相关申请的交叉引用
本申请要求2016年1月5日提交的欧洲专利申请号16150221.6和2016年8月3日提交的欧洲专利申请号16182485.9的权益，所述欧洲专利申请以引用的方式整体并入本文。
发明领域
本发明涉及一种用于发酵糖的方法。更具体地说，本发明涉及一种使用右旋糖母液(greens)作为碳源来发酵糖的方法。
发明背景
淀粉可容易地从多种植物来源获得，所述植物来源如玉米、小麦、水稻、马铃薯以及大麦。它由大量通过糖苷键连接的葡萄糖单元组成，并且因此可被水解以产生富含葡萄糖的组合物(有时也被称为“右旋糖”)。此类组合物通常通过涉及液化和糖化的酶过程获得(但是它们也可通过酸转化或两者的组合获得)。
在液化过程中，通过向淀粉浆(例如，约35％干燥固体，100℃和5.8的ph)中添加热稳定的α-淀粉酶来将淀粉分子凝胶化并转化为多糖和低聚糖(也称为低聚多糖或葡萄糖低聚物)。然后通过任选地与淀粉脱分支酶(例如，支链淀粉酶)一起添加(例如在约60℃和4.5的ph下)葡糖淀粉酶来将糖在糖化过程中转化为葡萄糖。通过这种方法获得的组合物被称为“淀粉水解产物”。所述淀粉水解产物可通过真空过滤、离子交换去矿物质和脱色进一步精制以除去杂质，如盐、蛋白质、脂质、有机酸和纤维。它们也可被浓缩至例如约70重量％的干固体含量。
淀粉水解产物通常含有95重量％或更高的葡萄糖(基于总干重)。它们还含有一些残留的低聚糖。它们可用作发酵的碳水化合物来源(参见例如wo2005/100583)并且通常用作生产结晶右旋糖的原料。呈一水合物形式的d-葡萄糖是通过缓慢冷却淀粉水解产物(从50℃至30℃，在2至3天内)而产生。无水d-葡萄糖是通过在真空下蒸发结晶(在65℃下)而产生。无论使用何种方法，葡萄糖的除去或回收都留下液体副产物。这种副产物被称为“葡萄糖母液(greens)”(或“母液(motherliquor)”)并且通常作为低质量、低成本的副产品销售给动物饲料工业。然而，它们仍然相对富含碳水化合物(包括葡萄糖和低聚糖)。
已经做出许多尝试来回收这些残余碳水化合物的价值。例如，wo2014/047418描述了一种包括含葡萄糖溶液(如淀粉水解产物或母液)的膜过滤和酶处理以提高葡萄糖生产的产量的方法。wo2010/086840描述了一种通过向发酵培养基中添加解聚酶和木糖异构酶来增强来自糖蜜发酵的乙醇产量的方法。
本发明的一个目的是提供右旋糖母液的替代用途，该用途将允许实现其碳水化合物含量的全部价值。这是通过发酵实现的。
在商业上大规模使用发酵过程来生产有机分子，如乙醇、柠檬酸和乳酸。在那些过程中，将碳水化合物进料至能够使用它来生产所需的发酵产物的生物体。一起选择碳水化合物和生物体以使得所述生物体能够有效地发酵碳水化合物以形成良好产量的所需产物。葡萄糖是理想的碳水化合物来源，因为它可通过大多数微生物容易且有效地发酵。其他低聚糖和多糖也可进行发酵，但通常仅非常缓慢且低效。
由于其相对高的葡萄糖含量，淀粉水解产物已被认为是用于发酵的良好葡萄糖来源。相反，由于它们的降低的葡萄糖含量和高得多的低聚糖含量(基于总干重为10重量％-30重量％)，所以右旋糖母液不被认为是良好的来源。事实上，已知发酵培养基中低聚糖的存在会降低发酵产量并使发酵产物的回收和纯化复杂化。因此它被认为是费用令人望而生畏的。
本发明的目的是克服这些障碍、通过发酵充分利用右旋糖母液的碳水化合物含量并改进下游加工。
发明概述
在本发明的第一方面中，提供一种用于在能够将葡萄糖发酵成发酵产物的微生物存在下发酵包含右旋糖母液的碳源的发酵方法，所述右旋糖母液包含葡萄糖和一种或多种低聚糖，所述方法包括以下步骤：(a)形成包含所述碳源和所述微生物的初始发酵肉汤；(b)在适合于发酵所述葡萄糖的条件下发酵所述发酵肉汤；(c)向所述肉汤中添加有效量的至少一种能够使所述一种或多种低聚糖解聚的活性酶；以及(d)回收所述发酵产物。
附图简述
图1是示出根据实施例1的在酿酒酵母发酵后不同低聚糖(dp2、dp3和dp4+)的残余水平(g/l)的图。
图2是示出根据实施例2的在大肠杆菌发酵后不同低聚糖(dp2、dp3和dp4+)的残余水平(g)的图。
发明详述
本发明涉及一种用于发酵包含葡萄糖和一种或多种低聚糖的碳源的发酵方法，其中术语“低聚糖”是指通过醚键连接的单糖的低聚物(例如葡萄糖和/或果糖的低聚物)。聚合度通常将是约2至10(在本文中称为dp2至dp10低聚糖)。
碳源
在本发明的方法中使用的碳源包含右旋糖母液。如上所述，右旋糖母液(greens)(也称为“母液(motherliquor)”)是使用本领域中已知的任何方法(例如，通过结晶或色谱法)从淀粉水解产物中回收葡萄糖后所剩余的物质。淀粉水解产物本身可通过本领域中已知的方法(通常包括如上所述的液化和糖化)从任何合适的淀粉来源(如玉米、小麦、水稻、大麦、马铃薯、木薯等)产生。
葡萄糖母液通常具有基于总干物质含量，至少95重量％的碳水化合物含量。优选地，它们将具有至少97重量％、更优选至少98重量％、更优选至少99重量％的碳水化合物含量。它们通常将具有基于总碳水化合物(即，基于组合物中碳水化合物的总干重)，50重量％至90重量％的葡萄糖含量。优选地，它们将具有基于总碳水化合物，60重量％至85重量％、更优选70重量％至85重量％的葡萄糖含量，例如75重量％至85重量％的含量，并且在一些情况下80重量％至85重量％的含量。
除了葡萄糖之外，它们还将包含基于总碳水化合物，10重量％至50重量％的低聚糖。优选地，它们将包含15重量％至40重量％、更优选15重量％至30重量％、更优选15重量％-25重量％的低聚糖。低聚糖将主要是二糖和三糖。优选地，它们将选自由以下各项组成的组：异麦芽糖、麦芽糖、麦芽酮糖、潘糖以及其两种或更多种的混合物。更优选地，它们将包括这四种低聚糖中的每一种。当然，可以存在其他低聚糖，但通常仅以非常少量或痕量存在。
优选地，异麦芽糖、麦芽糖和潘糖中的每一种将以基于总碳水化合物至少2重量％的量存在于右旋糖母液中。更优选地，基于总碳水化合物，异麦芽糖和麦芽糖各自将以2重量％至10重量％、更优选2重量％至7重量％、更优选2重量％至5重量％、更优选3重量％至5重量％的量存在，并且潘糖将优选地以2重量％至8重量％、更优选3重量％至7重量％、更优选3重量％至5重量％的量存在。麦芽糖将优选地以基于总碳水化合物至少0.5重量％、更优选0.5重量％至10重量％、更优选1重量％至7重量％、更优选2重量％至5重量％的量存在，并且dp4+糖将优选地以基于总碳水化合物0重量％至5重量％、优选0.5重量％至4重量％、更优选1重量％至3重量％的量存在。
虽然碳源可包含其他碳水化合物(即来自除右旋糖母液以外的来源的额外葡萄糖和/或低聚糖-包括例如来自微生物接种物的残余糖)，但所述碳源将优选地包含至少90重量％、更优选95重量％、更优选97重量％、更优选98重量％、更优选99重量％的右旋糖母液。理想地，所述碳源将基本上由右旋糖母液组成。在任何情况下，所述碳源都将优选地包含基于总碳水化合物50重量％至90重量％的葡萄糖和10重量％至50重量％的低聚糖-其中优选的浓度是如上文针对右旋糖母液所描述。
发酵肉汤
碳源用于形成发酵肉汤，并且任选地在发酵过程中补充发酵肉汤(如下所述)。包含在发酵肉汤中的葡萄糖的最佳量将取决于微生物的类型和所使用的酶的类型，并且将由本领域技术人员容易地确定。作为举例，如果使用的微生物是大肠杆菌，则葡萄糖浓度可以是约30-40g/l；对于酵母属，200g/l或更高的浓度可以是可能的。
除了碳源之外，发酵肉汤通常还将包含水、氮源(如本领域中熟知的蛋白质、硫酸铵、氨、尿素或其他氮源)和其他维生素、盐和矿物质。它还可包含其他组分如缓冲剂，并且随着发酵进展，发酵产物和某些代谢物。
本领域技术人员将使用常用的常识来调整发酵肉汤的确切含量，以确保在整个发酵过程中使用的微生物的最佳生长。因此，所述肉汤还将包含能够将葡萄糖发酵成发酵产物的微生物。
微生物
将关于所需的发酵产物选择微生物。所述微生物可以是天然存在的(所谓的野生型)，或者所述微生物可以是突变体或重组体菌株。合适的微生物的实例包括各种真菌物种(如酵母属、曲霉属、克鲁维酵母属、青霉属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、毛孢子菌属、伊萨酵母属、yamadazyma、根霉属、耶氏酵母属、丛梗孢酵母属)、细菌(如乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、片球菌属、葡萄球菌属、明串珠菌属、链霉菌属、芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、埃希氏菌属、梭菌属、黄单胞菌属、假单胞菌属、醋酸杆菌属、葡糖杆菌属、发酵单胞菌属、克雷白氏杆菌属、肠杆菌属、栖热袍菌属(thermotoga)、短杆菌属、古龙酸菌属(ketogulonicigenium))、藻类以及古细菌。优选地，所述微生物将选自酿酒酵母(酿酒酵母)、东方伊萨酵母(也称为库德里阿兹威氏毕赤酵母(pichiakudriavzevii))和大肠杆菌(大肠杆菌)。
由于微生物通常不能代谢存在于右旋糖母液中的低聚糖，因此至少一种能够使一种或多种低聚糖解聚的活性酶将被添加至发酵肉汤中。
酶
所述酶可以是对于使具有1→4和/或1→6醚键的低聚糖解聚有效的任何酶。合适的酶包括葡糖淀粉酶(ec3.2.1.3)、转葡糖苷酶(ec2.4.1.24)、异麦芽糖酶(ec3.2.1.10)、α-葡糖苷酶(ec3.2.1.20)、支链淀粉酶(ec3.2.1.41)、异淀粉酶(ec3.2.1.68)以及其两种或更多种的混合物。优选的酶包括葡糖淀粉酶和转葡糖苷酶，或者甚至更优选两者的组合。确实出人意料地发现，虽然葡糖淀粉酶对于使存在于淀粉水解产物中最常见的dp2低聚糖(如麦芽糖)解聚非常有效，并且对于使右旋糖母液所特有的dp3和dp4+低聚糖解聚非常有效，但它对右旋糖母液所特有的dp2低聚糖，特别是异麦芽糖(1→6键中的2种葡萄糖)和异构麦芽糖(葡萄糖和1→4键中的果糖)仅具有有限作用。相比之下，已经发现转葡糖苷酶对于使右旋糖母液中存在的dp2和dp3低聚糖(如麦芽酮糖)解聚非常有效，对其dp4+低聚糖仅具有有限作用。如此，葡糖淀粉酶和转葡糖苷酶将有利地一起用于优化可供用于从右旋糖母液发酵的碳水化合物。所述酶可同时或顺序地添加。例如，可首先将葡糖淀粉酶添加至发酵肉汤中，然后添加转葡糖苷酶(例如，在已经通过发酵降低葡萄糖水平之后)。为了清楚起见，应注意，术语“转葡糖苷酶”和“α-葡糖苷酶”有时可在本领域中互换使用，因为转葡糖苷酶在某些条件下可表现出α-葡糖苷酶活性。
待使用的酶的量取决于所选择的酶、所选择的酶制剂、所需的反应速率和反应条件，包括存在于发酵肉汤中的低聚糖的浓度和类型。通常，所述酶以足以提供约5-10,000μl液体酶制剂/l发酵肉汤的量使用(应理解，液体酶制剂通常包含介于5重量％与20重量％之间的酶)。更优选的量是约10-1000μl/l且甚至更优选的量是约25-500μl/l(即每kg肉汤约1.5至115mg的酶的量)。
葡糖淀粉酶将优选以25-1500μl/l发酵肉汤的量、更优选以50-1000μl/l发酵肉汤的量、更优选以75-750μl/l发酵肉汤的量、更优选以100-500μl/l发酵肉汤的量、更优选以150-250μl/l发酵肉汤的量使用。
有利的是，转葡糖苷酶将以多于25μl/l、优选50μl/l或更多、更优选75μl/l或更多、更优选100μl/l或更多的量使用。例如，转葡糖苷酶可以100-1500μl/l发酵肉汤的量、优选以150-1000μl/l发酵肉汤的量、更优选以200-750μl/l发酵肉汤的量、更优选以250-500μl/l发酵肉汤的量使用。
当一起使用时，葡糖淀粉酶和转葡糖苷酶将有利地以2∶1至1∶2、更优选3∶2至2∶3、更优选大约1∶1的重量比存在。如上所述，葡糖淀粉酶和转葡糖苷酶可同时或顺序地使用。如果顺序使用，则葡糖淀粉酶优选地在转葡糖苷酶之前添加至发酵肉汤中。事实上，虽然转葡糖苷酶可能对高浓度的葡萄糖敏感，但对于葡糖淀粉酶来说并非同样如此。因此，通过首先添加葡糖淀粉酶，将不需要限制发酵肉汤中葡萄糖的浓度。然后可仅在葡萄糖浓度达到例如30g/l或更低时添加转葡糖苷酶。
这些浓度用于提供待添加到发酵肉汤中的酶的量的良好近似值，所述值通过实验观察进行评估以确定在使用条件(例如温度、ph以及对于给定发酵方法来说特定的其他条件)下所需的酶的实际量，以便以最低酶成本在最终发酵肉汤中获得所需浓度的残余低聚糖。
发酵产物
本发明的方法可用于生产可通过发酵获得的任何产物。这对于制备用于非食品应用中的发酵产物将特别有益。虽然可能是出人意料地，但是可存在于食物中的发酵过程的一些残余成分(例如残余低聚糖)对于非食物应用来说可能是有问题的。具体地说，它们可能通过引起与发酵培养基中的其他成分的不希望的反应(其进而可导致形成难以除去的杂质)或与发酵产物本身的不希望的反应(从而导致回收产量损失)而使发酵产物的分离、回收和纯化复杂化。
可能的发酵产物的实例包括氨基酸、有机酸、醇、二醇、多元醇、脂肪酸、单酰甘油、二酰甘油、三酰甘油、多糖(如黄原胶、硬葡聚糖和裂褶菌多糖(schizzophylan))、微生物生物质以及其混合物。优选的发酵产物包括有机酸、二醇、氨基酸及其盐。可根据本发明产生的有机酸的实例包括羟基羧酸、羟基多元羧酸、二羧酸、三羧酸以及其混合物。优选的有机酸包括乳酸、柠檬酸、丙二酸、羟基丁酸、己二酸、酮戊二酸、戊二酸、3-羟基-丙酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、衣康酸、粘康酸、甲基丙烯酸和乙酸连同它们的衍生物和盐。其他优选的发酵产物包括例如乙醇、丙二醇(pdo)和丁二醇(bdo)。其他可能的产物对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
方法
如以上所指出，本发明提供一种发酵方法，所述发酵方法包括以下步骤：
(a)形成包含碳源和微生物的初始发酵肉汤，其中所述碳源包含右旋糖母液；
(b)在适合于发酵葡萄糖的条件下发酵所述肉汤；
(c)向所述肉汤中添加有效量的至少一种能够使所述一种或多种低聚糖解聚的活性酶；以及
(d)回收所述发酵产物，
其中发酵肉汤、碳源、微生物、右旋糖母液、酶、低聚糖和发酵产物中的每一种都是如上文所定义；并且其中步骤(c)将优选地在步骤(b)期间进行或其中步骤(b)将优选地在步骤(c)之后继续。
这种方法将在允许发酵发生的条件下进行。这些条件将被熟练的技术人员很好地理解，并且可根据所使用的特定生物体和所需的发酵产物而变化。作为参考，典型的条件包括高于20℃、优选高于30℃、更优选约25℃至约50℃、更优选约30℃至约40℃(例如约35℃)的温度。另外，通常将发酵肉汤混合(例如通过将气体喷射到肉汤中，或者可替代地通过直接机械搅拌或其他方式)。通常将在生物反应器中进行发酵，所述生物反应器使得易于监测和控制这些条件。
优选地，将继续步骤(b)直到从发酵肉汤中耗尽基本上所有的可发酵糖(葡萄糖和低聚糖两者)。理想地，这意味着发酵将持续直到观察不到进一步的代谢活性或者直到发酵肉汤中的葡萄糖浓度达到小于5g/l、优选小于3g/l、更优选小于2g/l、更优选小于1g/l、更优选不超过约0.5g/l、更优选约0g/l。为了清楚起见，这意味着步骤(b)可与步骤(c)同时(并且在步骤(c)之后)继续。
尽管本发明的方法可以是分批方法(其中在发酵已经开始后不向发酵肉汤中添加任何物质并且产物仅在完成时回收)，但其也可以是补料分批方法(其中随着发酵进展，以增量添加营养物)或连续方法(其中在发酵过程中以连续方式将营养物添加至发酵肉汤中，并且从发酵肉汤中除去产物)。下文提供了此类方法的进一步细节。优选地，所述方法将是分批或分批补料方法。
例如，可能有可能用额外的可发酵糖补充发酵肉汤。因此，本发明的方法可包括向发酵肉汤中添加另外的葡萄糖的另外步骤(在开始添加酶之前、同时或之后)。额外的葡萄糖将优选以另外的右旋糖母液的形式递送，但也可以呈淀粉水解产物或葡萄糖糖浆的形式。它可在单个步骤中添加(“一次性”添加)，或者在一定时间段内逐渐(例如，以增量)添加。添加速率将由熟练的技术人员确定，以确保其与微生物的使用速度平衡。仅作为举例，它可以每小时1-10g葡萄糖的速率添加。有利的是，额外的葡萄糖将被添加到发酵肉汤中以维持发酵肉汤中所需的葡萄糖浓度。这可以是例如约1至约10g/l，更优选约1至约5g/l。
无论是否将另外的底物引入发酵肉汤中，本发明的方法都可以继续，例如，直到已经产生了所需量的发酵产物或直到微生物不再有效(高浓度的发酵产物可对微生物具有抑制作用)。或者，当添加额外的底物时，可从生物反应器中放出发酵肉汤(包括发酵产物)，从而允许发酵过程变得连续。
酶将优选地在允许同时葡萄糖发酵和低聚糖解聚的条件下添加。它可在单个添加步骤中添加，或者在一定时间内逐渐添加。例如，其添加可以在约3分钟至约3小时的时间内计量。它也可在整个发酵过程中以多个添加步骤添加。例如，可监测肉汤以测量低聚糖浓度和根据需要添加的额外酶以实现所需的解聚水平。
在某些条件下，已经观察到将解聚酶添加至高度浓缩的葡萄糖溶液(例如，葡萄糖浓度高于30g/l的发酵肉汤)可能使所述酶不太有效，并且甚至可能触发逆转或缩合反应(例如，形成而不是解聚低聚糖)。例如，对于转葡糖苷酶可能是这种情况。还已知的是许多酶具有有限的有效时间，并且因此稍后将酶添加至发酵肉汤可能有利于最佳利用其活性寿命。因此在不存在酶的情况下(或者在不存在对高葡萄糖浓度敏感的酶的情况下)开始发酵并且仅一旦在达到更有利的葡萄糖浓度时才加入它可能是有益的。这种葡萄糖浓度将有利地低于30g/l、优选低于25g/l、更优选低于20g/l、更优选低于15g/l。然而，也可能在开始发酵过程之前添加一些或所有的酶，即与添加碳源同时或在添加碳源之后立即添加。因此，以上步骤(c)也可在步骤(b)开始之前进行，并且为了清楚起见，本发明提供了一种方法，其中：
a)形成包含碳源和微生物的初始发酵肉汤，其中所述碳源包含右旋糖母液；
b)添加有效量的至少一种能够使存在于所述碳源中的一种或多种低聚糖解聚的活性酶；
c)在适合于发酵所述葡萄糖和解聚来自所述碳源的低聚糖的条件下发酵所述肉汤；以及
d)回收发酵产物。
本发明还提供了一种方法，其中：
a)形成包含碳源和微生物的初始发酵肉汤，其中所述碳源包含右旋糖母液；
b)添加有效量的第一种酶(如葡糖淀粉酶)；
c)将肉汤发酵直到达到低于30g/l的葡萄糖浓度；
d)添加有效量的第二种酶(如转葡糖苷酶)；
e)继续发酵；以及
f)回收发酵产物。
发酵产物如何回收将取决于待回收的发酵产物的性质。一般来说，通常经由过滤或离心步骤将微生物与发酵肉汤分离，并且然后将经由例如蒸馏、萃取、结晶、膜分离、渗透、反渗透、蒸发或本领域技术人员熟知的其他合适的方式来回收发酵产物。发酵产物可在发酵过程结束时或在发酵过程本身期间(例如以连续方法)回收。
有利地，本发明的方法允许从右旋糖母液获得提高的发酵产物产量，因为更多的碳源被转化为可发酵的糖。它还有助于发酵产物的回收，因为显著降低的低聚糖含量将有助于分离和纯化，并且在回收过程期间引起与发酵产物和发酵培养基中的其他组分的更少不希望的反应(由此确保最佳产率和更少的杂质)。
本发明的以上方面并非旨在穷举或将本发明限制于所公开的精确形式。相反，此描述的目的是使得可以促进本领域技术人员对本发明的原理和实践的了解和理解。现在将在以下非限制性实施例中进一步描述本发明。
实施例
●碳源
对高葡萄糖淀粉水解产物和右旋糖母液样品(使用具有双shodexkc-811(h+形式)的hplc-rid)，并且它们的近似碳水化合物组成在下文列出(以基于总碳水化合物的重量百分比计)：
对于高葡萄糖淀粉水解产物和右旋糖母液两者来说，dp1产品几乎都是葡萄糖。dp2产品主要是麦芽糖、异麦芽糖和麦芽酮糖(对于高葡萄糖淀粉水解产物各自约0.5％-1.0％，并且对于右旋糖母液各自约2.0％-3.5％)。对于高葡萄糖淀粉水解产物(约0.8％)和右旋糖母液(约3.5％-4％)两者，dp3产物大部分是潘糖。
●酶
对以下酶进行了测试：
*参见http：//www.brenda-enzymes.org/index.php
●微生物
在所述测试中使用了两种微生物：
1)酿酒酵母
2)大肠杆菌b菌株，经由补料分批发酵将葡萄糖转化成生物质和co2
实施例1：酿酒酵母发酵
摇瓶在32℃下使用，其中参考工作体积为0.2l。
●分批方法
-碳源(如上所述的c*sweetd02761或c*sweetd15080)：大约200g碳水化合物/kg，全部添加到初始发酵肉汤中
-氮源：酵母提取物和尿素
-酵母接种物
-开始时的ph：4.5(在分批方法过程中不受控制)
-在24和/或48小时后(当葡萄糖达到少于30g/l时)添加酶
-发酵持续直到72小时(完全耗尽可发酵糖)
为了评估这些酶的作用，在无酶的情况下、仅使用ga或tg以及使用ga和tg两者如下进行发酵：
ga以100μl/kg肉汤或0.56g/kg碳水化合物使用，并且tg以150μl/kg肉汤或0.85g/kg碳水化合物使用。
●测量
-在发酵过程完成时测量糖组成，其中每次发酵运行相同量的时间。通过使用双shodexkc-811(h+形式)柱和h2so4洗脱液的hplc-rid测量葡萄糖、果糖、dp2、dp3和dp4+(dp2、dp3和dp4+一起称为dp2+)。通过使用carbopacpa-20柱和naoh洗脱液的hpaec-pad测量麦芽糖、异麦芽糖、麦芽酮糖和潘糖。在采样后立即通过对样品进行热休克来淬灭酶和细菌活性；
-在发酵结束时测量乙醇滴度(使用双shodexkc-811(h+形式)柱和h2so4洗脱液的hplc-rid)；
-根据以下公式计算总碳水化合物上的乙醇产量：100×最终乙醇/总碳水化合物；
-根据以下公式计算估计的碳水化合物转化百分比(或“可发酵性”)：100×(总碳水化合物-残余dp2+)/总碳水化合物。
●结果
以上测量的结果显示在以下表中以及图1中(结果显示为对不同原料批次的重复试验的平均结果)：
结果表明，在不添加酶的情况下，来自右旋糖母液的可发酵性和乙醇产量远低于高葡萄糖淀粉水解产物。然而，添加ga或tg允许获得相当的可发酵性和产量。更出人意料地，发现将ga和tg同时添加到同一发酵罐中不仅现实可比较、而且更好的可发酵性和产量。这种改进与残余低聚糖(dp2+)的水平降低有关。ga添加使得残余麦芽糖、潘糖和dp4+浓度大量降低，而tg添加降低残余麦芽糖、异麦芽糖、麦芽酮糖和潘糖水平。添加这两种酶允许降低最终发酵肉汤中的麦芽糖、异麦芽糖、麦芽酮糖、潘糖和dp4+水平。
实施例2：大肠杆菌发酵
发酵罐设置在37℃，参考工作体积为1.3l。
●补料分批方法
阶段1：
-碳源(如上所述的c*sweetd02761或c*sweetd15080，稀释于水中)
-氮源：硫酸铵和氨(ph也控制在6.0)
-盐、矿物质
-细菌接种物
阶段2：
-在48小时期间线性无菌添加额外的碳源(如上所述的高葡萄糖淀粉水解产物或右旋糖母液，稀释于水中)，从批次中初始碳源耗尽开始
-单次添加酶，对于阶段2开始添加碳源使同时添加
-持续直到可发酵糖完全耗尽(不再有代谢活性)
a对于c*sweetd15080和b对于c*sweetd02761
为了评估当在右旋糖母液发酵时酶的作用，在没有酶的情况下、仅使用ga或tg以及使用ga和tg两者如下进行发酵(其中“低”＝0.25ml/l最终肉汤或1.0g/kg糖浆，并且“高”＝1ml/l最终肉汤或4.1g/kg糖浆)：
●测量
-在发酵过程完成时测量糖组成，其中每次发酵运行相同量的时间。通过使用双shodexkc-811(h+形式)柱和h2so4洗脱液的hplc-rid测量葡萄糖、果糖、dp2、dp3和dp4+(dp2、dp3和dp4+一起称为dp2+)。通过使用carbopacpa-20柱和naoh洗脱液的hpaec-pad测量麦芽糖、异麦芽糖、麦芽酮糖和潘糖。在采样后立即通过对样品进行热休克来淬灭酶和细菌活性；
-根据以下公式计算估计的碳水化合物转化百分比(或“可发酵性”)：100×(总碳水化合物-残余dp2+)/总碳水化合物。
●结果
以上测量的结果显示在以下表中以及图2中(结果显示为对不同原料批次的重复试验的平均结果)：
如可从这些结果看出，与高葡萄糖淀粉水解产物相比，当在不存在酶的情况下发酵右旋糖母液时，在发酵结束时保留显著更多(低聚)糖(即导致碳水化合物浪费和可能的下游加工复杂化)。添加酶减少了这种浪费。ga本身产生潘糖和dp4+的强烈减少以及异麦芽糖和麦芽酮糖的适度减少。tg本身产生异麦芽糖、麦芽酮糖和潘糖的强烈减少以及dp4+的适度减少。ga和tg一起使异麦芽糖、麦芽酮糖、潘糖和dp4+强烈减少，甚至达到低于对于高葡萄糖淀粉水解产物来说所获得的那些的水平。还观察到高酶剂量产生更强的低聚糖水平降低。
可发酵性结果证实，当在酶存在下发酵时右旋糖母液的可发酵性增加，并且当使用tg和ga两者的组合时可获得高于用高葡萄糖淀粉水解产物获得的可发酵性水平。