对体系相对巧光强度的影响；
[0049] 图3:不同情况下巧光生物传感平台用于检测腺巧的巧光光谱；
[0050] 图4:A不同腺巧浓度下双功能探针体系的巧光发射光谱;B体系相对巧光强度与相 应腺巧浓度之间的线性关系；
[0051] 图5:目标物诱导的邻近结合巧光信号扩增传感平台对腺巧检测的选择性考察结 果。
【具体实施方式】
[0052] 结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本 发明，并不对其内容进行限定。
[0053] 实验试剂和仪器：
[0054] 本发明实施例中所用到的实验试剂和仪器如下：
[0化5]腺巧（Adenosine，>99% )购自 Sigma-Aldrich(上海，中国），胞巧（C}ftidine，〉 98%)、尿巧(化1山116，〉98%)、鸟巧(611311〇31116，〉98%)、尿素和(1肿?3均购自生工生物科技 有限公司（上海，中国）dKF聚合酶化lenow片段，3'-5'ex〇-)、切刻酶(Nt.mDvCI)和T4连接酶 均购自化 W Elngland Biolabs(北京，中国），F*hi29 聚合酶购自I'hermo Fisher Scientific (上海，中国）。化T购自Abeam(上海，中国）。混合纤维树醋微孔滤膜(孔径0.22皿)购于兴亚 净化材料厂(上海，中国）。实验所用其他药品和试剂(均为分析纯)购自标准供应商。所有溶 液均由超纯水(>18.25MQ ? cm)配制。实验中所用核酸链由生工生物工程股份有限公司（上 海，中国）合成和纯化。
[0056]实验中所需缓冲液组成如下：
[0化7] KC1 溶液：2M KC1。
[0化引 TE缓冲液：10mM Tris-HCl，lmM 邸TA，pH 8.0。
[0059] Cut smad缓冲液：20mM Tris-Ac，50mM KAc，10mM(Ac)2Mg，pH 7.9。
[0060] T4连接酶缓冲液：50mM Tris-肥l，10mM MgCl2，10mM DTT，lmM ATP，pH 7.5。
[0061 ]巧光测量使用日立F-7000巧光光谱仪进行测定（日本，日立公司）。
[0062] 实施例1:双功能探针(di-probe)的优化设计
[0063] 表1:
[0064]
[0065] 本发明的关键点在于di-probe对体系中是否含有腺巧的区分能力，即当且仅当腺 巧存在时di-probe发生结合反应，因此，di-probe中3 '端与模板序列互补的碱基个数对体 系的检测效果有重要影响。鉴于W上理论分析，设计四种3'端与模板序列互补的碱基个数 不同的探针(具体如表1所示），比较不同探针对体系相对巧光强度的影响，用于考察得到具 有最佳效果的探针序列，结果如图2所示。
[0066] 由图2可W看出，随着3'端与模板序列互补的碱基个数的增加，阴性体系（未含有 腺巧体系）的巧光强度增加，说明互补碱基数增加使得di-probe探针自身结合作用增加，进 而引发后续扩增反应。比较阳性体系（含有腺巧体系）结果，当3'端与模板序列互补的碱基 个数为加寸，阳性体系的巧光强度几乎与阴性体系的巧光强度相当，运是由于3'端碱基不能 与模板序列形成严格的双链结构，无法引发聚合反应，进行信号扩增；当3'端与模板序列互 补的碱基个数为1时，阳性体系的巧光强度显著增加，当互补碱基个数继续增加时，阳性体 系的巧光强度几乎不变。考虑到上述情况，W体系相对强光强度来衡量实验结果，3'端与模 板序列互补的碱基个数为1时，测得体系相对巧光强度最大。因此，选择di-probel作为最优 的双功能探针，并用于后续的实验研究。
[0067] 实施例2:基于目标物诱导的邻近结合构建巧光信号扩增生物传感平台检测腺巧 [006引具体方法如下；
[0069] (l)DNA探针的制备
[0070] 将实施例1优化得到的双功能探针委托生工生物工程股份有限公司（上海，中国） 合成和纯化，将合成纯化后的干粉离屯、（12,00化9111/111111，1111111)，并按说明书用16缓冲液稀 释，按所需浓度和体积分装，置于-20°C冰箱中保存。取适量的di-probe稀释，满旋混匀。将 制备好的溶液置于干式恒溫器中，95°C保持5min，后自然冷却至室溫，放入4 °C冰箱中保存 至少化，备用。
[0071] (2)腺巧的结合反应
[0072] 向体系中加入制备好的探针di-probe和不同浓度的腺巧，震荡lOmin，37 °C恒溫解 育120min，使腺巧与di-probe中的适体充分结合且引发di-probe的邻近结合。
[0073] (3)聚合/切刻反应
[0074] 向上述样品溶液中加入2.0化10XCutSmaパ缓冲液、3.0化dNTPs溶液、0.20化 KF聚合酶、0.2化L化.BbvCI切刻酶和4.化L纯水，组成20化体系，将样品置于37°C恒溫箱中 解育30min。后将反应完成的各样品置于干式恒溫器中，保持85°C加热25min，使聚合/切刻 反应停止。
[0075] (4)指数型滚环扩增反应
[0076] 向上述样品溶液中加入3.化L 10 X T4连接酶缓冲液、2.0化的pad-probe、0.30化 T4DNA连接酶和4.化L纯水，组成30化体系，将样品置于37 °C恒溫箱中解育60min。后继续向 样品中加入2.0化lOXCutSmart缓冲液、5.0化dNTPs溶液、0.30化Phi29聚合酶、0.40化 化.BbvCI切刻酶和2.3化纯水，组成40化体系，将样品置于37°C恒溫箱中解育ISOmin。后将 反应完成的各样品置于干式恒溫器中，保持75°C加热25min，终止指数型滚环扩增反应。
[0077] (5)巧光测定实验
[007引向上述反应液中加入10化的KC1溶液、1扣L的ThT染料溶液和若干纯水，37 °C解育 50min，用于输出巧光信号。利用F-7000巧光光谱仪记录实验结果，测定的光谱条件为:激发 波长为425加1，电压为700V，狭缝宽度均为5.0加1，发射光谱记录范围为450~600加1，选择 495nm处巧光发射强度为衡量标准，所有的实验均重复=次。阴性控制实验所加试剂与阳性 相同，但不加入腺巧。构建巧光强度与腺巧浓度之间的线性方程，对待测样品，可通过测定 样品的巧光强度，代入线性方程，计算待测样品的腺巧浓度。
[0079] 实施例3:本发明的检测方法的可行性研究
[0080] 为了验证本发明的检测方法的可行性和扩增能力，考察了不同情况下反应体系的 巧光发射光谱。结果如图3所示，当体系中仅含有化T染料时（曲线a)，几乎无明显巧光信号， 说明化T具有较低的自身背景。当体系中含有di-probe或pad-probe时（曲线b和曲线C)，体 系的巧光强度略有增加，可能是由于化T染料与di-probe或pad-probe中的G碱基相互作用， 产生巧光信号。在阴性条件下，巧光强度约为205(曲线d)，表明当目标物不存在时，分裂在 di-probe中的腺巧适体无法结合引发后续的聚合/切刻和指数型滚环扩增反应，无明显巧 光信号。当目标物存在时，巧光强度显著增加（曲线e)，运是由于di-probe中的腺巧适体与 腺巧选择性结合，进而引发后续的聚合/切刻和指数型滚环扩增反应，得到大量的G-四倍体 序列，在加入染料化T后获得明显的巧光信号。实验结果表明，本发明构建的生物传感平台 对腺巧具有良好的响应。
[0081] 实施例4:本发明的检测方法的灵敏度考察
[0082] 在选择的最适实验条件下，考察了不同浓度腺巧存在时体系巧光强度，并进一步 处理、计算得出本方法的灵敏度。不同浓度腺巧存在下的体系巧光光谱，如图4A所示，曲线a 至化分别是腺巧浓度为〇、5.0Xl〇-V)l ? L-i、1.0Xl〇-6mol ? L-i、2.5Xl〇-6mol ? L-i、5.0X l〇-6mol ? L-i、1.0Xl〇-5mol ? L-i、1.5Xl〇-5mol ? [1 和2.0Xl0-5mol ? L-i的巧光光谱。从图 中看出，随着体系中腺巧浓度的增加，巧光强度逐渐增加。图4B为体系相对巧光强度与相应 腺巧浓度之间的线性关系。由图可知，在腺巧浓度为5.0Xl(T7mol ? 1/1到2.0Xl(T5mol ? [1 的范围内，体系相对巧光强度与腺巧浓度呈现良好的线性关系，其线性方程为F-F0 = 77.84C+12.98，相关系数R = 0.998。根据3S规则，计算得本方法对腺巧的检测限为8.4 X 10-8mol ? [1，与现存方法具有可比性，能够达到人尿样中腺巧含量检测的要求。
[0083] 实施例5:本发明的检测方法的选择性考察
[0084] 选择性是评价检测方法的重要指标，本发明考察了 =种腺巧类似物(鸟巧、胞巧和 尿巧）对腺巧检测的影响。如图5所示，当体系中仅存在胞巧、尿巧和鸟巧（均为5.0 X1(T Vol ? 1/1)时，体系无明显的相对巧光强度，而当体系中存在腺巧（5.0Xl(T5mol ? 1/1)时， 体系相对巧光强度显著增加，说明此方法对腺巧表现出良好的选择性。此外，本工作还考察 了实际样品中存在的两种含量较高的无机盐r(8.5Xl〇-3mol ? L-1)和化+(8.5Xl〇-3mol ?
[i)，W及尿素(8.3Xl(T3mol ? 1/1)对腺巧检测的干扰，实验结果表明，当体系中仅含有r、 化+W及尿素时，体系无明显的相对巧光强度，复杂体系中高含量干扰物几乎对检测体系无 影响。因此，本方法具有用于实际样品检测的潜力。
【主权项】
1. 一种双功能探针，其特征在于，包含： 两段腺苷适体，所述腺苷适体用于特异性识别腺苷； 切刻识别位点，所述切刻识别位点用于为切刻酶提供酶切位点； 聚合/切刻模板，所述聚合/切刻模板用于为切刻/聚合反应提供模板； 辅助碱基，所述辅助碱基用于连接所述的两段腺苷适体。2. 如权利要求1所述的双功能探针，其特征在于，所述双功能探针的核苷酸序列为以下 之一： (1) SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；或 (2) 与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性且功能相同的核苷酸序列。3. 权利要求1或2所述的双功能探针在检测腺苷中的应用。4. 一种检测腺苷的试剂，其特征在于，包括： 权利要求1或2所述的双功能探针、聚合酶、连接酶、切刻酶、锁式探针(pad-probe)和 ThT染料； 所述锁式探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。5. 如权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述切刻酶为Nt. BbvCI切刻酶。6. 如权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述聚合酶为KF聚合酶和Phi29聚合酶;所述 连接酶为T4DNA连接酶。7. -种检测腺苷的方法，其特征在于，步骤如下： (1) 制备不同浓度的腺苷，加入权利要求1或2所述的双功能探针，恒温孵育； (2) 向步骤（1)反应后的溶液中加入聚合酶和切刻酶，构建聚合/切刻反应体系，进行聚 合/切刻反应，产生引物序列； (3) 向步骤（2)反应后的溶液中加入pad-probe、T4DNA连接酶，进行连接反应，再加入 Phi29聚合酶和Nt. BbvCI切刻酶，进行指数型滚环扩增； (4) 向步骤(3)反应后的溶液中加入ThT染料，孵育，检测荧光强度，构建荧光强度与腺 苷浓度之间的线性方程，对待测样品，通过测定样品的荧光强度，代入线性方程，计算样品 的腺苷浓度。8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，进行聚合/切刻反应体系的组成 包括:10 X CutSmart缓冲液、dNTPs溶液、KF聚合酶、Nt. BbvCI切刻酶和纯水。9. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，进行指数型滚环扩增的条件为： 向聚合/切刻反应后的溶液中加入T4连接酶缓冲液、pad-pr 〇be、T4DNA连接酶和纯水，37°C 恒温孵育60min;再加入lOXCutSmart缓冲液、dNTPs溶液、Phi29聚合酶、Nt.BbvCI切刻酶和 纯水，37°C恒温孵育180min;反应完成后保持75°C加热25min，终止指数型滚环扩增反应。10. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，构建的荧光强度与腺苷浓度之 间的线性方程为:F-F〇 = 77.84C+12.98，相关系数R = 0.998;其中，F为含有腺苷待测样品的 荧光强度，F〇为相同实验条件下不含腺苷样品的荧光强度，C为样品中的腺苷浓度，mol · L -1 〇
【文档编号】C12N15/11GK106048024SQ201610438106
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】姜玮, 王磊, 魏海平
【申请人】山东大学