本申请要求于2015年11月03日提交的美国临时申请号62/250,182号的优先权，其通过引用纳入本文用于所有目的。
政府权益的声明
该发明是在国家卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的资助号p50hg005550，国家卫生研究院授予的资助号rc2hl102815，国家卫生研究院授予的资助号mh098977，国家卫生研究院授予的资助号gm080177以及国家科学基金(nationalsciencefoundation)资助号dge1144152下由政府支持所完成的。政府对本发明享有某些权利。
发明领域
本发明涉及用于核酸的三维基质容积成像的设备和方法，其中，该核酸已经在该基质内被扩增、检测和测序。
背景技术：
因为诸如rna和蛋白质的许多基因产物在其作用区域富集，所以其位置对其功能提供了重要的线索。这样的性质已经被用于生物学研究许多领域中的原位荧光杂交，免疫组织化学和组织特异性报告试验。大多数的光学测序方法利用二维固体基材或微孔/维室以在测序过程中固定测序模板，从而维持光学检测的空间不变性，并且因此能够重建单个核酸模板序列。在两种情况中，信号的光学检测最多出现在两维平面。
发明概述
本发明的实施方式涉及三维基质内(如固定的生物样品内)核酸的容积成像(volumetricimagining)，以及用于三维基质内(如在固定的生物样品内)核酸容积成像的设备。容积成像在三维空间内检测荧光编码的或光学编码的信号。根据一个方面，三维基质内分子的三维定位是确定的。根据某些方面，提供了用于以容积检测、成像和重建的方法对任意体积进行成像的方法。示例性的容积检测方法包括对利用光学切割(sectioning)(例如，在整个体积中对图像进行二维采集)以及不利用光学切割(例如，数字全息和物理切割)的光学切片进行容积成像的方法。
本公开的方面可以包括这样的原位核酸测序方法，其在测序期间使用三维基质固定核酸测序模板，保持测序模板之间的三维空间关系，进行序列和三维位置信息的检测和重建。本文所述示例性方法还涉及重建三维生物学特征，如蛋白质和细胞膜。示例性的容积成像方法包括本文所述以及本领域已知的，这些方法系统地或以其他方式在三维空间内测量光信号。因此，本公开的方面包括用于原位测序的核酸容积成像的方法和设备。本公开的方面进一步包括用于原位测序的核酸容积成像的自动化方法和设备，其包括原位测序方法或设备，流体方法(fluidicsmethod)或试剂递送方法或设以调节试剂流动并且递送试剂，以及容积成像方法或设备，用于成像和/或检测来自原位测序的核酸或其他感兴趣的分子或结构的光信号。根据某些方面，本文所述方法和设备并不限于核酸。三维基质内可以例如使用可检测的部分(如荧光部分和本领域技术人员已知的其他可检测部分)检测的任何分子或结构都可以是本文所述容积成像方法的对象。这样的分子或结构可以包括dna、rna、蛋白质、生物分子、细胞结构等。
pctus2014/18580中提供了制作核酸序列的三维基质，扩增这样的核酸序列，对这样的核酸序列测序以及对这样的核酸序列进行成像的示例性方法，通过引用全文纳入本文。这样的方法包括制作三维基质，其包括共价结合在基质内或基质材料内或基质材料的核酸。核酸可以与基质材料共聚合，或者与基质材料交联，或者两者。根据一个方面，某些长度的多个核酸序列(如dna或rna序列)是三维共聚物的部分。根据一个方面，诸如给定长度的dna或rna序列的核酸共价地连接至基质材料以保持其在基质内x、y和z轴的空间方向。应当理解的是，三维基质可以包括基质材料，并且术语共聚物、基质和基质材料可以互换使用。有用的方法还包括将自然产生的核酸固定在其天然环境中，诸如在细胞内或在组织样品内。三维核酸基质可以在细胞或组织样品中原位生成以保持自然产生的核酸序列的多样性(如dna和rna)以及在细胞、组织或任何其它复杂的生物材料内的空间方向。根据这一方面，核酸的位置以及其相对位置被鉴定为诸如亚细胞区室内、细胞内、组织内的三维结构，被鉴定为三维核酸集合，被鉴定为三维核酸材料等。如果需要，可以原位扩增并对核酸进行测序，因此提供细胞或组织内核酸的位置信息。
根据相关的方面，感兴趣的核酸或感兴趣的其它分子，无论是自然产生的或合成的都可以存在于三维基质材料内，并且共价地连接至三维基质材料，这样各核酸的相对位置在三维基质材料内被固定，即被固定化。以此方式，提供了任何所需序列共价结合核酸的三维基质。各核酸在基质材料内拥有其特有的三维坐标，并且各核酸代表信息。根据一个方面，诸如dna或rna的单个核酸可以原位扩增和测序，即在基质内。
根据其它方面，可以扩增核酸以在三维基质材料内产生扩增子。然后可以将扩增子共价地连接至基质，例如，通过共聚作用或交联。这样产生了结构稳定且化学稳定的三维基质核酸。根据这一方面，核酸的三维基质允许持续的信息储存和读取循环。该核酸/扩增子基质允许生物和非生物样品大范围阵列的三维高通量测序。
根据某些方面，提供了三维核酸基质，其中多个核酸分子(如dna或rna)、扩增子或核酸结构单元在相对于彼此的三维空间内固定，如通过与基质的共价结合。在这样的情况下，核酸分子被牢牢地固定从而其在基质内维持其坐标位置。应当理解的是，即使核酸分子可以共价地连接至三维基质材料，核酸分子其自身通过与基质结合能够运动，例如，当核酸序列在核酸上的单一位置结合基质。
根据一个方面，包括核酸的三维基质是多孔的。根据一个方面，包括核酸的三维基质的多孔程度使得通常用于扩增方法的试剂可以扩散或以其它方式穿过基质以接触核酸，并且因此在合适条件下扩增核酸。多孔性可以是由用于制作基质材料的分子的聚合和/或交联所导致。凝胶制剂内的扩散特性主要是孔尺寸的作用。选择分子筛尺寸以允许用于扩增和测序的酶、寡核苷酸、甲酰胺和其它缓冲液快速扩散(>50-nm)。还选择分子筛尺寸，从而使得大dna或rna扩增子不容易在基质内扩散(<500-nm)。根据本领域技术人员已知的方法，通过改变交联密度、链长度以及共聚化的单体分子的百分比来控制多孔性。
根据一个方面，三维基质材料是化学惰性且热稳定的，以允许各种反应条件和反应温度。根据这个方面，三维基质材料对本领域技术人员已知扩增和测序方法中所用条件是化学惰性且热稳定的。
根据一个方面，三维基质材料是光学透明的。根据这个方面，三维基质材料是光学透明的，以允许进行本领域技术人员已知的三维成像技术。
根据一个方面，扩增核酸使得产生足够水平的扩增子用于三维成像。例如，核酸经扩增并且包括对于与三维成像相容的荧光足够高水平的标签。
根据一个方面，用于形成基质的材料与许多生物和非生物样品原位相容，从而避免将核酸分子从其天然环境提取。
根据一个方面，基质材料可以是半固体培养基，其可以由聚丙烯酰胺、纤维素、海藻酸盐、聚酰胺、交联琼脂糖、交联葡聚糖或交联聚乙二醇制成。在某些方面，半固体培养基具有x、y和z轴，并且核酸随机或非随机的存在于三维基质内。
在某些方面，可以将半固体培养基连接至固体支持物，如显微镜载片或流动池。该固体支持物可以连接至半固体培养基的底部表面。
根据一个方面，提供了自动化方法和装置，用于将试剂引入基质，例如通过使用包括一个或多个其中储存试剂的储库(reservoir)的流体或微流体装置，将试剂引导至基质的通道或导管，以及一个或多个泵，以从储库通过通道或导管推动或抽取试剂并至基质。自动化方法和装置可以通过微处理器和软件控制。
附图简要说明
结合附图，通过以下示例性实施方式的详述能够更清楚地理解本发明实施方式的上述和其他特征和其他优点。
图1显示了下述过程的示意图：在细胞内原位生成核酸的基质，然后原位扩增诸如dna或rna的核酸，原位共聚化扩增子，将扩增子共价连接至基质材料，调查扩增子，并且沿着重建的3d细胞图像以10-7m量级的dna/rna扩增子对扩增子进行成像。
图2是自动化测序和三维容积成像装置部件示意图的透视图。
图3是自动化测序和三维容积成像装置部件示意图的正视图。
图4是自动化测序和三维容积成像装置部件示意图的透视图。
图5是自动化测序和三维容积成像装置具有样品架的载台(stage)的示意图的透视图。
图6是用于本文所述实施方式的示例性示意时序图。
图7是阐释示例性ttl通信结构方面的示例性示意框图。
图8显示了针对测序装置流体、成像和双载台子系统的示例性时序和资源使用时序图。
图9显示了针对双载台、流体和成像子系统阐述控制器组织的示例性示意框图。
图10显示了用于控制物镜状态并且与物镜结合的示例性装置系统。
图11显示了用于样品随时间相对于成像轴的可重复xyz定位的流程图。
图12显示了用于映射包括固体基材的样品架表面的示例性系统。
具体实施方式
本发明提供了用于分析存在于三维基质内分子的方法和设备，如三维基质中的多个核酸。根据一个方面，提供了自动化测序和三维成像装置(即，容积成像装置)，其可以测量、处理并且可选地在三维空间内定位光信号，以测量三维基质内荧光编码的或光学编码的核酸测序。
根据一个方面，已经扩增核酸并且使用本领域技术人员已知的光学测序方法测序，因此可以光学检测该核酸。根据一个方面，提供了自动化测序和三维成像装置，其包括三维成像设备，用于液体交换的设备，用于温度控制的设备，以及用于计算分析的设备。自动化测序和三维成像装置使用生物化学方法来执行荧光编码的或光学编码的核酸测序，获得图像数据，并且任选地，数据处理。
根据一个方面，已经扩增了三维基质内多个核酸并且使用本领域技术人员已知的光学测序方法测序，因此对可以光学检测的核酸进行容积成像。根据这个方面，在荧光编码的或光学编码的核酸测序化学的检测过程中，光在激发后从核酸模板分子或多分子扩增子以三维方式发出。被称为点扩散函数的发射光的三维分布是在点源成像时通过光学系统产生。在传统的宽视野显微系统中，随着焦平面与z中点光源的距离增加，图像变得不太点状。位于各失焦平板的总整合强度与焦平面的总整合强度相同，但是实际上在一定距离之后，强度水平降低至检测器的灵敏度。失焦光也是分散的，能够分辨另一焦平板内强度大于失焦背景的物体。点扩散函数的大小和尺寸由光学系统确定，特别是物镜的数值孔径。尽管可以使用宽视场显微以这种方式对体积进行成像，但是其它方式实现更高的纵向分辨率和信噪比。
用于本文所述自动化测序和三维成像装置的示例性的容积成像方法大体可以分为两类：结构照明和发射操控。其它方法包括计算重建以及测量发射光角度分量。这些方法提供了三维空间内光强度和波长的系统性测量。
根据一个方面，提供了自动化测序和三维成像装置，其包括三维成像设备，其中使用3d结构照明(3dsim)对三维基质进行成像。在3dsim中，具有空间模式的光被用于激发，并且通过照明模式与所述样品干扰生成的莫尔波纹(moirepattern)中的条纹被用于在三维中重建光源。为了照亮整个区域，使用多个空间模式来激发相同的物理区域。使用数字处理或模拟法重建最终图像。参见york,andrewg.,等"活细胞和胚胎中通过模拟图像处理的瞬时超分辨率成像(instantsuper-resolutionimaginginlivecellsandembryosviaanalogimageprocessing)."naturemethods10.11(2013):1122-1126，和gustafsson,matsgl,等"宽场荧光显微中通过结构照明的三维分辨率倍增(three-dimensionalresolutiondoublinginwide-fieldfluorescencemicroscopybystructuredillumination)."biophysicaljournal94.12(2008):4957-4970，其各自通过引用将其全部内容纳入本文。
双光子或多光子显微方案是有用的结构照明显微方法。参见denkw.,stricklerj.,webbw.(1990)."双光子激光扫描荧光显微术(two-photonlaserscanningfluorescencemicroscopy)".science248(4951):73-6，通过引用将其全部内容纳入本文。双光子显微是这样的一类显微术，其通过在每个激发事件使用双光子实现在样品深处成像。这些系统通常使用常波长光来激发，而这由于减少了色散更有效地穿透组织。使用双光子激发还减少了背景信号，因为单光子吸收提供的能量不足以激发荧光团的发射。双光子显微还可以利用更大或更高效的光学和传感器配置以检测发射，因为对于成像系统扫描期间激发随时间的位置是已知的。该模式(modality)的其它益处包括减少样品的光损伤。
根据一个方面，提供了自动化测序和三维成像装置，其包括三维成像设备，其中使用诸如选择性平面照明显微术(spim)或单层光显微术(lsm)的平面照明方法对三维基质进行成像。在spim中，在各平面中选择性地以第三维激发光学检测部分，而在与照明轴正交的平面中获得二维图像，从而对分布在第三维的物体之间的成像时间/帧之间提供有效分离。参见，huisken,jan,等"通过选择性平面照明显微术在活胚胎内深度光学切片(opticalsectioningdeepinsideliveembryosbyselectiveplaneilluminationmicroscopy)."science305.5686(2004):1007-1009，通过引用将其全部内容纳入本文。针对容积测量提供了平面的系统性连续成像。平面照明光可以使用任何数量的方法生成，如高斯和贝塞尔光束成形。
根据一个方面，提供了自动化测序和三维成像装置，其包括三维成像设备，其中使用发射操控对三维基质进行成像，如共焦显微术，其中将一个或多个针孔置于镜头的共焦平面，阻挡失焦光到达检测器。物镜的焦平面系统地移动通过第三维，实现容积成像。参见wilson,tony."共焦显微术(confocalmicroscopy)."academicpress:london,等426(1990):1-64，通过引用将其全部内容纳入本文。
根据一个方面，提供了自动化测序和三维成像装置，其中包括共焦成像或显微模式。根据某些方面，共焦成像或显微模式是扫描激光共焦模式。根据另一个方面，共焦模式是转盘(spinningdisk)共焦模式。转盘可以是nipkow盘。根据另一个方面，共焦显微模式是平行光束扫描激光模式，其中一个或多个针孔例如通过使用镜式振镜在样品上扫描。共焦模式可以包括一个或多个显微镜头阵列，例如用于将激发光聚焦到针孔阵列上。
根据一个方面，提供了自动化测序和三维成像装置，其包括三维成像设备，其中使用包括孔径相关(aperturecorrelation)的平行共焦方法对三维基质进行成像。参见，wilson,tony,等"通过孔径相关的共焦显微(confocalmicroscopybyaperturecorrelation)."opticsletters21.23(1996):1879-1881，通过引用将其全部内容纳入。
根据一个方面，提供了自动化测序和三维成像装置，其包括三维成像设备，其中使用针对容积成像的显微镜头对三维基质进行成像，其被称之为光场显微术。参见，broxton等(2013)"针对光场显微术的波动光学理论和3-d解卷积(waveopticstheoryand3-ddeconvolutionforthelightfieldmicroscope)"斯坦福计算机图形实验室技术报告(stanfordcomputergraphicslaboratorytechnicalreport)2013-1，通过引用将其全部内容纳入本文。根据这个方面，主透镜和检测器之间的显微镜头阵列将光传递至光场用于检测，否则所述光将在中间平面处聚焦。应用3d重建算法来生成容积图像。
根据一个方面，提供了自动化测序和三维成像装置，其包括三维成像设备，其中使用来自切片的容积重建方法对三维基质进行成像。
根据对任意维度的体积进行成像这个方面，出于成像的目的，可以将样品切成任意维度的区段。使用关于各区段相对于原始体积相对位置的信息，重建原始体积。该过程通常被称之为“获取连续切片”，并且由于容积成像方案扫描深度的限制以及通过操纵和标记厚样品的限制而被使用，其中扩散可能限制试剂深入样品的渗透。在特殊情况中，切片可能比光的衍射极限更薄，这使得切片轴的分辨率超出了光的衍射极限所能实现的范围。根据本文所述由连续切面3d容积重建的方法，在创建3d测序文库之前或之后对样品进行切片，但是特别地，该切片以保留切片之间空间关系的方式进行。例如，将各切片置于流动池的单独孔中，并且给予独特的标识。在切片过程中，样品连接在固体支持物基材，具体地，通过创造样品基质和固体基材之间的共价交联或通过创建新的包封结构基质。根据一个方面，切片被转移至功能化玻璃上，并且共价化学交联在玻璃和样品的3d基质之间形成。根据一个方面，切片被转移至功能化玻璃上，并且形成共价连接玻璃表面的新的支持基质，以包封样品并提供结构支持。例如，生物样品切片附近或穿过其形成4％1:19丙烯酰胺：双凝胶作为fisseq的主要3d基质；或者将已经存在的fisseq凝胶(包括使用聚丙烯酰胺基质作为主要3d基质形成的那些)切片，并且包裹在第二3d稳定基质(stabilizingmatrix)中。
根据一个方面，提供了自动化测序和三维成像装置，其包括三维成像设备，其中使用解卷积显微术(deconvolutionmicroscopy)对三维基质进行成像，所述解卷积显微术包括处理数字图像数据的计算算法方法，从而移除显微镜光学部件的作用。参见biggs,davidsc."3d解卷积显微术(3ddeconvolutionmicroscopy)."currentprotocolsincytometry(2010):12-19，通过引用将其全部内容纳入本文。因为光学显微术将光的点源检测为存在于三维的点扩散函数，所以本文所述解卷积方法将聚焦光重新分配至点源，常常使用光学系统点扩散函数的模型或测量值。这可以有效地提高三维分辨率。
根据一个方面，提供了自动化测序和三维成像装置，其包括三维成像设备，其中这样对三维基质进行成像：使用像差校正多焦点显微术以同时捕获多个样品平板的图像，使用衍射的傅里叶光学器件创建2d宽场图像焦点的瞬时阵列，在一个或多个相机帧中同时记录。参见abrahamsson,sara,等"使用像差校正多焦点显微术的快速多彩3d成像(fastmulticolor3dimagingusingaberration-correctedmultifocusmicroscopy)."naturemethods10.1(2013):60-63，通过引用将其全部内容纳入。至于显微镜头阵列显微术，整个成像体积在没有部件的机械运动的情况下记录。
根据一个方面，提供了自动化测序和三维成像装置，其包括三维成像设备，其中使用数字全息显微术对三维基质进行成像。根据这个方面，数字全息显微术不记录投影图像，而是将光波阵面信息记录为全息图。参见manoharan"针对复杂流体和生物系统3d成像的数字全息显微术(digitalholographicmicroscopyfor3dimagingofcomplexfluidsandbiologicalsystems)"，通过引用将其全部内容纳入本文。使用数字传感器测量光的幅度和相位。全息图包含体积重建所需的全部信息。如果物体波阵面是从多个角度测量的，那么物体的所有光学特性都可以被充分表征。因为没有成像透镜，所以对光学系统建模的重建算法将在没有相差的情况下重建体积。
根据一个方面，本文所述自动化测序和三维成像装置可以进行一种或多种容积成像方法，如通过包括一个或多个容积成像设备以进行一种或多种容积成像方法。本文所述容积成像方法的组合可以用于进一步增强分辨率、成像速度、光效率或获得额外益处。例如，已经将sim和共焦显微术原则组合成多焦sim(msim)。参见，andrewg.,等"经由多焦结构照明显微术在活体多细胞组织中分辨率倍增(resolutiondoublinginlive,multicellularorganismsviamultifocalstructuredilluminationmicroscopy)."naturemethods9.7(2012):749-754，通过引用将其全部内容纳入本文。同样，切片的容积重组可与其它方法组合，如共焦显微术，因为共焦显微数百微米的深度限制，而所期望的是在三维基质任意维度测序。
根据一个方面，本文所述自动化测序和三维成像装置包括具有一个图像传感器的成像方式。根据另一个方面，本文所述自动化测序和三维成像装置包括具有两个或多个图像传感器的成像方式。根据一个方面，本文所述自动化测序和三维成像装置包括具有四个图像传感器的成像方式。根据一个方面，图像传感器是光子倍增管(pmt)。根据另一个方面，图像传感器是电荷耦合装置(ccd)。根据不同的方面，图像传感器是互补型金属氧化物半导体(cmos)。根据一个方面，图像传感器通过整合的空气或液体降温设备冷却，例如为了减少电噪声或为了稳定传感器热工作条件的目的。进一步根据这个方面，液体冷却设备可以提供用于相对于主动空气冷却振动减小的冷却，如通过风扇。冷却设备或单元可以使用与风扇结合的散热器以使温度变化期间产生的热量散发。加热或冷却设备或单元可使用暖气片和液体冷却/循环系统以使温度变化期间产生的热量散发。加热或冷却设备或单元可以使用温度传感器或热敏电阻来向控制系统提供温度反馈，该控制系统可以是微控制器或内置任务的电子电路。
根据另一个方面，本文所述自动化测序和三维成像装置包括彩色多路复用器(multiplexer)，用于检测光的一种或多种不同颜色。由一个或多个荧光发射器发射的光通过检测器检测。在某些方面，检测器被设置成检测具有特定波长光的光子。根据另一个方面，过滤发射光，因此只有特定波长的光子被光子检测器所检测。进一步根据另一个方面，该装置包含一个或多个发射过滤器、激发过滤器和/或二向色镜(dichroic)，用于检测光学系统内特定波长的光。进一步根据一个方面，该装置包含一个或多个声光可调谐滤波器(aotf)，用于将特定波长的光引导至特定的一个或多个检测器。根据一个方面，连续检测光信号的颜色。根据另一个方面，通过一个或多个传感器检测光的两种或多种可区分的颜色。
根据另一个方面，本文所述自动化测序和三维成像装置被用于以串行或并行检测光的两种或多种不同颜色。根据一个方面，被检测的光的颜色沿着电磁光谱间隔开以促进颜色之间的区分。根据某些方面，荧光信号通过发射波长沿着电磁光谱间隔开，以促进特定荧光部分的特异性检测。根据某些方面，荧光信号通过发射激发沿着电磁光谱间隔开，以促进特定荧光部分的特异性激发。根据一个示例性的方面，发射光的颜色分布在约510nm、570nm、620nm和/或680nm。根据另一个示例性的方面，激发光的颜色分布在约480nm、530nm、590nm和/或640nm。
根据一个方面，本文所述自动化测序和三维成像装置包括一个或多个光源。根据一个方面，光源被用于激发样品荧光发射的目的。根据另一个方面，光源被用于检测吸光度、拉曼散射或光和样品之间相互作用的其它模式的目的。根据某些方面，光源包括一个或多个发光二极管(led)。根据另一方面，光源包括一个或多个激光。根据另一方面，光源包括一个或多个灯组成，如汞灯或金属卤化物灯。根据某些方面，光源通过自由空间光学器件偶联到装置，其中光通过气体或真空从光源传播到装置的光学系统。根据另一方面，光源通过光纤或液体光导偶联到装置。根据一个示例性方面，沿着具有方形核心(squarecore)的光纤整体或部分传输光。均匀分布根据这个方面，方形核心与方形孔径(squareaperture)或方形场阑配对。进一步更加这个方面，方形核心和/或方形孔径的尺寸可以被设计成与光学系统内图像传感器的尺寸相匹配。根据某些方面，根据将光的多个颜色组合成单个纤维的机制，融合多个纤维。根据某些方面，根据将光的多个颜色组合成单个纤维的机制，光学组合多个纤维。根据某些方面，激发光穿过快门以控制光进入或穿过光学系统的传播。根据某些方面，使用声光可调谐滤波器(aotf)控制光进入或穿过光学系统的传播。根据某些方面，出于使装置内一个或多个事件同步的目的，激发光进入或穿过光学系统的传播与控制器系统机械地、电力地或电化学地偶联。
根据一个方面，待通过本文所述自动化测序和三维成像装置分析的样品是三维基质，其包括与其结合的多个核酸。根据一个方面，基质是包含三维核酸的聚合物。核酸可以是自然产生的核酸或非自然产生的核酸，如使用合成方法制备的核酸。三维基质中的核酸可以是有序的或无序的。三维基质中的核酸可以其在细胞、组织或器官内的自然空间关系存在。三维基质中的核酸可以三维基质内行和列的形式存在，如以规则或重复的阵列。
根据一个方面，核酸经修饰以纳入功能性部分，用于连接基质。功能性部分可共价地交联、共聚化或以其它方式非共价地连接基质。功能性部分可与交联剂反应。功能性部分可以是配体-配体结合对的部分。dntp或dutp可以用功能性基团修饰，从而使得功能部分在扩增期间被导入dna。合适的示例性功能性部分包括胺、丙烯酰胺(acrydite)、炔、生物素、叠氮化物和硫醇。在交联的情况中，功能性部分交联至修饰的dntp或dutp或两者。合适的示例性交联剂反应基团亚氨酸酯(dmp)、琥珀酰亚胺酯(nhs)、马来酰亚胺(硫代-smcc)、碳化二亚胺(dcc,edc)和苯基叠氮化物。在本公开范围内的交联剂可以包括间隔物部分。这样的间隔物部分可以是功能化的。这样的间隔物部分可以化学稳定的。这样的间隔物可以具有足够的长度以允许结合基质的核酸扩增。合适的示例性间隔物部分包括聚乙二醇、碳间隔物、光可裂解间隔物和本领域技术人员已知的其他间隔物等。
根据一个方面，形成基质的材料与多个核酸接触，所述核酸彼此之间以三维空间排列。
形成基质的材料包括聚丙烯酰胺、纤维素、海藻盐、聚酰胺、交联琼脂糖、交联葡聚糖或交联聚乙二醇。通过使形成基质的材料聚合和/或交联，使用针对形成基质的材料的方法以及本领域技术人员抑制的方法、试剂和条件，形成基质的材料可以形成基质。
根据一个方面，形成基质的材料可以被导入细胞。细胞用甲醛固定，并且然后将其浸入乙醇中以破坏脂质膜。向样品添加基质形成试剂，并且允许其渗透过整个细胞。然后加入聚合诱导催化剂、uv或功能性交联剂以允许形成凝胶基质。洗脱未被纳入的材料，并且将任何剩余的功能性反应基团淬火。示例性的细胞包括任何细胞，人类或其它，包括疾病细胞或健康细胞。某些细胞包括人细胞、非人细胞、人干细胞、小鼠干细胞、原代细胞系、永生化细胞系、原代和永生化成纤维细胞、hela细胞和神经元。
根据一个方面，形成基质的材料可以被用于包封生物样品，如组织样品。用二甲苯孵育载片上福尔马林固定的包埋组织，并且使用移除洗涤以移除包埋蜡。然后用蛋白酶k对其进行处理来透化组织。然后加入聚合诱导催化剂、uv或功能性交联剂以允许形成凝胶基质。洗脱未被纳入的材料，并且将任何剩余的功能性反应基团淬火。示例性的组织样品包括感兴趣的任何组织样品，无论是人类还是非人类的。这样的组织样品包括来自皮肤组织、肌肉组织、骨骼组织、器官组织等的那些。示例性的组织包括人类和小鼠脑组织切片、胚胎切片、组织阵列切片和整个昆虫和蠕虫胚胎。
形成基质的材料形成包括多个核酸的三维基质。根据一个方面，形成基质的材料形成包括多个核酸并且保持核酸的空间关系的三维基质。在这个方面，多个核酸被固定在基质材料内。通过使形成基质的材料内的核酸共聚化，多个核酸可以被固定在基质内。通过使核酸与基质材料交联或与形成基质的材料以其它方式交联，多个核酸也可以被固定在基质内。通过共价连接或经由配体-蛋白质与基质的相互作用，多个核酸也可以被固定在基质内。
根据一个方面，基质是多孔的，因此允许在核酸位点处引入试剂，用于扩增核酸。多孔基质可以根据本领域技术人员已知的方法制备。在一个实施例中，使用合适的丙烯酰胺：双-丙烯酰胺比以控制交联密度，聚丙烯酰胺凝胶基质与丙烯酰胺修饰的链霉亲和素单体以及生物素化的dna分子共聚化。对于分子筛大小和密度的附加控制通过添加额外的交联剂实现，如功能化的聚乙二醇。根据一个方面，可能代表信息比特的核酸易被寡核苷酸访问，所述寡核苷酸例如标记的寡核苷酸探针、引物、酶和具有快速动力学的其它试剂。
根据一个方面，基质具有足够的光学透明性或者具有适用于标准的下一代测序化学的光学特性，以及用于高通量信息读取的深度三维成像。利用荧光成像的下一代测序化学包括abisolid(生命技术公司(lifetechnologies))，其中模板上的测序引物与用可切割终止子荧光标记的寡核苷酸文库连接。连接后，然后使用四色通道(fitc、cy3、德克萨斯红和cy5)对珠进行成像。然后切断终止子，留下游离端以进行下一个连接-延伸循环。在所有二核苷酸组合已经被确定后，将图像映射到彩色编码空间以确定每个模板的特定碱基识别。该工作流程使用自动化流体和成像装置实现(即，solid5500w基因组分析仪，abi生物技术公司(abilifetechnologies))。另一测序胚胎使用合成测序，其中使用dna聚合酶纳入具有可切割终止子的单核苷酸池。成像后，切割终止子并且重复循环。然后分析荧光图像以针对流动池内各dna扩增子判定碱基(hiseq，illumia公司)。
根据某些方面，通过本领域技术人员已知的方法，可以扩增多个核酸以产生扩增子。扩增子可以被固定在基质内，通常位于被扩增核酸的位置，因此建立扩增子的局部群落。扩增子可以通过空间因子固定在基质内。扩增子还可以通过共价或非共价键固定在基质内。以此方式，可以认为扩增子连接于基质。通过固定于基质，如通过共价键或交联，保持了原始扩增子的大小和空间关系。通过固定于基质，如通过共价键或交联，扩增子对机械应力下的移动或解体具有抗性。
根据一个方面，诸如dna扩增子的扩增子与周围基质共聚化和/或共价连接，因此保留其空间关系以及其固有的任何信息。例如，如果扩增子是由包埋在基质中的细胞内的dna或rna生成的那些，那么该扩增子还可以被功能化以形成与保留了细胞内扩增子的空间信息的基质共价连接，从而提供亚细胞定位分布模式。
本文中所用的术语“连接(attach)”指共价相互作用和非共价相互作用。共价相互作用是两个原子或自由基之间由共用一对电子(即，单键)、两对电子(即，双键)或三对电子(即，三键)所形成的化学连接。共价相互作用在本领域中已知为电子对相互作用或电子对键连。非共价相互作用包括但不限于，范德华相互作用、氢键、弱化学键(即，通过短范围非共价力)、疏水相互作用、离子键等。非共价相互作用的综述可见于alberts等，刊于《细胞分子生物学》(molecularbiologyofthecell)，第三版，加兰出版社(garlandpublishing)，1994，通过引用将其全部内容纳入本文用于所用目的。
本文所用术语“核酸”包括具有多个核苷酸的术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”。术语“核酸”旨在包括自然产生的核酸以及合成的核酸。术语“核酸”旨在包括单链核酸环绕双链核酸。术语“核酸”旨在包括无论是单链或双链的dna和rna。本发明的核苷酸通常是自然产生的核苷酸，如衍生自腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷和胸苷的核苷酸。当寡核苷酸被称之为“双链”时，本领域技术人员应当理解的是，一对寡核苷酸以氢键存在，螺旋阵列通常与例如dna相关联。除了双链寡核苷酸100％互补形式之外，本文所用术语“双链”还意在包括具有例如凸起和环的结构特征的形式(参见stryer，生物化学,第三版.(1988)，通过引用纳入其全部内容用于所用目的)。本文所用术语“多核苷酸”指可以具有各种不同大小的核酸链。多核苷酸可以与寡核苷酸具有相同的大小，或者可以是寡核苷酸大小的两倍，三倍，四倍，五倍，十倍或更大。
寡核苷酸和/或多核苷酸可以分离自天然来源或购自商业来源。寡核苷酸和/或多核苷酸序列可以通过任何合适的方法制备，例如，beaucage和carruthers((1981)tetrahedronlett.22:1859)所述的亚磷酰胺方法，或根据matteucci等(1981)j.am.chem.soc.103:3185)的三酯方法，两种通过引用将其全部内容本文用于所用目的，或者通过使用自动化的寡核苷酸合成器的其它化学方法，或本文所述或本领域已知的高通量、高密度阵列方法(参见，美国专利号5,602,244、5,574,146、5,554,744、5,428,148、5,264,566、5,141,813、5,959,463、4,861,571和4,659,774，通过引用将其全部内容纳入本文用于所用目的)。也可以从多个供应商购买获得预合成的寡核苷酸。
在本发明的某些实施方式中，使用本领域抑制的各种微阵列技术可以制备寡核苷酸和/或多核苷酸。预合成的寡核苷酸和/或多核苷酸序列可以连接到支持物或使用下列方法原位合成：光导向方法、流动通道和点样法、喷墨法、销型方法和基于珠的方法，示于下列参考文献中：mcgall等，(1996)proc.natl.acad.sci.u.s.a.93:13555；《基因工程中的合成dna阵列》(syntheticdnaarraysingeneticengineering)，卷20:111，普莱南出版社(plenumpress)(1998)；duggan等，(1999)nat.genet.s21:10；《微阵列：制作和用于微阵列生物信息学》(microarrays:makingthemandusingtheminmicroarraybioinformatics)，剑桥大学出版社(cambridgeuniversitypress)，2003；美国专利申请公开号2003/0068633和2002/0081582；美国专利号6,833,450、6,830,890、6,824,866、6,800,439、6,375,903和5,700,637；和pct公开号wo04/031399、wo04/031351、wo04/029586、wo03/100012、wo03/066212、wo03/065038、wo03/064699、wo03/064027、wo03/064026、wo03/046223、wo03/040410和wo02/24597，通过引用将其全部内容纳入用于所用目的。
核酸可以获自文库，例如，基因组文库、cdna文库等。用于分子文库合成的方法示例可在本领域中找到，例如：dewitt等(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:6909；erb等(1994)proc.natl.acad.sci.usa91:11422；zuckermann等(1994)j.med.chem.37:2678；cho等(1993)science261:1303；carrell等(1994)angew.chem.int.ed.engl.33:2059；carell等(1994)angew.chem.int.ed.engl.33:2059；carell等(1994)angew.chem.int.ed.engl.33:2061；以及在gallop等(1994)j.med.chem.37:1233，通过引用将其全部内容纳入本文。
在某些实施方式中，核酸存在于生物样品中，如细胞或组织。
在另一个方面，基质与固体支持物联用。例如，可以这样的方式聚合基质：基质的一个表面连接至固体支持物(例如，玻璃表面)，而基质的另一个表面暴露于或夹在两个固体支持物之间。根据一个方面，基质可以包含在容器内。
本发明的固体支持物可以被制成各种形状。在某些实施方式中，固体支持物基本上是平面的。固体指示物的示例包括板，如载片，微量滴定板，流动池，盖玻片，微芯片等，容器，如微离心管，试管等的，管，片，垫，膜等。此外，固体支持物可以是例如生物的，非生物的，有机的，无机的或其组合。
本发明的实施方式还涉及在基质内扩增核酸序列，即，在基质内原位。扩增核酸的方法包括原位滚环扩增。在某些方面，扩增核酸的方法包括使用pcr，诸如锚定pcr或racepcr，又或者，以连接链式反应(lcr)(参见，例如，landegran等(1988)science241:1077-1080；和nakazawa等(1994)proc.natl.acad.sci.u.s.a.91:360-364；通过引用将其全部内容纳入本文用于所有目的)。其它扩增方法包括：自主维持序列复制(guatelli等(1990)proc.natl.acad.sci.usa87:1874，通过引用将其全部内容纳入本文用于所有目)，转录扩增系统(kwoh等(1989)proc.natl.acad.sci.us.86:1173，通过引用将其全部内容纳入本文用于所有目)，q-β复制酶(lizardi等(1988)biotechnology6:1197，通过引用将其全部内容纳入本文用于所有目)，循环pcr(jaffe等(2000)j.biol.chem.275:2619；和williams等(2002)j.biol.chem.277:7790；通过引用将其全部内容纳入本文用于所有目)或者使用本领域技术人员已知技术的任何其它核酸扩增方法。各种扩增方法述于美国专利号6,391,544、6,365,375、6,294,323、6,261,797、6,124,090和5,612,199，通过引用将其全部内容纳入本文用于所有目的。本发明的实施方式涉及在基质内原位扩增核酸的方法，其通过将基质内的核酸与诸如引物和核苷酸的试剂在足以扩增核酸的合适反应条件下接触。根据一个方面，基质是多孔的，从而允许试剂迁移到基质中，以接触核酸。
基于某些示例，提供了在基质内原位测序核酸的方法。本领域已知的常规测序方法合适其中存在核酸的基质使用，例如，通过以可逆终止子延伸的测序，荧光原位测序(fisseq)，焦磷酸测序，大规模平行测序(mpss)等(述于shendure等(2004)nat.rev.5:335通过引用将其全部内容纳入本文)。可逆终止方法使用这样的分步式合成测序生物化学，其与可逆终止和可移动荧光结合(shendure等引用如上，以及美国专利号5,750,341和6,306,597，通过引用纳入本文。fisseq方法中，dna通过下述过程延伸：向反应物添加单一类型的荧光标记的核苷酸三磷酸，洗去未纳入的核苷酸，通过测量荧光检测核苷酸的纳入，并且重复循环。在各循环中，来自之前循环的荧光被漂白或数字扣除，或者将荧光团从核苷酸切割并且洗去。fisseq在mitra等(2003)anal.biochem.320:55中进一步描述，通过引用将其全部内容纳入本文用于所用目的。焦磷酸测序方法中，焦磷酸盐(ppi)在各核苷酸纳入事件期间(即，当将核苷酸添加以生长核苷酸序列)释放。dna聚合酶催化的反应中释放的ppi通过atp磷酸化酶和荧光素酶在可以被明显检测到的偶联反应中检测。添加的核苷酸通过核苷酸降解酶被连续降解。在第一种添加的核苷酸被降解后，可以添加下一种核苷酸。随着这一过程的重复，推导较长延伸的模板序列。焦磷酸测序在ronaghi等(1998)science281:363中进一步描述，通过引用将其全部内容纳入本文用于所用目的。mpss利用基于连接的dna在微珠上同时测序。包括所有突出端的标记的衔接子混合物被退火至四个核苷酸的靶序列。在成功连接衔接子后检测标签。然后使用限制酶切割dna模板以暴露接下来的四个碱基。mpss在brenner等(2000)nat.biotech.18:630中进一步描述，通过引用将其全部内容纳入本文用于所用目的。
根据某些方面，基质内的核酸可以使用本领域已知的方法调查，所述方法包括荧光标记的寡核苷酸/dna/rna杂交，以标记的ddntp的引物延伸，连接测序和合成测序。larsson,等,(2004),nat.methods1:227-232中所述的连接的环状锁式探针可以用于平行检测多个序列靶标，然后通过锁式探针中条码序列的连接测序、合成测序或杂交测序以鉴定单个靶标。
图1显示了这样过程的示意图，所述过程在细胞内原位生成核酸的基质，然后原位扩增诸如dna或rna的核酸，原位共聚化扩增子，将扩增子共价连接至基质材料，调查扩增子，并且沿着重建的3d细胞图像以10-7m量级的dna/rna扩增子对扩增子进行成像。根据某些方面，能够用于进行本文所述方法的fisseq方法和材料在lee等,自然实验手册(natureprotocols),第10卷,3号(2015)442-458页，lee等,science343,1360-1363(2014)以及2014年2月27日在科学快讯doi(scienceexpressdoi)上发表的补充材料：10.1126/scienmce.1250212中提供，其各自通过引用将其全部内容纳入本文。
自动化测序和三维成像装置可以用于检测以三维分布的光学信号。自动化测序和三维成像装置可以用于通过荧光显微术检测光学信号。根据某些方面，通过荧光染料或诸如花青的荧光团生成荧光。根据某些方面，通过量子点或其他类型的纳米级半导体生成荧光。根据某些方面，通过诸如gfp的荧光蛋白生成荧光。自动测序和三维成像装置可以用于这些检测光学信号：自体荧光、化学发光或非荧光光学信号，如样品的光吸收特性(例如，颜色)或样品的光散射特性，例如，拉曼光谱和car，相干反斯托克斯拉曼光谱。
根据一个方面，提供了自动化测序和三维成像装置，其中使用容积三维成像方案以对三维基质进行成像。光学结构可以是直立的，倒置的，侧视图，双视图，多视图，或者具有任何其他方向以实现三维光信号的测量。该装置包括这样的硬件和软件，其功能性地组装以执行化学操控的方案(即，核酸测序)以及包含三维核酸的基质的成像，所述基质包含在合适的容器或载台。该装置可以称为流体测序显微镜，在这个意义上其包括硬件和软件以自动测序以及用于容积成像的硬件和软件。
三维测序基材可以包含在样品架内，如封闭的流动池，或者以开放孔的形式完全或部分暴露。封闭的流动池可以被认为是指具有用于成像的光学透明区域的任何固体或半固体基材以及可以建立用于液体交换目的的层流的通道。出于液体交换的目的，流动池可以具有一个或更多的入口或出口或端口。这些物理接口可以静态地或动态地偶联至流体系统，并且可以包括孔或其他储库以存储过量或储备的流体以促进分配或提取机制。样品架可以被设计成具有旨在与流体系统、光学系统或物理保持系统连接或配合的附加物理特征。
该装置可以包括用于保持样品架的载台。该载台可以使用高精度运动控制系统进行定位，如带光学编码器的线性伺服电机。光学编码器系统可以以绝对或相对的格式提供。在电极控制器读取一个或多个相对编码器的情况中，相对于极限传感器和/或物理限制，可以实施寻靶途径以提供可重复的轴定位。可以动态施加软件限制以防止样品或样品架(即流动池)与设备的其他物理方面发生碰撞或干扰。负责电机控制的电机驱动器可以通过标准通信协议(例如，rs-323、tcp/ip、udp等)与设备软件和硬件的其他方面交互，用于实现多轴协调程序的目的。
载台可以包括用于定位和保持样品架的物理机制，如具有保留机制的狭槽(例如，弹簧片或磁体)，其可再现地定位样品架/样品，用于以与流体和/或光学系统相互作用。该载台可以包括将流体装置偶联到样品架和/或样品的物理方法。可以选择载台部件以使热变化向样品或样品架引入物理变形或平移的趋势最小化。
可以选择载台部件以使化学方案期间使用的流体的化学活性最小化。
根据某些方面，该装置可以包括用于样品架追踪的机制，如通过参考id、条形码rfid标签或在样品架中包括其他可追踪标签。可追踪标签可以通过装置自动检测，如通过检测rfip或用于检测条形码的光学传感器，或者所述可追踪可以通过用户输入计算机软件系统。一种或多种类型的样品架在样品的实体组织、试剂输入/输出、成像接口和样品架的其它方面中可能不同。样品架追踪可以进一步包括用于向设备控制器软件指示样品架结构的机制，如通过引用样品架结构数据库中的索引。根据其他方面，该装置可以包含用于自动配置样品架结构的机制，如通过使用radar/lidar，包括radar/lidar芯片上的系统，或者通过机器视觉，其中样品架的物理方面被系统自动检测，解析，并用于配置与样品架的装置接口。根据其他方面，出于将装置与样品架连接的目的，装置可以利用参考图或固定装置，如用于确定样品架特征的物理位移(offset)的固定装置。
根据某些方面，该设备还包括软件接口，如命令行界面(cli)或图形用户界面(gui)，用于配置样品架定义或以其他方式配置设备与样品架之间的接口。该装置可以自动扫描样品架的成像区域，以便生成样品架内的图像区域的概览扫描。根据一个方面，出于选择测序和/或成像的样品区域的目的，经由gui将概览扫描呈现给用户。根据另一方面，该装置包含软件程序，用于自动确定样品的适当区域进行测序和/或成像，如通过计算诸如荧光强度或熵之类的度量。该设备还进一步包括计算机视觉系统或机器学习机制，用于样品架子或其部件的特征识别。
载台可以包括加热或冷却设备，其中该载台可以被加热或冷却(如通过使用珀耳帖元件的热电冷却)，如根据编程时间和温度，如用于诸如核酸杂交、扩增和测序等应用的热循环。加热或冷却设备或单元可能能够进行快速温度循环。加热或冷却设备或单元可以使用与风扇结合的散热器以使温度变化期间产生的热量散发。加热或冷却设备或单元可使用暖气片和液体冷却/循环系统以使温度变化期间产生的热量散发。加热或冷却设备或单元可以使用温度传感器或热敏电阻作为向控制系统提供温度反馈的方式，该控制系统可以是微控制器或其它电子电路。
该装置可以包括流体分配器或流体单元，其中液体试剂的编程体积被分配至载台上的样品架(如至载台上的孔或流动池)以及分配至包含三维核酸的基质。流体分配器或单元可以包括温度控制(如通过使用珀耳帖元件的热电冷却)以将试剂存储在一致的温度下，并且可以实施液体或水冷作为散热的手段。诸如注射器泵之类的泵可用于通过流体分配器递送流体试剂。根据某些方面，基于流体和压力的流体分配可由液体容器内部和外部之间的压力差驱动。例如，加压的瓶子可以连接到电动阀门，如通过一根管子，从而当阀门打开时，流体通过管子并通过阀门被驱动到开放孔中的样品或者进入封闭的流动池。在某些方面，两种或更多种试剂可以从相同的阀门分配到样品架。这些试剂可以在阀门的上游通过另一个阀门(例如，旋转阀)或其他物理手段选择。在其他方面，阀门可以通过两条可选线路寻址，这样一条线路可以递送水或另一种意在冲洗以其他方式清洁分配器之间阀门的液体。储库或吸收材料可以静态地或动态地定位在阀门下方以在灌注和清洁操作期间收集冲洗溶液或试剂。
在某些实施方式中，封闭流动池中的液体交换可以发生在完全闭环系统中，其中管以固定的方式连接到流动池并且阀门和泵的系统(或其他产生压力的装置)控制递送至流动池的试剂的移动和选择。封闭的流动池可被设计成允许非接触式试剂分配到样品通道外部的孔中。这样的孔可以被设计成其具有的体积适合于部分或完全取代含有样品通道的体积。然后，分配的试剂进入流动池的运动可以通过施加在孔上的正压或通过施加在样品通道相对端的出口上的负压驱动。产生吸力的装置和流动池之间的接口可以是瞬时的或固定的，并且可以通过运动坐标轴系产生或调节，诸如通过步进电机、伺服马达或螺线管驱动的那些。接口还可以进一步通过吸盘装置的存在来限定，其被设计成产生并维持一致的密封，同时最小地扰动样品的物理定位。
在其它方面，具有开放孔的样品架可以被设计成具有用于容纳分配的试剂以及提取的特征以使样品扰动最小化，如通过包括被设计成隔绝来自样品的更高水平液流的通道、狭槽或其他物理区域。开放孔可以另外具有倒角或其他锥形的侧面，以适应光学系统接口的特定形状，例如通过匹配光学物镜的侧面轮廓。
根据压力驱动的流体区块(fluidicsblock)的某些实施方式，试剂的多个不同的管位于加压容器内，各自连接到其阀门，因此当启动任何一个或多个阀时，流体被从管经由阀门驱动到样品上。阀门可以是一种或多种一般类型，包括但不限于电磁阀门、旋转阀门和微流体阀门。可以选择阀门以使精度最大化和/或使死体积最小化。根据某些方面，为使与试剂干燥和/或堵塞相关的问题最小化，阀体可以将致动机制尽可能地靠近孔口放置的方式设计。阀门可以具有上游过滤器、筛网或防止非液体材料堵塞或干扰阀门操作的其他方式。使用这种压力驱动的系统分配试剂的量基于阀门内径、液体粘度、压差和阀门致动的时间来确定，并且可以根据经验确定以及用于设置软件控制器，从而使得所需体积转换成阀门打开或启动的时间长度(给定具有特定液体粘度、阀门内径和加压的特定硬件配置)。根据某些方面，可以单独地或共同地对试剂容器进行加压。。理想地，加压介质是诸如氩气的惰性气体。流体系统可以结合泵驱动的和压力驱动的流体部件。该装置可以包括混合器，用于混合编程体积的液体试剂。本文所述抽吸系统用于通过使用泵或真空源对液体施加抽吸力来从流动池中移除流体。通过在如上的压力下引入新的试剂以替换流过管道的现有流体，基于压力的分配也可以用于在测序期间交换流体。基于压力的分配可以与吸入一起使用以交换流动池中的液体。
根据一个方面，装置可以包含储库，用于储存批量试剂(bulkreagent)或具有较大体积的试剂。根据一个这样的方面，批量试剂储库可以包含封闭容器内的一个或多个加压容器。根据另一个这样的方面，批量试剂储库可以包含加压封闭容器内的一个或多个容器。根据一个方面，出于延长一个或多个试剂寿命和活性的目的，批量试剂储库是温控的，如通过使用珀耳帖元件的热电冷却。加热或冷却设备或单元可以使用与风扇结合的散热器以使温度变化期间产生的热量散发。加热或冷却设备或单元可使用暖气片和液体冷却/循环系统以使温度变化期间产生的热量散发。加热或冷却设备或单元可以使用温度传感器或热敏电阻作为向控制系统提供温度反馈的方式，该控制系统可以是微控制器或其它电子电路。可以连接批量试剂储库，诸如通过分裂的隔板，从而可以轻松更换单个储库。其它连接物类型包括但不限于鲁尔锁(luerlocks)，1/428，minstack(lee公司)。
该装置可以包括从流动池提取液体的机制。根据一个方面，通过诸如主泵或注射器泵的泵产生真空，用其吸入流动池(如开放孔或部分封闭的流动池)中包含的液体。根据一个方面，使用机动化的吸管来接触样品架或其中的液体以提取液体。进一步根据这个方面，机动化的吸管可以包括气动、伺服或步进电机，位置编码器和机电控制器系统。该装置可以包含一个或多个废液贮存器(repository)，出于临时储存的目的将废液或提取液引入其中。废液可以通过泵或诸如旋转阀门的阀门的方式引入。废液贮存器可以包括反馈系统，用于在达到某水平后自动通知用户。根据试剂的性质，可以将废液引入一个或多个贮存器，以防止不希望的化学反应，或根据适用的程序、法律或法规促进下游处置。
该设备可以包括覆盖一个或多个流动池、孔、样品架和/或载台的机制，用于防止气载颗粒累积和/或防止液体试剂蒸发的目的。根据一个方面，该装置包含机动化流动池盖，其使用一个或多个运动轴将气密盖定位在一个或多个流动池、孔、样品架和/或载台上。根据另一个方面，载台包含动态可扩展盖。根据另一个方面，该装置包含静态盖，其能够与机动化载台接合，用于密封孔和/或样品架的目的。
该装置可以包括光学组件，其包括一个或多个光学轴。该装置可以包括一个或多个检测器，如大面积检测器，用于包含三维核酸的基质的容积成像。检测器可以是相机，并且具体的，具有针对高速、低噪声科学成像而定制的物理属性的相机，如scmos相机。在这样一个实施方式中，为了达到和/或保持样品聚焦，基于反射的自动聚焦系统提供了对光轴的闭环控制。在另一结构中，微控制器、fpga或其他计算设备可以使用一种或多种图像分析算法来提供软件对焦和定位反馈，如mario,a.bueno,josuealvarez-borrego,和l.acho."使用一维傅里叶变换和皮尔森相关的自动对焦算法(autofocusalgorithmusingone-dimensionalfouriertransformandpearsoncorrelation)."第5届伊比利亚美洲光学会议和第8届拉丁美洲光学，激光及其应用会议(5thiberoamericanmeetingonopticsand8thlatinamericanmeetingonoptics,lasers,andtheirapplications).internationalsocietyforopticsandphotonics,2004中所述，通过引用将其全部内容纳入本文。这样的自动化样品定位可以包括与成像系统联合的一个或多个运动轴的坐标系。样品定位可以说明成像过程中样品位置的物理偏移，并且可以容许比单个图像帧中捕获的视场更大的偏移。该装置可以这样实施映射平面表面的方法，从而不需要实时自动对焦。这样的系统可以包括使用基于反射或基于软件的自动对焦系统来对样品表面三个或更多个点进行采样，然后将这些点拟合到固体基材的表面几何形状或平面的方程。该拟合过程可以涉及排除基于自动聚焦信号数据的一个或多个点，其残差(residual)作为回归分析的结果，或指示其作为数据点适合性的其他因素。该拟合过程可以包括针对与样品固定介质一致的表面变化的容差，因此最终表面图可以包括从完美平坦平面的局部偏差以反映实际基材表面中的变化。如图12所述，根据一个方面，该装置包括用于将样品架表面相对于一个或多个运动轴映射的系统，从而相对于成像系统对样品进行可再现的定位，包括以下步骤：1)使用自动对焦系统，如激光反射自动对焦机制，以获取光学系统和样品之间的一个或多个距离测量值，和2)沿着一个或多个运动轴，计算相对于位置编码器的一个或多个位移，其在图像采集期间使用。
该设备可以使用基于图像的软件程序来确定、调整、校正和/或跟踪样品的位置。根据一个方面，出于沿着一个或多个维度计算位置偏移的目的，将图像数据计算地记录至参照。进一步根据这个方面，使用诸如离散傅立叶变换(dft)或快速傅立叶变换(fft)的傅立叶变换(ft)计算两个或更多个图像或图像体积之间沿着一个或多个维度的偏移。根据一个方面，计算子像素偏移，诸如通过使用放大的(upscaled)dft。根据一个方面，沿着一个或多个维度计算平移偏移。根据一个方面，沿着一个或多个维度计算旋转偏移。根据一个方面，出于用图像分析辅助位置追踪的目的，使用包含在样品架、流动池、孔或样品内的特征或基准标记物。特征或基准标记物包括制造入或添加到样品架、流动池或孔中的特征，如雕刻特征、激光雕刻特征、印刷特征、沉淀特征、微触印刷特征、珠和一个或多个维度内其他类型的图案。根据一个方面，将基准标记物嵌入样品中，如嵌入3d水凝胶中。根据一个方面，基准标记物是显微镜珠，其可以是荧光的或自发荧光的。根据一个方面，特征是形成样品架一部分的固体基材的一个表面的一个方面。根据某些方面，特征是样品架不同表面的一个方面，而不是包含样品的表面。在一个实例中，流动池被理解为在上表面上包含两个或更多个开放孔的载片，其中用作基准标记物的珠粒在载片的上或下表面上沉淀。
微控制器系统在xyz轴与照明/激发光源和相机传感器一起协调运动系统，因此运动系统相对于光学系统定位样品，然后在该位置使用同步的照明以快门捕捉或滚动快门或“所有线路发射”卷帘快门捕捉获取图像数据。在其他情况中，沿着一个或多个轴的运动与沿相机传感器的线的捕捉同步，因此样品不需要到达相对于光学系统的静止位置。通过低延迟通信协议(例如，数字ttl、i2c、rs-232、udp、tcp/ip)实现软件和硬件交换协议以在子系统之间协调，例如，初始轴运动或触发相机曝光。
该设备可以包括一个或多个用于成像的物镜。在某个方面，该设备可以包括一个物镜。在某个方面，该设备可以包含两个物镜。在某个方面，该设备可以包含三个或更多个物镜。物镜可以是水浸透镜，油浸透镜，浸水透镜，空气透镜，折射率与其他成像介质匹配的透镜或折射率可调的透镜。在某个方面，该装置包含单个浸水物镜，其通过消除在具有不同折射率的两种介质(例如气-水界面或水-玻璃界面)之间界面处发生的折射率失配而提供更高的图像质量。
在包括折射率与空气不匹配的一个或多个物镜的方面中，物镜必须与成像介质(如水、油或其他成像缓冲液)接合。在这些方面中，该装置可以包括润湿物镜或以其他方式在物镜与成像介质之间形成接触的机制。镜片润湿的某些机制包括将镜片浸入成像介质中或以其他方式将成像介质分配到镜片上，如通过注射器、针形阀或对那些分配液体试剂领域技术人员已知机制。在某个方面，出于在物镜和液体界面之间产生入射角以将液体沉积到物镜上而不形成气泡的目的，该装置将一定量的液体分配到孔中。在另一方面，该装置将一定量的液体分配到物镜上，如通过使用注射器或针形阀，而不形成气泡，如通过控制液滴与物镜之间的速度和入射角。
在液体成像介质中成像期间，气泡可以形成在物镜上，样品内或物镜和样品之间；包括在开放的流动池中或通过位于封闭的流动池中的玻璃界面进行成像的设备。该设备可以包含检测在物镜上形成的气泡、或物镜和样品之间存在的气泡的机制。气泡检测的机制包括经由光散射的检测；通过图像分析，例如，通过测量被气泡扰动的光学系统的点扩散函数；通过连接到计算机系统的外部机器视觉，如通过相机或其他成像系统观察镜头，所述计算机系统具有编程用于检测镜头上气泡的软件。该装置进一步可以包括用于消除形成在物镜上的气泡的机制。根据一个方面，该装置包括用于使物镜与吸液针接触的机制，所述吸液针移除物镜上存在的任何液体。根据一个方面，该装置包括用于使物镜与吸收性材料接触的机制，所述吸收性材料吸收物镜上存在的任何液体。该装置可以包括用于将物镜的液体干燥或去除的机制。该装置可以执行软件和硬件程序，用于在检测到气泡时从透镜去除和替换液体成像介质。该装置可以包含用于在物镜上、样品内或者物镜与样品之间检测到气泡时提醒用户的机制。
在操作该装置的过程中，物镜可能积聚污垢、灰尘、沉积的盐或其他试剂溶质或干扰成像的其他类型的材料。该装置可以包含用于检测此类干扰的机制，经由光散射或光和干扰材料之间相互作用的其它性质；通过图像分析，例如，通过测量被干扰材料的存在扰动的光学系统的点扩散函数；通过连接到计算机系统的外部机器视觉，例如通过相机或其他成像系统观察镜头，所述计算机系统具有编程用于检测镜头上干扰材料的软件。该装置可以进一步包含用于清洁透镜的机制。据一个方面，该装置可以包括透镜清洁试剂，出于清洁透镜的目的将其分配到透镜上，诸如通过注射器或针形阀或通过将物镜浸入分配到孔的清洁试剂中，或分配到用来接触物镜的非研磨材料上。该装置可以包含用于在物镜上、样品内或者物镜与样品之间检测到干扰材料时提醒用户的机制。
该装置包括一个或多个光学光程。该装置可以包含光学器件，用于校正光学系统的某些部件和样品或成像介质之间的折射率失配的目的。该装置可以包含光学器件，用于校正光学系统内其它类型光学失真(如球面或色差)的目的。该装置可以包含检测光学失真的机制，如通过使用与软件结合的图像传感器来检测光学系统的点扩散函数或光学系统的其他性质的变化。根据一个方面，该装置包括一个或多个光束表征相机。根据另一个方面，在装置操作之前、期间或之后，该装置可以包含自动或手动程序，用于测量系统的点扩散函数或其他光学特性并提醒用户，或参与用于校正光学失真的机械、机电、或光学系统。根据某个方面，该装置包含自适应光学系统(ao)，其被用于通过减小波阵面失真的影响来改善光学系统的性能为了补偿失真，自适应光学器件可以通过使镜子变形来校正入射波阵面的变形。自适应光学系统可以包括可变形反射镜、图像传感器以及硬件和软件反馈系统。根据一个方面，自适应光学系统包含波阵面传感器，诸如夏克-哈特曼(shack-hartmann)波阵面探测器。自适应光学系统和其他校正光学系统可以是开环的，其中在由校正器校正之前测量误差。自适应光学系统和其他校正光学系统可以是闭环，其中在由校正器校正之后测量误差。自适应光学器件可以用于通过校正样品内的光学像差来改善3d样品内的图像质量。
为了控制和协调流体、光学和运动相关事件的时间，该装置可以包括一个或多个机电的、电子的或完全计算机化的系统。诸如电动机控制器、温度控制器、气动控制器、阀门控制器、相机、光学调谐或门控系统、传感器和其他电子系统的装置子系统为了这样的协调可以利用各种通信协议。通信协议可以基于延迟、互操作性、机电约束或其他基于应用的考虑来选择。子系统可以符合一致的或明确定义的应用程序接口(api)，使得它们可以从通用计算机或人机界面单独寻址和/或操作。
诸如相机、共焦光学系统、照明装置、aotf、机械快门等的光学系统以及单轴或多轴运动控制系统的定时可以由微控制器、马达控制器、电子电路和/或计算机化系统来协调。可以优化光学传感器曝光时间，使得运动控制移动与诸如像素读取/读出或背景测量之类的非测量传感器事件重叠。可以实施光学照射时间(例如，激光照射门控)，因此其与特定的光学传感器事件(例如，读入/读出)相关联，以使样品暴露于激发光最小化。可以进一步优化出于光学成像目的的单轴或多轴运动控制，以解决用于连续运动应用的传感器曝光方案(例如，卷帘快门曝光)。在某些特定成像方案下，例如，时间延迟积分(tdi)，可以在采集成像数据期间执行持续轴运动。
在某些方面，可以选择多轴运动控制的维度顺序(当与光学成像偶联)以使帧到帧的移动时间最小化。例如，通常的情况是，垂直轴(即，z轴或光轴)移动时间是最快的，所以希望在是在一系列“z堆叠”中进行三维成像，其中获得帧的同时垂直轴被向上或向下驱动。为了获得图像数据的全部三维体积，沿着x/y平面或平面样表面重复进行z堆叠。
在一些情况中，可能需要对本质上不是长方体的三维体积进行成像。在这些情况中，可以采用基于物理或工程单位的三维坐标系来确定任意的三维成像位置，然后将其散布到参与运动控制(participatingmotioncontrolandimagingsystems)和成像系统。采用这样的系统允许进行排他性地限制到存在感兴趣的样品体素的三维基质区域的成像。
可能希望以特定空间采样频率对体积进行成像。在某些方面，沿着一个或多个轴成像的采样频率相对于光学系统的奈奎斯特频率确定。在某些实施方式中，使用40x1.0na物镜获取的图像数据以约500纳米的间隔在轴(z)轴上采样。在另一方面中，对沿着一个或多个轴成像的采样频率进行过采样，如通过采集图像数据或对样品体积的相同区域进行两次采样。进一步根据这个方面，对体积进行过采样可能促进计算容积重建，如出于体积图像拼接的目的在相邻图像帧中提供冗余图像数据。在某个实施方式中，获得的图像数据具有沿着一个或多个轴10％的重叠，沿着一个或多个轴20％的重叠，或者沿着一个或多个轴30％或更多的重叠像素数据。
该装置可以包括超过一个的载台、流体单元和/或光学细胞，因此各样品架和/或样品可由多个系统寻址。在这样的方案下，对于某些硬件资源的访问必需被共享，并且因此需要进行物理资源分配和调度系统。这样的调度系统可以是被动或主动的，并且可以包括预测建模，作为基于每个样品基于未来流体和光学成像需求来预测和调度硬件资源访问的手段。调度系统的其它方面可以允许外部事件，如由用户或外部计算机系统执行以中断或以其他方式修改流体成像系统活动的外部事件。在这样一个方面中，物理媒体存储系统可能变满并且不再能够存储获取的图像。在外部用户干预之前，这样的事件可能会导致装置上成像活动的停止。在另一方面，用户可能想要将样品架中的样品添加到装置载台上的狭槽中。用户可以通过hmi，图形用户界面或使用物理按钮暂时暂停或以其他方式修改装置的操作状态以允许添加样品架。
该装置可以通过经由本地软件库由网络连接开放的命令行界面、图形用户界面或应用程序编程界面(api)来操作和以其它方式编程。用户可以进行活动，其包括但不限于：装置的物理配置，测试和校准任务，样品架和样品的定义生成和修改，流体操控和常规规范，光学测量和常规规范，测序方案开发，以及与一般流体学、光学成像和运动控制相关的其他任务。该装置可能包括能够实时分析成像数据的硬件或软件，如在gpu上运行的fpga或用户空间软件，其允许进行诸如三维图像对齐，目标发现，信号处理或测量等活动，以及测序和光学样品分析所要求的其他图像分析任务。该装置可以包括被设计成用于本地存储图像数据的硬件和软件。该设备可能是被设计成收集、分析、存储和可视化三维成像和测序数据的装置和服务的网络的一部分。该网络可以包括物理上位于同一地点的硬件以及云计算系统。在某些实施方式中，它可以执行与第三方硬件和软件接口的开放标准。
应该理解的是，装置包括用于使本文所述的扩增和测序过程自动化的软件。进一步应当理解的是，本文所述硬件部件可以全部或部分地商购。
根据一个方面，由丹纳赫集团(danahercorporation)制造的被称为“pollinator”的市售可得的测序装置可以用于本文所述的测序方面，并且可以经修改以包括本文所述用于容积成像的硬件。
还通过以下实施例说明本发明，这些实施例不应构成限制。贯穿本发明中所引用的所有参考文献、专利和公开专利申请的内容通过引用全文纳入本文并用于所有目的。
实施例1
自动化测序和三维成像装置的操作部件。
图2是本公开自动化测序和三维成像装置操作部件示意图的透视图。应该理解的是，可以将其他部件添加到该装置，包括壳体元件。如图2所示，自动化测序和三维成像装置包括激光共焦头外壳(headenclosure)，其包括针孔阵列，以及相机检测器，用于接收来自样品的光。这样的硬件配置允许对包含三维核酸的基质进行容积成像。该设备还包括具有基于反射的自动对焦至激光共焦头外壳的光程。该装置还包括加压流体区块上的温控流体头，其用于向样品提供一种或多种试剂。提供了可操作连接的批量流体(bulkfluidcs)阀门以及吸引管，用于将液体从样品去除的。提供了具有温控和xy运动系统的样品载台，并且以玻璃载片样品架示出。用于载台运动且带有线性编码器的轨道可操作地连接载台。提供了针对无氧(氩气)环境的外壳门(door)，外壳的其余部分未示出。该装置处于防震基座上
图3是本公开自动化测序和三维成像装置操作部件示意图的正视图。该设备包括光程，其包括基于激光反射的自动对焦以及激光共焦头。示出用于批量试剂分配的批量试剂阀门阵列(未示出加压批量试剂储存)。示出用于试剂区块温度控制的珀耳帖元件和散热器(示出)或液体冷却，其连接到用于基于压力的流体分配的流体区块。示出用于将液体从流动池中去除的浸入式(dipping)吸引管。提供了电子设备，用于阀门驱动和流体区块温度和压力控制和反馈。示出阀门阵列，其连接流体区块。提供了用于承载样品的载台，其具有通过珀耳帖元件和散热器(示出)或液体冷却的温度控制。提供了用于载台运动和温度控制和反馈的电子设备。提供了用于载台运动的轨道，其具有用于定位反馈的线性编码器。示出具有显微镜物镜的光轴。示出针对开放的流动池的浸入式物镜。提供了针对无氧(氩气)环境的外壳门(外壳的其余部分未示出)。该装置包括振动控制刚性基座。由图3所示，用于3d测序基质容积成像的装置沿着用于图像采集的单一光轴利用两个独立的载台以及两个独立的流体系统。实践中，图像采集是暂时的限制步骤。无论针对每个碱基测序生物化学和流体需要多长时间，每个碱基的时间是固定的(例如，2小时)，但是成像时间与正在进行成像的体积大小成正比。通过使用两个载台，各载台独立地运转并且以独立的流体运转，其中一个载台进行生物化学/流体，而另一个进行成像。因此，该系统始终有效地准备进行成像，并且固定的生物化学时间实际上为零，因为系统从未等待流体完成以进行下一步，而是始终准备成像完成。相比2d光学扫描，扫描时间可能会是3d光学扫描的问题，因为2d扫描时间由于扫描区域增长到二次幂，而在3d扫描中时间由于扫描体积增长到三次幂。沿着用于图像获取的单一光轴的两个独立的载台和两个独立的流体系统这样的配置同样是成本有效的，因为相较于光学子系统，具有运动/温度控制的载台以及流体子系统相对便宜，所述光学子系统需要昂贵的光学器件，相机检测器，数据采集电子设备(例如，帧接收器硬件，用来捕获来自相机的图像数据)，以及用于荧光激发的激光源。
图4是本公开装置的透视图。提供了激光扫描共焦头和相机检测器。提供了弯曲进入共焦头的光程光。示出了显微镜物镜，例如浸入式浸液物镜，用于与样品的折射率完美匹配以进行高保真度成像。提供了用于捕获基于发射的自动对焦系统的反馈光信号的镜子示出开放的流动池，其被插入载台。提供了z轴线性电机，其具有线性编码器反馈，用于z运动和穿过样品的物镜焦平面z扫描。位于z轴线性电机后的是基于反射的自动对焦系统(不可见)。示出加压和温控的流体区块。提供了用于流体分配的阀门。示出加压流体区块内用于分配的装有试剂的管。
图5是根据本公开的载台的透视图。提供了针对珀耳帖冷却器的散热器，用于载台温度控制。流动池基座以标准1x3英寸1mm厚的玻璃显微镜载片示出，其上附着有3d测序文库基质。3d测序文库基质附着在孔的内部。开放形式的流动池的流体孔部件以2孔的形式示出。开放形式的流动池避免了不规则三维基质上的层流以及气泡的问题，其将会导致进出3d测序文库基质的试剂不均匀扩散。提供了弹簧承载的定位点，用于可再生载片定位。流动池接触热循环载台顶部。提供了用于可再生载片定位的轨道系统，其向载片提供了2d导向力(向下并且沿着载片的一个长边)并且保护样品。提供了用于可再生载片定位的定位点。在一个实施方式中，流动池由一系列的开放的腔室或孔组成。试剂通过流体系统从顶部分配到孔中，并且通过吸引管去除。针对3d基质样品，开放的孔形式是优选的，因为在顶部和底部封闭的格式可能会遇到与流体动力学相关的问题，如在不规则形状的3d基质上的不均匀层流，以及由在动态流场中产生的涡流而引入或捕获气泡。通过一个或多个光轴，开放的孔形式适用于直立(从顶部)显微镜方案，其中将物镜物理浸入诸如成像缓冲液的成像介质中，使光学系统与样品之间(例如，空气/玻璃界面)的折射率失配最小化或消除。
图6的示意时序图出于实现优化成像帧率的目的，阐述光学成像、照明、运动控制和获取系统之间协调的示例。
图7是示意框图，出于优化实时协调协调光学成像、照明、运动控制和获取系统的目的，阐述了ttl通信结构示例。
图8描述了针对测序装置流体、成像和双载台子系统的时序和资源使用时序图。该图描述了具有两个独立运动载台的装置，其容纳样品架、两个被称为“左”和“右”的独立的流体系统，以及单一成像轴。控制器操控运动载台，因此在时间＝0处，两个载台进行流体途径(fluidicroutine)。在时间＝1处，在载台1上采集来自样品的图像数据，而载台2进行流体途径。在时间＝2处，已经完成载台1的图像数据采集，并且已经完成针对载台2的流体途径。在时间＝3处，在载台2上采集来自样品的图像数据，而载台1进行流体途径。在时间＝4处，已经完成载台2的图像数据采集，并且已经完成针对载台2的流体途径。
图9描述了针对双载台、流体和成像子系统阐述控制器组织的示意框图。控制器同步如图8中所示的事件时序。
图10描述了用于控制物镜状态并且与物镜结合的装置系统。附图100涉及描述干物镜(105)和湿物镜(110)，所述湿物镜(110)包括具有成像介质(115)液滴的物镜。成像介质包括水性成像缓冲液，如水和防褪色剂，以及油和其他类型的成像液体。附图200描述了用于使物镜湿润或干燥的设备的配置，如用于从物镜去除气泡或用于清洁物镜的设备；描述载体(220)，其可以是装置的固定装置或可消化插入物(consumableinsert)，其进一步包括用于将试剂(235)沉积到物镜上的模式(230)，如孔或试剂分配设备，并且还进一步包括用于从物镜去除液体的模式(240)，如非研磨性吸收材料或吸取端口。附图300描述了用于降液体沉降到物镜上的途径，其包括这样的步骤：在液体湿润模式上形成液体界面(310)，将物镜与液体界面接触(320)，通过将物镜或物镜湿润模式平移，从而润湿物镜(330)。附图400描述了用于从物镜去除液体的途径(410)，其包括步骤：平移物镜或干燥模式，以使得干燥模式接触形成界面的液体(420)，从而液体被吸收或以其他方式被吸入干燥模式，产生没有液滴的物镜(430)。
图11描述了用于样品随时间相对于成像轴的可重复xyz定位的流程图。在固体基材可能随时间偏移的情况中，用于确定样品架偏移的该系统可以提高样品与成像系统之间随时间的xyz定位重复性的准确性。在成像初始化时，设备将位置1移动到成像轴下并获取初始图像数据，并将其传输到计算机系统。计算机系统计算相对于参照图像数据集的物理位移，将其传送至测序装置并储存。如循环510所示，测序装置可以重复这样的步骤直到计算机系统接受到的物理位移小于阈值量，例如，直到计算机系统确认装置储存的对应位置1的物理位置信息相对于参照位置状态是在给定物理偏移之内。
图12描述了用于映射包括固体基材的样品架表面的系统。在固体基材可能随时间偏移并且特定自动对焦系统可能具有某些故障率的情况中，用于映射样品架表面的该系统可以提高样品与成像系统之间随时间的z定位重复性的准确性，例如通过舍弃由自动对焦系统确定的z位移中的异常值。该系统还可以增加图像采集速度，因为针对运动系统的预计算物理位移可以比允许自动对焦以在各潜在成像位置实时确定物理位移限制快很多。包括附图610、650和700的组图600描述了装置状态的图。在附图610中，物镜(620)相对于诸如玻璃、硅、金属、塑料或另一种固体材料的固体基材(630)定位，其被认为固定已安装的样品，如fisseq水凝胶。该描述包括基于激光的自动对焦装置，其发射激光(640)至固体基材，以便确定物镜与固体基材之间的距离，如通过分析来自表面的激光反射。附图650描述了附图610的侧视图，其中，当确定物镜聚焦于固体基材上时，物镜和固体基材之间的距离680对应已知值，如物镜的焦距。附图700描述了在固体基材(720)上以1、2或3个轴(715描述了三个可能的运动轴)扫描物镜(710)，因此在各扫描位置(730)测量z自动对焦位移。附图900描述了表面扫描期间针对装置和计算机系统行为的流程图，其中，如在阵列中所示，物镜位于位置k，并确定z位移并储存。采样多个位置后，将z位移传递至计算机系统，计算机系统计算物理位移，例如通过将自动对焦位移拟合至平面。将物理位移传递回测序装置，测序装置将其处理以获取具有准确z物理位移的3d成像数据。附图800描述了拟合至平面的自动对焦z位移的图，用于确定准确的物理z位移的目的。
本文公开方法的应用可采用常规生物学方法、软件、计算机和计算机系统。相应地，本文所述方法可以全部或部分是计算机实现的方法。在本公开的方法中利用的计算机软件包括具有用于执行本发明方法逻辑步骤的计算机可执行指令的计算机可读介质。合适的计算机可读介质包括但不限于软盘、cd-rom/dvd/dvd-rom、硬盘驱动器、闪存、rom/ram、磁带和其它可以使用的计算机可读介质。计算机可执行指令可以用合适的计算机语言或几种计算机语言的组合来编写。本文所述方法还可以各种目的利用各种市售可得的计算机和计算机程序产品和软件，包括获得光强度并将其处理成数据值，试剂递送的自动化，诸如热循环等反应条件的自动化，包括样品架和样品的载台移动的自动化，以及处理和储存光强度数据，以及本文所述其它方法和方面。
本公开的方面涉及分析三维聚合基质内多个核酸的方法，其包括：扩增多个核酸以在基质内产生扩增子，将扩增子与基质共价地结合，使用光学测序方法对多个扩增子进行测序，其中将多个扩增子用可检测的标签标记，并且对多个扩增子进行容积成像以产生多个扩增子的三维成像数据，其中光强度数据被处理成三维容积图像。根据一个方面，多个核酸包含在生物样品中，并且向生物样品中导入基质形成材料。根据一个方面，多个核酸包含在细胞中，并且向细胞导入基质形成材料。根据一个方面，多个核酸包含在组织样品中，并且向组织样品中导入基质形成材料。根据一个方面，三维成像数据鉴定细胞内多种扩增子的相对位置。根据一个方面，使用荧光原位测序对多个扩增子进行测序。根据一个方面，使用下述一种或多种对多个核酸进行容积成像：3d结构照明，选择性平面照明显微术，光层照显微术，发射操控，使用针孔共焦显微术的容积成像，使用孔径相关共焦显微术的容积成像，使用来自切片的容积重建的容积成像，使用解卷积显微术的容积成像，使用像差校正多焦点显微术的容积成像，使用数字全息显微术的容积成像。
本公开的方面涉及自动化测序和容积成像装置，其包括多轴载台或定位系统，其包括用于包含三维核酸的基质的样品架，加热或冷却设备，其操作性地连接载台，由此该加热或冷却设备针对用于扩增和测序的热循环的时间和温度可编程，流体分配器，其经定位以将一种或多种试剂分配到样品架中，其中，所述流体分配器与用于容纳一种或多种试剂的一个或多个储库流体连通，由此该流体分配器是可编程的，用于将编程体积的液体试剂分配到样品架中，泵，其操作性地连接至流体分配器，由此该泵经由流体分配器从一个或多个储库推动(force)或抽取(withdraw)一个或多个试剂，光学组件，其包括一个或多个光学轴，一个或多个检测器，其被定位成与样品架受光通信(inlightreceivingcommunication)，由此该一个或多个检测器接收光强度信号，其被处理成核酸样品的三维容积图像，以及一个或多个带有软件的微处理器，其用于向样品架自动化或受控的导入试剂、对样品架进行热循环、以及图像检测和获取。
参考文献
各参考文献通过引用其全部内容纳入本文用于所有目的。
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