一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及毛细管电泳的筛分介质技术领域，具体设及一种用于毛细管电泳的无 胶筛分介质及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 现有技术中，毛细管电泳（capillaryelectrophoresis,CE)又叫高效毛细管电 泳（HPCE)，是近年来发展最快的分析方法之一。1981年化rgenson和Lukacs首先提出在 75μm内径的毛细管柱内加高电压进行分离，创立了现代毛细管电泳。1984年Ter油e等建 立了胶束毛细管电动力学色谱。1987年Hjerten建立了毛细管等电聚焦，Cohen和Karger 提出了毛细管凝胶电泳。1988~1989年出现了第一批商品化的毛细管电泳仪。短短几年 内，由于毛细管电泳（C巧符合W生物工程为代表的生命科学各领域中对多肤、蛋白质（包 括酶、抗体）、核巧酸乃至脱氧核糖核酸值NA)的分离分析要求，从而得到了迅速的发展。
[0003] 毛细管电泳（C巧是一类W毛细管为分离通道，W高压直流电场为驱动力，W样品 在电场下移动速率不同而达到分离目的的液相微分离分析技术，具有分离效率高、分析时 间短、样品消耗少等优点。毛细管电泳通常使用石英毛细管，内径范围在50μηι至100μηι， 长度从25cm到75畑1。在DM分离过程中，分离介质起着非常重要的作用，它决定了DM的 迁移特性、分离度、读出长度、重现性、注入时间、注入压力W及毛细管寿命等，因此分离介 质的研究是DNA分离与测序工作中最重要的组成部分之一。分离介质可分为凝胶筛分介质 和无胶筛分介质（非交联的高分子溶液）两种。1989年首次报道了W水溶性高分子溶液为 介质的毛细管电泳成功地分离了dsDNA，自此高分子溶液取代凝胶而作为DNA分离介质得 到广泛研究。
[0004] 理想的DNA分离介质应具备：良好的筛分性能；自涂覆能力，W抑制电渗流W及消 除DNA与毛细管管壁之间的吸附作用；良好的溶解能力和高亲水性；高分子量、低粘度，W 便于注入和更换介质，利于DNA分析和分离的自动化；在碱性条件下具有良好的化学稳定 性。现已形成W聚丙締酷胺（LPA)和聚二甲基丙締酷胺（PDMA)为主，其他多种高分子聚合 物为辅的无胶筛分体系。 阳0化]STR分型及ssDNA测序分析使用的溶液通常W-定浓度的线性均聚物作为溶质。 亲水性聚合物W非共价方式吸附到毛细管内壁，抑制电渗流并能避免DNA与内壁的相互作 用。LPA具有高亲水性和优良的DNA分离能力。但是它还有高粘度、在高PH值条件下易于 水解等缺点。我们在聚合丙締酷胺时严格控制聚合反应溫度、时间等影响因素，通过控制分 子量从而提高LPA的缠结热稳定性，发挥其高亲水性及良好的筛分能力。
[0006] 中国专利CN102220599B公开了一种聚合物链的准互穿聚合物网络，所述聚合物 链包括：
[0007] (a)长链线性聚（N，N-二甲基丙締酷胺）链，其粘均分子量在SOOkDa~1200kDa 的范围；(b)短链线性聚（N，N-二甲基丙締酷胺）链，其粘均分子量在20kDa~60kDa的 范围；和（C)丙締酷胺和N，N-二甲基丙締酷胺的无规共聚物链，所述无规共聚物在所述长 链线性聚（N，N-二甲基丙締酷胺）链（a)和所述短链线性聚（N，N-二甲基丙締酷胺）链 化）的存在下通过将丙締酷胺单体和N，N二甲基丙締酷胺单体进行氧化还原自由基聚合制 备，所述无规共聚物的分子量大小在IMDa~lOMDa的范围，其中在所述丙締酷胺和N，N-二 甲基丙締酷胺的无视共聚物链中，所述单体丙締酷胺和所述单体N，N-二甲基丙締酷胺的 重量比为90 :10~99. 9 :0. 1 ;其中，所述长链、短链线性聚（N，N-二甲基丙締酷胺）和所 述丙締酷胺和N，N-二甲基丙締酷胺的无视共聚物链彼此缠结、互穿，形成聚合物链的准 互穿聚合物网络，并且其中，所述聚合物链的准互穿聚合物网络无化学交联，和其中所述无 视共聚（丙締酷胺-N，N-二甲基丙締酷胺）与所述长链聚（N，N二甲基丙締酷胺）和所述 短链聚（N，N-二甲基丙締酷胺）两者之和的重量比是50 :50~99 :10。但是，该专利还存 在分辨率低、稳定性差的问题。
【发明内容】
[0008] 为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供制备的筛分介质可用于STR分型、ssDNA 测序的毛细管电泳分离，本发明提供一种制备具有高分辨率、高稳定性、低粘度的毛细管电 泳无胶筛分介质及其制备方法。
[0009] 本发明是通过如下技术方案实现的：一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质，包括 聚合物单体、溶剂、链转移剂、引发剂和催化剂，所述聚合物单体为丙締酷胺，所述溶剂为去 离子水，所述链转移剂是异丙醇，所述引发剂是过硫酸锭，所述催化剂是N，N，N，N-四甲基 二乙胺，所述丙締酷胺、去离子水、异丙醇、过硫酸锭和N，N，N，N-四甲基二乙胺的配比为 20-30g:180-270ml:5. 24-7. 86ml:1. 0-2. 0ml:1. 0-2. 0ml，得到无胶筛分介质。
[0010] 进一步地，所述丙締酷胺、去离子水、异丙醇、过硫酸锭和N，N，N，N-四甲基二乙胺 的配比为 25g:222ml:6. 55ml:1. 25ml:1. 25ml。
[0011] 进一步地，所述无胶筛分介质是聚丙締酷胺。
[0012] 本发明还提供了一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质的制备方法，包括W下步 骤：
[001引步骤1):将聚合物单体、溶剂、链转移剂、引发剂和催化剂混合步骤，选取所述聚 合物单体为丙締酷胺，所述溶剂为去离子水，所述链转移剂是异丙醇，所述引发剂是过硫酸 锭，所述催化剂是N，N，N，N-四甲基二乙胺混合物；
[0014] 按照所述丙締酷胺、去离子水、异丙醇、过硫酸锭和N，N，N，N-四甲基二乙胺的配 比为25g:222ml:6. 55ml:1. 25ml:1. 25ml;在无氧环境下进行聚合反应，得到聚合物；
[0015] 步骤2):对步骤1)得到的所述聚合物经透析步骤、冷冻干燥步骤之后在溶胶缓冲 液中进行溶胀步骤；
[0016] 步骤3):再经抽滤步骤获得所述筛分介质，所述抽滤步骤是将溶胀后的溶液经 0. 2μπι的尼龙滤器过滤，所述筛分介质是聚丙締酷胺。
[0017] 进一步地，步骤1)中所述无氧环境是在反应容器中通入高纯氮气条件，反应时间 为10-60分钟，聚合反应溫度为35 °C。
[0018] 进一步地，所述反应时间为90分钟。
[0019] 进一步地，所述溶胶缓冲液为浓度配比是：0. 5M:0. 5M:0. 02M:7M的Ξ径甲基氨基 甲烧、Ν-Ξ(径甲基）甲基-3-氨基丙横酸、乙二胺四乙酸巧离络合剂和尿素溶液。
[0020] 进一步地，步骤2)中所述透析步骤选用截留分子量为12-14邸a的透析袋进行透 析。
[0021] 进一步地，所述聚丙締酷胺重均分子量范围为10-100邸曰。
[0022] 进一步地，所述聚丙締酷胺重均分子量为20-40邸曰。
[0023]与现有技术相比，优越效果在于：本发明制备的筛分介质具有良好的筛分性能，具 有良好的溶解能力和高亲水性，能够有效的减少DNA与毛细管管壁之间的吸附作用，高分 子量、低粘度，便于注入和更换介质，利于DNA分析和分离的自动化，完全满足现阶段法医 STR分析检测的目的要求。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明所述用于毛细管电泳的无胶筛分介质的iH-NMR谱图，其中溶剂为 〇2〇 ；
[0025] 图2为本发明所述用于毛细管电泳的无胶筛分介质的LI巧00电泳结果图谱；
[0026] 图3为本发明所述用于毛细管电泳的无胶筛分介质的Ladder电泳结果图谱；
[0027] 图4为本发明所述用于毛细管电泳的无胶筛分介质的9947A电泳结果图谱。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合附图对本发明【具体实施方式】作进一步详细说明。 阳〇29] 实施例1
[0030] 具体说明本发明提供的一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质，包括聚合物单体、 溶剂、链转移剂、引发剂和催化剂，所述聚合物单体为丙締酷胺，所述溶剂为去离子水，所 述链转移剂是异丙醇，所述引发剂是过硫酸锭（APS)，所述催化剂是N，N，N，N-四甲基二乙 胺灯EM邸），所述丙締酷胺、去离子水、异丙醇、过硫酸锭（AP巧和N，N，N，N-四甲基二乙胺 灯EMED)的配比为（20-30)g: (180-270)ml: (5. 24-7. 86)ml: (1. 0-2. 0)ml: (1. 0-2. 0)ml， 得到无胶筛分介质，所述丙締酷胺、去离子水、异丙醇、过硫酸锭（AP巧和N，N，N，N-四甲基 二乙胺灯EMED)的配比为25g:222ml:6. 55ml:1. 25ml:1. 25ml，优选。所述无胶筛分介质是 聚丙締酷胺（LPA)，结构式如下：
[0031]
[0032] 本发明还提供了一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质的制备方法，所述方法包括 W下步骤：
[003引步骤1):将聚合物单体、溶剂、链转移剂、引发剂和催化剂混合步骤，选取所述聚 合物单体为丙締酷胺，所述溶剂为去离子水，所述链转移剂是异丙醇，所述引发剂是过硫酸 锭（APS)，所述催化剂是N，N，N，N-四甲基二乙胺灯EMED);
[0034] 按照所述丙締酷胺、去离子水、异丙醇、过硫酸锭（AP巧和N，N，N，N-四甲基二乙胺 灯EMED)的配比为（20-30)g: (180-270)ml: (5. 24-7. 86)ml: (1. 0-2. 0)ml: (1. 0-2. 0)ml; 在无氧环境下进行聚合反应，得到聚合物；
[0035] 步骤2):对步骤1)得到的所述聚合物经透析步骤、冷冻干燥步骤之后在溶胶缓冲 液中进行溶胀步骤；
[0036] 步骤扣：经抽滤后获得所述筛分介质，所述抽滤是将溶胀后的溶液经0.2μm的尼 龙滤器过滤，所述筛分介质是聚丙締酷胺（L