一种新型嗜热四元G四链体DNA酶的制作方法

一、技术领域

本发明为一种腺嘌呤邻位增强催化活性且在高温下具有高催化活性的新型嗜热四元g四链体dna酶及其制备方法。

二、

背景技术：

由于蛋白质对温度敏感，稳定性差，蛋白酶在应用上受到限制。寻找、发现能够在极端环境如高温等条件下具有高催化能力、高稳定性的酶具有重要意义。目前，大多数人工合成的具有催化活性的纳米粒子，如au-sio2等，已显示比蛋白酶更好的稳定性。但这类材料合成过程复杂，形貌要求严格，容易聚集。近年来，具有催化活性的dna模拟酶受到广泛关注。它可由富含g碱基的dna序列形成分子内g四链体后，简单地结合血红素(hemin)生成，但催化活性较低。通过加入外源性促进剂或在dna序列的末端修饰胞嘧啶等基团可有效地提高其催化活性。然而，分子内g四链体热稳定性差，形成的dna酶无法在高温下发挥其催化功能。由四条链形成的四元g四链体具有很好的热稳定性，但由于g平面的堆积作用，抑制了hemin和四元g四链体的结合，导致其催化活性低。因而，dna模拟酶在高温下的催化作用鲜有报道。

本发明在富含g碱基的dna序列的末端修饰腺嘌呤，利用铵离子先生成四元g四链体结构，与hemin结合形成四元g四链体dna酶。邻位上的腺嘌呤能够显著提高dna酶的催化活性，同时保留了四元g四链体的热稳定性。这种dna酶合成方法简单、催化活性高、热稳定性好、便于保存，在工业应用上具有很大的应用前景。

三、

技术实现要素：

本发明的内容是：在富含g碱基的dna序列的两端修饰腺嘌呤，在含150mm铵离子的缓冲液中通过95℃退火5min形成四元g四链体结构，然后将该结构和血红素混合，形成嗜热四元g四链体dna酶。

本发明通过以下技术方案来实现：

(1)如图1所示，在富含4，5，6或7个g的dna序列两端修饰a碱基，将其在含150mm铵离子的缓冲液中95℃退火5分钟，冷却至室温，形成四元g四链体结构。

(2)将形成的四元g四链体和hemin混合，在室温下温育1小时，形成嗜热四元g四链体dna酶(图2)。

(3)通过程序调控反应液的温度(25-95℃)，利用dna酶催化h2o2-abts(2’-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)反应，用分光光度法监测其不同温度下的催化活性。

与现有技术相比，本发明具有以下特点：

本发明将腺嘌呤修饰在富g碱基序列的末端，形成的四元g四链体结合hemin构建嗜热四元g四链体dna酶，邻位上的腺嘌呤能够显著提高dna酶的催化活性，同时又保留了四元g四链体结构的热稳定性。相对于现有dna酶，具有以下特点：

(1)该dna酶具有合成过程简单、价格低廉、热稳定性好、易于保存的优点。

(2)该dna酶在宽范围的温度下具有高的催化活性，尤其是在高于75℃的温度下。

(3)75℃下10小时，能够保持50％以上的活性，18小时后该酶显示接近室温的活性；95℃下5分钟，活性没有变化，1.5小时后能够保持50％以上的活性，4小时后该酶显示接近室温的活性。

四、附图说明

图1.用末端修饰腺嘌呤的富g碱基序列(5个g为例)构建四元g四链体结构的示意图

图2.嗜热四元g四链体dna酶的形成以及催化反应示意图

五、具体实施方式

实施例1：结合附图1，说明四元g四链体结构的形成

两端修饰腺嘌呤的富含g碱基的dna序列，在含有150mm铵离子的tris-hcl缓冲液中(0.01m缓冲液，ph7.0)95℃退火，5分钟后冷却至室温，形成四元g四链体结构。

实施例2：结合附图2，说明嗜热四元g四链体dna酶的形成及其在高温下催化h2o2-abts的反应。

(1)酶溶液的制备：将形成的四元g四链体结构和hemin混合在含0.05％tritonx-100和1％dmso的0.01mtris-hcl缓冲液(ph7.0)中，最终浓度分别为0.86μm和1.72μm，室温温育1小时。

(2)控制酶溶液的温度在25-95℃之间，加入1.28mmh2o2和1.28mmabts反应5分钟，用紫外可见分光光度计监测其酶活性，研究酶的耐高温性能。

技术特征：

技术总结
本发明涉及一种腺嘌呤邻位增强催化活性且在高温下具有高催化活性的新型嗜热四元G四链体DNA酶。首先在富含G碱基的DNA序列的两端修饰腺嘌呤，在含150mM铵离子的缓冲液中，95℃退火5min，形成四元G四链体结构。然后将该结构和血红素混合，形成DNA酶。通过程序控制反应体系的温度(25‑95℃)，监测其催化活性，证明该酶在高温下的催化性能：75℃下10小时，能够保持50％以上的活性，18小时后该酶显示接近室温的活性；95℃下5分钟，活性没有变化，1.5小时后能够保持50％以上的活性，4小时后该酶显示接近室温的活性。该嗜热四元G四链体DNA酶制备简单，价格低廉，热稳定性好，便于储存，具有一定的应用前景。

技术研发人员：周俊;鞠熀先;郭悦华;陈杰林
受保护的技术使用者：南京大学
技术研发日：2017.06.21
技术公布日：2017.09.01