一种提高淀粉分支酶在大肠杆菌中胞外分泌表达的方法与流程

本发明涉及一种提高淀粉分支酶在大肠杆菌中胞外分泌表达的方法，属于酶工程技术领域。

背景技术：

淀粉分支酶(branchingenzyme；be；ec2.4.1.18)是一种属于糖苷水解酶家族13的糖基转移酶，是合成糖原及支链淀粉的关键酶。经淀粉分支酶改性的淀粉具有高支化的特点，因此在食品、医药等工业中具有广阔的应用前景。

淀粉分支酶主要来源于植物，而微生物来源的淀粉分支酶又通常是胞内酶，天然菌产酶能力低下，严重制约了该酶的发展应用。为了克服这一缺陷，通过构建基因工程菌实现酶的胞外过量表达是行之有效的途径之一。通过大肠杆菌bl21(de3)表达的geobacillusthermoglucosidans淀粉分支酶，所得淀粉分支酶基本都在胞内，一直未能实现大量的胞外分泌表达，需提从胞内提取淀粉分支酶，不可避免地需要破壁，而破壁成本高，利于工业化生产。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于淀粉分支酶的胞内表达需破壁，工艺复杂；胞外表达酶活较低。针对这一问题提出一种提高淀粉分支酶在大肠杆菌中胞外分泌表达的方法，通过两阶段变温诱导提高淀粉分支酶的胞外产量。

本发明技术方案主要包括以下步骤：

(1)将来源于热葡糖苷酶地芽孢杆菌(geobacillusthermoglucosidans)的成熟淀粉分支酶基因连接质粒pet-20b(+)的t7启动子下游，构建表达载体e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)并转化宿主菌e.colibl21，得到基因工程菌e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)。

(2)将保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)进行种子培养，接种入tb培养基发酵，37℃下培养至发酵液吸光值od600达到0.5～0.6，加入诱导剂异丙基－β－d－硫代半乳糖苷，继续37℃培养12h，然后降温至25℃培养12h；或者在加入诱导剂异丙基－β－d－硫代半乳糖苷后，调节温度至25℃培养12h，再调节温度为30℃或37℃培养12h；或者在加入诱导剂异丙基－β－d－硫代半乳糖苷后，调节温度至30℃培养8～16h，再调节温度为25℃培养8～16h。

本发明的有益效果：

本发明通过多阶段温度控制策略提高淀粉分支酶的胞外酶活，相对于优化培养基成分和培养条件，成本更低；获得较高的胞外酶活(48.2u/ml)后，避免了菌体破壁，降低了工业成本；淀粉分支酶产量的提高更利于高支化淀粉的工业化生产。

附图说明

图1为在20℃、25℃、30℃、37℃恒温诱导温度下的分支酶的胞外分泌(a)与菌体生长(b)情况，其中■：20℃；○：25℃；▲：30℃；▽:37℃。

图2为在两阶段不同诱导温度下分支酶的胞外分泌情况，其中a(×)：25℃升温至30℃(实施例3)；b(●):25℃升温至37℃(实施例4)；c(▲)：30℃降温至25℃(实施例5)；d(◆):37℃降温至25℃(实施例6)。

图3为在不同时间变温后分支酶的胞外分泌情况，其中a(×)：30℃诱导12h降温至25℃后继续诱导12h(实施例5)；b(●):30℃诱导24h降温至25℃后继续诱导12h(实施例7)；c(▲)：30℃诱导36h降温至25℃后继续诱导12h(实施例8)。

具体实施方式

实施例1

淀粉分支酶酶活力测定方法:用50mmol/l磷酸缓冲液(ph7.5)配制0.25％(w/v)马铃薯支链淀粉标准溶液，取0.9ml底物，加入0.1ml发酵上清液，在50℃下反应15min。反应结束后沸水浴灭酶10min，并以10000r/min离心2min待显色用，空白为灭活后的酶。显色体系为0.3ml反应上清液与5.0ml显色液(0.05％(w/v)ki，0.005％(w/v)i2，ph7.5)于7ml离心管中混合，显色15min后在530nm处测定吸光值。

淀粉分支酶酶活定义：常温下在530nm处，吸光值每分钟降低1％为一个酶活单位。

实施例2

将保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)进行种子培养8h。按2％的接种量将活化好的种子培养液接入tb培养基，开始培养温度为37℃，摇床转速为200r/min，待菌体发酵液吸光值od600达到0.5～0.6，加入诱导剂异丙基－β－d－硫代半乳糖苷(iptg)至0.01mm，分别在20℃、25℃、30℃、37℃温度下诱导培养。在20℃、25℃、30℃、37℃诱导温度下的分支酶的胞外酶活与菌体生长情况如图1所示。结果表明发酵时间为12h时，30℃条件下的酶活最大；进一步发酵至24h时，25℃条件下的酶活最大，而20℃和37℃均不利于酶的分泌；因此，在25℃恒温发酵24h时，酶活最高可达到19.9u/ml。

实施例3

将保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)进行种子培养8h。按2％的接种量将活化好的种子培养液接入tb培养基，开始培养温度为37℃，摇床转速为200r/min，待菌体发酵液吸光值od600达到0.5～0.6，加入诱导剂异丙基－β－d－硫代半乳糖苷(iptg)至0.01mm，调节诱导温度至25℃诱导12h后，升高温度至30℃继续诱导12h。结果如图2a所示，随着诱导时间的延长，酶活逐渐增长，变温诱导24h后获得最高酶活37.4u/ml。

实施例4

将保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)进行种子培养8h。按2％的接种量将活化好的种子培养液接入tb培养基，开始培养温度为37℃，摇床转速为200r/min，待菌体发酵液吸光值od600达到0.5～0.6，加入诱导剂异丙基－β－d－硫代半乳糖苷(iptg)至0.01mm，调节诱导温度至25℃诱导12h后，升高温度至37℃继续诱导12h。结果如图2b所示，随着诱导时间的延长，酶活逐渐增长，在诱导18h后有所降低，因此最高酶活为28.4u/ml。

实施例5

将保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)进行种子培养8h。按2％的接种量将活化好的种子培养液接入tb培养基，开始培养温度为37℃，摇床转速为200r/min，待菌体发酵液吸光值od600达到0.5～0.6，加入诱导剂异丙基－β－d－硫代半乳糖苷(iptg)至0.01mm，调节诱导温度至30℃诱导12h，降低温度至25℃继续诱导12h。结果如图2c所示，随着诱导时间的延长，酶活逐渐增长，变温诱导24h后获得最高酶活48.2u/ml。

实施例6

将保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)进行种子培养8h。按2％的接种量将活化好的种子培养液接入tb培养基，开始培养温度为37℃，摇床转速为200r/min，待菌体发酵液吸光值od600达到0.5～0.6，加入诱导剂异丙基－β－d－硫代半乳糖苷(iptg)至0.01mm，继续37℃诱导12h，降低温度至25℃继续诱导12h。结果如图2d所示，随着诱导时间的延长，酶活逐渐增长，变温诱导24h后获得最高酶活45.9u/ml。

实施例7

将保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)进行种子培养8h。按2％的接种量将活化好的种子培养液接入tb培养，开始培养温度为37℃，摇床转速为200r/min，待菌体发酵液吸光值od600达到0.5～0.6，加入诱导剂异丙基－β－d－硫代半乳糖苷(iptg)至0.01mm，调节诱导温度至30℃诱导8h，降低温度至25℃继续诱导16h。结果如图3b所示，在诱导8h变温后，酶活逐渐增长速率加快后有所减慢，最高酶活为42.6u/ml。

实施例8

将保藏的e.colibl21(pet-20b(+)/gbe)进行种子培养8h。按2％的接种量将活化好的种子培养液接入tb培养基，开始培养温度为37℃，摇床转速为200r/min，待菌体发酵液吸光值od600达到0.5～0.6，加入诱导剂异丙基－β－d－硫代半乳糖苷(iptg)至0.01mm，调节诱导温度至30℃诱导16h，降低温度至25℃继续诱导8h。结果如图3c所示，在诱导16h变温后，酶活逐渐增长速率加快，最高酶活为40.2u/ml。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。